一種抗腫瘤組合物及其製備方法和應用與流程
2024-03-26 19:23:05
本發明屬於抗腫瘤藥物技術領域,尤其涉及一種利用極耐熱糖苷酶製備的抗腫瘤組合物及其製備方法和應用。
背景技術:
三七為五加科人參屬植物,是我國名貴中藥材,根莖入藥,有散瘀止血,消腫止痛的功能。皂苷是三七的主要有效成分,迄今為止,已從三七的不同部位分離得到70餘種單體皂苷,包括人參皂苷rb1、rd、re、rg1和三七皂苷r1等。其中,人參皂苷rb1、rg1和三七皂苷r1為三七總皂苷的主要成分。這三種成分在抗疲勞、維持血液循環、改善心肌缺血、抗心律失常、鎮靜、抗衰老及抗腫瘤等方面均顯示出一定的藥理作用。
三七總皂苷的抗腫瘤作用具有高效、低毒、多靶點等特點。其中,人參皂苷rb1具有抗疲勞、舒張血管、提高免疫力等活性;人參皂苷rg1具有抗衰老、防止動脈粥樣硬化、提高免疫力等活性;三七皂苷r1具有心血管保護、神經保護、改善微循環等活性;人參皂苷rg3對肝癌、結腸癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤、白血病等具有顯著的抑制作用,並且大量研究表明,rg3是最具開發潛力的人參皂苷類抗腫瘤化合物;人參皂苷rh1對肝癌、結腸癌、神經膠質瘤、卵巢癌、白血病等具有抑制作用;人參皂苷ck對肺癌、膀胱癌、慢性粒細胞白血病、胃癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、大腸癌、脊髓瘤、結腸癌等具有抑制作用。經不同的糖苷酶水解,人參皂苷和三七皂苷可以轉化為其相同母核的不同糖苷形式。因此,可以以功能為導向,定向水解三七皂苷主要成分母核的糖苷,製備抗腫瘤活性更強的三七皂苷提取物精深加工產品。
對於皂苷類物質的轉化,有化學轉化法和生物轉化法。化學轉化法因其反應劇烈、選擇性差、副產物多等缺點而不被採用。生物轉化具有反應條件溫和,特異性好、分離純化容易等特點,而受到青睞。由於三七總皂苷成分中主要包含葡萄糖苷(rb1,rg1和r1等),因此,通過篩選葡萄糖苷酶有望實現三七總皂苷的去糖基轉化。目前皂苷類物質的生物轉化主要有微生物轉化法和酶轉化法,但還存在以下缺點:(1)通常是針對某一種皂苷進行微生物或酶的轉化,還沒有通過一種生物酶同時定向水解三七皂苷中富含的數種皂苷;(2)還沒有以抗腫瘤的功能為導向,製備抗腫瘤活性更強的三七皂苷提取物的精深加工產品。(3)採用的生物酶活力、專一性、酶學特性還不能適應規模化、低成本的實際應用。因此,以功能為導向,利用酶學特性優異的生物酶對三七皂苷提取物進行精深加工意義重大,將顯著提升三七及其提取物的附加值,拓寬和增強三七及其提取物在抗腫瘤方面的應用。
技術實現要素:
解決的技術問題:針對上述現有技術缺陷和空白,本發明提供了一種抗腫瘤組合物及其製備方法和應用。
技術方案:一種抗腫瘤組合物,由β-葡萄糖苷酶降解三七總皂苷提取物而得。
上述β-葡萄糖苷酶來源於黑麴黴、裡氏木黴、嗜熱菌來源的微生物及其基因重組菌。
β-葡萄糖苷酶降解三七總皂苷提取物的轉化條件為:底物濃度0.05-50mg/ml,β-葡萄糖苷酶用量為1~50u/mg,反應溫度為30~95℃,反應2~4h。
上述抗腫瘤組合物在製備治療乳腺癌、肺癌、結腸癌或肝癌藥物中的應用。
一種抗癌藥物,有效成分為上述的抗腫瘤組合物。
有益效果:本發明提供了一種反應條件溫和、副產物少、工藝操作簡單的三七總皂苷精深加工的生物製備方法,產品成分明確、質量可控。創製了一種抗腫瘤功效顯著的三七總皂苷精深加工產品。本發明的三七總皂苷轉化物對乳腺癌、肝癌、結腸癌、肺癌等腫瘤增殖的抑制作用明顯優於三七總皂苷提取物。
附圖說明
圖1:三七皂苷r1結構式圖;
圖2:人參皂苷rb1、rg1、20-rg3、rh1結構式圖;
圖3:三七總皂苷提取物hplc圖譜;
圖4:三七總皂苷提取物轉化產物的hplc圖譜;
圖5:三七總皂苷轉化前後抗腫瘤活性比較圖;
圖6:三七總皂苷轉化產物促進腫瘤細胞的凋亡圖;
圖7:三七總皂苷轉化產物抑制akt的磷酸化圖。
具體實施方式
