一種十二肽、含有該十二肽的複合物，其製備方法及在製備肝癌治療藥物中的應用的製作方法
2024-03-26 04:07:05
專利名稱：一種十二肽、含有該十二肽的複合物，其製備方法及在製備肝癌治療藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種多肽、含有該十二肽的複合物，還涉及其製備方法及其在製備肝癌導向治療藥物中的應用。
背景技術：
肝細胞癌(HCC)是最常見、也是最致命的惡性腫瘤之一，素有「癌王」之稱，其特點是發病隱匿、轉移早，病死率高。
肝癌的傳統治療以手術切除和化療為主。手術徹底切除提供了最佳治癒機會，是目前治療肝癌的首選方法，然而對於多數腫瘤來說，在檢出時已經太大或太彌散，75％以上已無法切除。雖然放療方面採用了「γ射線或電子直線加速器的X射線、高能射線等，化療方面改進了傳統給藥途徑，但對於無法切除的原發性肝癌不是很敏感，加之其對機體免疫系統的破壞，治療後患者平均生存僅4個月，很少超過9個月。
針對傳統的化療和放療對於不能實行切除術的病人來說最主要的限制是全身性毒性和藥物水平達不到有效濃度，導向治療因其高選擇性和高親和性對於治療不能手術的患者或廣泛轉移的腫瘤有很好的應用前景。目前肝癌導向治療是利用一種對肝癌有特殊親和力的抗體作載體，與有殺傷腫瘤作用的彈頭(超抗原、化療藥物、生物毒素蛋白放射性核素)製成交連物，以達到較多殺傷腫瘤而減少損害正常組織的目的。陳志南等用131I標記的肝癌單抗Hepama-1通過肝內動脈注入23例患者，取得了較好的療效，75％(12/16)的病人AFP值下降，78％(18/23)的病人瘤塊縮小。II期臨床研究結果表明完全緩解率4.1％，部分完全緩解率為53.1％，兩年以上生存率為46.2％。
儘管抗體導向治療是最活躍的治癌策略之一，但存在的一些問題限制了它們的實際應用效果。目前針對肝癌的治療抗體是鼠源性的，應用於人體，易出現人抗鼠抗體(HAMA)，在131I-Hepama-1的治療過程中，43％(10/23)的病人產生了針對Hepama-1抗體。顯然，HAMA限制了多次注射，長期治療無法進行。此外抗體的分子量大，滲透力差，不易穿透腫瘤毛細血管也是導致肝癌導向治療效果不佳的主要原因。小分子抗體具有免疫原性低、易於滲透目標組織、毒副作用小、易與效應分子相連構成新功能的抗體分子等優點，不斷開展從單鏈抗體、單域抗體、獨立性重鏈可變區、最小識別單位(MRU)等抗體片段的研究工作，但這些抗體片段與親本抗體相比，抗原結合活性存在不同程度的下降，且分子量仍然較大，以單鏈抗體為例，分子量仍然達到30Kda左右，對實體腫瘤穿透能力較差。
由於噬菌體肽庫中含有所有可能的胺基酸排列，因而庫容量極大，易於篩選和擴增。通過親合篩選，有可能得到較高特異性和親和力的新型目的多肽，用於肝癌的導向治療。目前未見採用多肽對肝癌實行導向治療的文獻報導。
發明內容
為克服當前肝癌治療的不足，本發明目的是尋找一種與肝癌細胞特異結合併具有高親合力的小分子多肽分子。
本發明通過噬菌體展示肽庫篩選獲得了一種能與肝癌細胞特異性結合的12肽，其胺基酸序列如序列表中序列1所示。
本發明還公開了編碼上述十二肽的一種核苷酸序列，如序列表中序列2所示。
利用本發明的十二肽可以製備含有該十二肽的肝癌導向治療複合物。其中十二肽作為生物導向治療的「導航系統」，「彈頭」可採用化療藥物、超抗原或其它生物毒素分子或化療藥物，兩者可通過化學交鏈或基因融合的方式結合。本發明提供的十二肽與超抗原通過基因融合的方式結合，可以方便製備十二肽與超抗原的融合蛋白。超抗原可以是來源於葡萄球菌和鏈球菌的超抗原，例如葡萄球菌中毒性休克毒素TSST-1、葡萄球菌腸毒素SEA、SEB、SEC、SED和SEE等，鏈球菌致熱外毒素A、B、C等。其它生物毒素分子可以是綠膿桿菌外毒素PEA、白喉毒素DT等。在以上「彈頭」分子中，優選葡萄球菌中毒性休克毒素TSST-1，因為在上述「彈頭」分子中，TSST-1分子量最小，且具有較其它葡萄球菌毒素分子更強的超抗原活性，因而適合作為12肽靶向的「彈頭」。
本發明的十二肽的肝癌導向治療複合物可以通過基因工程方法或化學交鏈方法製備。通過基因工程方法製備時，一般需要經過以下步驟PCR法製備12肽與「彈頭」分子的融合基因；連入表達載體；融合蛋白表達及純化。通過PCR擴增，將上述十二肽的核苷酸序列與「彈頭」分子基因連接，然後進行表達。本發明將十二肽與中毒性休克毒素(TSST-1)基因通過PCR法融合，在上遊引物中引入12肽序列，12肽序列與TSST-1之間採用連接肽Gly-Gly-Ser，構建含有十二肽的肝癌導向治療複合物。然後與表達載體連接，構建重組表達質粒。經誘導、表達、純化後，獲得了特異的目的蛋白，為可溶性表達，表達蛋白經純化後，經實驗證實含有該多肽的融合蛋白可與肝癌細胞特異結合，體外實驗該融合蛋白可以抑制人肝癌細胞的增殖，小鼠肝癌移植瘤試驗證實融合蛋白與單獨TSST-1組相比，毒性降低，療效提高，起到減毒增效作用，證實該多肽對肝癌細胞具有導向作用。該12肽序列與TSST-1的融合蛋白的分子量只有24Kda左右，是當前分子量最小的靶向超抗原分子。