下面結合附圖及具體實施例,進一步闡述本發明。應理解,這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法,通常按照常規條件,或按照製造廠商所建議的條件。
本發明的目的在於提供一種提高三七總皂苷抗腫瘤活性的生物酶轉化法,該方法將β-葡萄糖苷酶用於三七總皂苷中數種主要皂苷的去糖基轉化,提高三七總皂苷對乳腺癌、肝癌、結腸癌和肺癌的增殖抑制作用。
本發明分為三步:篩選、利用特異性強、酶學特性優異的葡萄糖苷酶同時定向水解三七總皂苷提取物;優化、建立適宜的以功能為導向的產品製備工藝;將轉化產品應用於腫瘤細胞的抑制。
本發明選用的β-葡萄糖苷酶能將人參皂苷rb1、rg1和三七總皂苷r1完全轉化(利用的三七總皂苷材料中,人參皂苷rb1的含量為30~45%,rg1的含量為35~47%,三七皂苷r1含量為10%左右。)在本發明的實施例中,三七總皂苷純度為98wt.%以上,其中人參皂苷rb1含量為38.7wt.%,rg1含量為40.5wt.%,三七皂苷r1含量為10.7wt.%。
本發明的三七總皂苷的轉化條件為:底物濃度0.05-50mg/ml,β-葡萄糖苷酶用量為1~50u/mg,反應溫度為30~95℃,反應2~4h的情況下,rb1、rg1和r1的轉化率分別為90~100%、60~100%、70~100%。
在本發明的實施例中,三七總皂苷的劑量設置如下:50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml,300μg/ml,400μg/ml,600μg/ml,700μg/ml,800μg/ml。
在本發明實施例中,經葡萄糖苷酶轉化後,三七總皂苷的抗腫瘤活性得到顯著提高;三七總皂苷的轉化產物能夠誘導腫瘤細胞凋亡,並導致caspase3的剪切;另外,三七總皂苷的轉化產物能夠抑制akt的磷酸化,進而阻斷akt相關增殖信號通路的活化。
下面結合附圖及具體實施例對本發明的應用原理作進一步描述。
實施例1:
1.實驗目的
比較不同來源β-葡萄糖苷酶對三七總皂苷的轉化情況,篩選出特異性強、酶學特性優異、同時定向水解三七總皂苷提取物中三種主要皂苷,並能顯著提升轉化產品抗腫瘤活性的β-葡萄糖苷酶。
2.實驗材料
2.1受試藥品
三七總皂苷:純度≥98%,購於成都曼思特生物科技有限公司.
2.2重組葡萄糖苷酶(均為本實驗室構建的三種不同來源的β-葡萄糖苷酶)
gh3thermotogapetrophilarku-1(下面簡稱tpebgl3);
gh3thermotogathermarumdsm5069;
gh3aspergillusnigernl-1。
2.3細胞
小鼠乳腺癌細胞4t1,人乳腺癌細胞mcf-7,小鼠結腸癌細胞ct26,人肝癌細胞hepg2,人肺癌細胞a549均購於中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。選用dmem(含10%胎牛血清)培養基,於37℃、5%co2條件下培養。
3.實驗方案
3.1糖苷酶的製備
3.1.1原核表達體系構建
將重組基因工程菌劃線於lb平板(kan或amp抗性)上進行活化,37℃培養1d,至長出單菌落後接種於4mllb液體培養基中,於37℃,180r/min搖床培養8h,接種至150mllb液體培養基中於30℃,180r/min搖床培養,10h後離心收集菌體。
3.1.3重組酶的純化
a.樣品收集
(1)收集菌體,在5000×g,4℃離心20min,收集細胞;
(2)用30ml,ph7.5,tebuffer重懸細胞,在按上步驟離心;
(3)用4ml1×bindingbuffer重懸細胞,再用超聲波破碎;
(4)再加8ml的1×bindingbuffer,在12000×g離心10min,取上清。
嗜熱菌來源的糖苷酶預處理:將菌體離心回收,加入50ml1×bindingbuffer重懸,超聲波破碎,隨後80℃熱處理30min,對蛋白進行初步純化。
b.裝柱
(1)用適量無菌水洗鎳柱;
(2)用適量的1×chargingbuffer洗柱子;
(3)用適量1×bindingbuffer洗柱子。.
c.上樣
(1)將含有目的蛋白的樣品液過膜後上樣;
(2)用10mm咪唑緩衝液平衡柱子;
(3)用不同濃度咪唑緩衝液進行梯度洗脫,分段收集洗脫液,留下目的蛋白較純的部分。
d.清洗
(1)用適量1×stripbuffer洗柱子;
(2)用適量無菌水洗柱子;
(3)加入適量無菌水,蓋上上下帽蓋。
對於嗜熱菌來源的通過熱處理和鎳柱兩步純化,獲得電泳純重組蛋白,比酶活提高了6.1倍,得率為50%。
3.2三七總皂苷的轉化產物製備
取500mg三七總皂苷,溶於3ml蒸餾水中,加入5mltpebgl3酶(100u/ml)於85℃水浴中反應2h。
稱取預處理好的hpd400樹脂20g,溼法裝填於直徑10mm,高300mm的吸附柱。將三七總皂苷溶液稀釋到10mg/ml,過濾去掉沉澱物,得到上柱液。然後以每1ml/min的速度上柱,再分別用蒸餾水洗滌和50ml80%乙醇洗脫。洗脫液經濃縮後,乾燥得到產品。
3.3體外抗腫瘤活性檢測
在96孔板中每孔接種3000個細胞,放入37℃培養,待細胞貼壁6h後,每孔加入不同濃度的三七總皂苷培養72h,於實驗終點前4h向每孔加入20μlmtt(4mg/ml),實驗終點時取出96孔板,於1000×g離心,然後吸去上清,加入200μldmso,570nm處測吸光值。根據以下公式計算待測樣品對腫瘤細胞體外增殖的抑制率:
抑制率=[100-(od570(實驗孔)-od570(空白對照))/(od(不加藥對照空)-od570(空白對照)×100]%
4.實驗結果
4.1三七總皂苷主要有效成分的含量
參照2015版《中國藥典》中三七總皂苷的含量測定方法,分別檢測並計算三七總皂苷中各主要成分含量,人參皂苷rb1、rg1和三七皂苷r1的含量分別為38.7%,40.5%和10.7%三七總皂苷提取物原料hplc圖譜如圖3所示。
4.2三七總皂苷經葡萄糖苷酶tpebgl3轉化後成分的變化
選取本實驗室構建的三種性能優良的3種葡萄糖苷酶分別對三七總皂苷進行轉化,結果顯示葡萄糖苷酶tpebgl3(基因來源於gh3thermotogapetrophilarku-1的大腸桿菌重組菌)的轉化效果最好,rb1、rg1和r1能被完全轉化。轉化前樣品、經tpebgl3轉化後產物hplc圖譜分別見圖3、圖4.
4.3三七總皂苷經葡萄糖苷酶tpebgl3轉化後抗腫瘤活性的變化
按照上述方法,對500mg三七總皂苷進行轉化,獲得轉化產物。分別比較三七總皂苷經酶轉化前後的體外抗腫瘤活性,結果如圖5所示。三七總皂苷對小鼠乳腺癌細胞4t1、人乳腺癌細胞mcf-7、小鼠結腸癌細胞ct26、肝癌hepg2和肺癌細胞a549的ic50分別為204μg/ml、681μg/ml、258μg/ml、334μg/ml和>1600μg/ml。三七總皂苷經tpebgl3轉化後,對4t1、mcf-7、ct26、hepg2和a549細胞的ic50分別為132μg/ml、243μg/ml、166μg/ml、251μg/ml和681μg/ml,均顯著低於未經酶轉化的結果。其中,三七總皂苷本身並未顯示出對a549細胞的抑制作用,而經酶轉化後,在800μg/ml的劑量下對a549細胞的體外增殖抑制率可達94.5%。
實施例2
1.實驗目的
三七總皂苷轉化產物作用腫瘤細胞的凋亡檢測及免疫印跡分析
2.實驗材料
2.1受試藥品
實施例1中提到的三七總皂苷經葡萄糖苷酶tpebgl3處理後的轉化產物。
2.2細胞
小鼠乳腺癌細胞4t1,培養方法見實施例1中2.3。
3.實驗方案
3.1凋亡檢測
細胞(約1×106個)懸液轉入流式細胞儀管,4℃,1000rpm離心5min,收集細胞。棄上清後,加入200μlbindingbuffer(10mmhepes,ph7.4,140mmnacl,2.5mmcacl2),混勻後分別加入1.25μlannexinv溶液(1μg/ml)和2μlpi溶液(碘化丙啶,100μg/mlpi,20mmhepes,ph7.4),室溫避光共孵20min後再加入300μlbindingbuffer,用流式細胞儀測定fl-1和fl-3通道的螢光,數據收集使用cellquest軟體(bdimmunocytometrysystems),數據分析使用flowjo軟體。
3.2免疫印跡分析(westernblotting)
取細胞(約1×106個)用150μl的裂解液(10mmhepes,2mmedta,0.1%chaps,5mmdtt和1mmpmsf)裂解。冰浴0.5h,離心12000g,2min,4℃,取上清。用bcatm蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。根據製備10%的sds-page膠,以50μg的蛋白量上樣,4℃低溫下電泳,恆定電流20ma,時間為1h。電泳結束後,用溼轉法將膠上的蛋白轉至pvdf膜。轉移完後,將膜放在blockingbuffer(2%freefatmilk,10mmtris-cl,50mmnacl,0.1%tween20,ph7.4)中室溫孵育2h封閉pvdf膜上沒有蛋白的區域,根據蛋白預染ladder的指示位置將膜剪成所需大小,與所需的一抗在4℃轉爐上孵育過夜。次日將膜放在washingbuffer(10mmtris-cl,50mmnacl,0.1%tween20,ph7.4)中輕輕振蕩洗滌三次,第一、二次5min,第三次10min,去除非特異性結合的一抗。然後與適當稀釋的二抗共孵,室溫1.5h。最後,用washingbuffer洗滌膜去除非特異性結合的二抗,與底物共孵適當的時間,通過化學成像儀曝光並拍照。
4.實驗結果
4.1三七總皂苷轉化產物能夠誘導腫瘤細胞凋亡
凋亡是清除腫瘤細胞的一個主要機制,它不會給正常的細胞或周邊組織帶來損傷。為了探究三七總皂苷轉化產物的抗腫瘤作用機制,我們通過annexinv和pi雙染的方法,考察三七總皂苷轉化產物對乳腺癌細胞4t1的促凋亡作用。結果如圖6所示,三七總皂苷轉化產物能夠時間和劑量依賴性地誘導腫瘤細胞的凋亡,在200μg/ml的濃度下與4t1細胞共孵48h導致47%的細胞凋亡。同時,我們考察了三七總皂苷轉化產物與4t1共孵24h後與凋亡啟動相關蛋白的表達情況,結果顯示,三七總皂苷轉化產物能夠導致caspase3的剪切。
4.2三七總皂苷轉化產物能夠抑制akt的磷酸化
pi3k/akt信號通路是人類腫瘤,包括乳腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌等中,最常見的被活化的通路,可以造成凋亡抵抗。激酶akt的473位絲氨酸(ser)的磷酸化對於akt最大程度的活化是必須的。akt不僅可以抑制凋亡,也是促進增殖信號的關鍵分子。如圖7所示,通過考察,我們發現,三七總皂苷的轉化產物能夠抑制akt的磷酸化,因此,其抗腫瘤活性可能是通過對akt通路的阻斷作用實現的。
結論
本發明實施例公開了一種葡萄糖苷酶在提高三七總皂苷抗腫瘤活性的生物催化轉化中的應用。該酶在水相體系,底物濃度為10mg/ml,葡萄糖苷酶用量為1~10u/ml,溫度為85℃,反應2~4h後,可讓三七總皂苷中的rb1、rg1和r1等物質實現轉化。三七總皂苷轉化產物在rb1、rg1和r1的轉化率為100%的情況下,對小鼠乳腺癌細胞4t1、人乳腺癌細胞mcf-7、小鼠結腸癌細胞ct26、肝癌hepg2和肺癌細胞a549的ic50分別為132μg/ml、243μg/ml、166μg/ml、251μg/ml和681μg/ml,均顯著低於未經酶轉化的三七總皂苷。三七總皂苷的轉化產物能夠誘導腫瘤細胞的凋亡,導致caspase3的剪切,可以抑制akt的磷酸化,進而抑制akt相關增殖信號通路的活化,最終實現對腫瘤的抑制作用。本發明提供的三七總皂苷酶轉化技術操作簡單,有利於三七總皂苷在抗腫瘤防治上的推廣與應用,同時為三七總皂苷在抗疲勞、防治心腦血管等疾病中的應用提供了一種方法。
以上僅為本發明的較佳實施例而已,並不用以限制本發明,凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等,均應包含在本發明的保護範圍之內。