本發明採用全新的導向治療思路，公開了與肝癌細胞特異結合併具高親和力的十二肽，可以作為「導航系統」，該十二肽分子量小，與正常肝細胞不結合。體內外試驗證實了該十二肽與含有該肽的融合蛋白的導向作用，為肝癌進一步的免疫治療提供了理論依據，有可能成為潛在的肝癌導向治療藥物。
圖1陽性轉化子篩選鑑定結果，擴增片斷大小約750bp圖2重組質粒酶切鑑定結果，其中1、3為載體質粒酶切結果，2為未酶切的載體質粒對照圖312肽-TSST-1重組蛋白純化圖譜圖412肽-TSST-1重組蛋白產物表達與純化產物SDS-PAGE分析圖512肽-TSST-1重組蛋白與Hab25SCFV-TSST-1的肝癌細胞結合活性比較圖612肽-TSST-1重組蛋白的肝癌細胞殺傷活性，起始濃度為10倍系列稀釋。
圖7各組腫瘤體積變化趨勢圖。
具體實施例方式
實施例一含有高親和力短肽與中毒性休克毒素基因的原核表達質粒的構建和表達一、材料1.菌株大腸桿菌DH5α，原核表達載體PBV220由國內中國預防醫學科學院病毒所構建。
2.主要試劑限制性內切酶，異丙基-β-D-硫代半乳糖糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷(X-gal)，T4DNA ligase購自大連寶生物公司；Taq聚合酶，dNTP等PCR試劑購自上海生工；胰蛋白腖(Bacto trypton)，酵母浸出粉(Bacto yeast-extract)購自Difco公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，丙烯醯胺，N，N-亞甲基雙丙烯醯胺購自Amersham公司；瓊脂糖購自Gibco公司；其他試劑均為分析純；3.主要溶液3.1LB液體和固體培養基二、方法1、引物的設計與合成通過linker(Gly-Gly-Ser)，將通過噬菌體篩選獲得的與肝癌特異結合的短肽核酸序列與TSST-1(中毒性休克毒素)相偶聯含有線狀12肽特異性短肽序列的上遊引物序列參見序列表中序列3，含有EcoRI酶切位點；下遊引物見序列表中序列4，含有HindIII酶切位點，引物由上海博亞生物技術有限公司合成。
2、PCR反應以金黃色葡萄球菌FRI 1169DNA為模板(為產TSST-1標準株)，通過PCR反應構建12肽與TSST-1的融合基因。
PCR反應體系(50μL)H2O 39μl，10xPCR buffer 5μl，dNTP 2μl，引物2μl，Taq 1μl，模板1μl。
PCR反應參數96℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，72℃延伸10min。PCR反應產物的回收按照常規方法進行。
3、目的DNA與T載體的連接、轉化將回收的PCR反應產物與PMD-18T vector進行連接，連接反應物組成為P1 4μl，PMD-18T載體1μl，Solution I 5μl。16℃連接2小時。
感受態細胞的製備，連接產物轉化按常規方法進行。
挑取陽性菌落，進行PCR擴增，PCR產物經1％瓊脂糖電泳觀察，陽性克隆進行測序，並提取陽性克隆質粒。
4.重組表達質粒的構建將篩選出的陽性克隆質粒經測序證實後用限制性內切酶進行酶切，與同種酶切的原核表達載體PBV220連接。酶切反應組成為10×buffer 2μl，EcoRI2μl，HindIII 2μl，Vector Plasmid 14μl。37℃消化4小時。酶切結束後，用常規方法進行連接轉化。鑑定重組質粒，挑取單菌落，進行體積為25μL的PCR鑑定；並提取陽性菌落質粒做酶切鑑定。確認為陽性的進行誘導表達。
5.誘導表達及SDS-PAGE電泳鑑定5.1對PBV220與目的片段的重組表達質粒進行溫度誘導挑取陽性克隆單菌落，過夜培養。次日以1∶100轉接於5mL LB(含200mg/mL氨苄青黴素)，30℃，250rpm培養至對數期後，立即升溫至42℃培養4小時。
取培養好的菌液1.5mL，以8000rpm室溫離心5分鐘集菌，棄上清，200μL純水懸起沉澱，取25μL懸浮液加入25μL2×SDS凝膠加樣緩衝液，煮沸10分鐘，取20μL進行SDS-PAGE分析。
三、結果1.多肽與野生型TSST-1基因的融合通過Linker(Gly-Gly-Ser)，將特異性短肽核酸序列(線狀12肽)與野生型TSST-1相耦聯，經T載體藍白斑篩選和酶切鑑定陽性克隆，然後均亞克隆入表達載體PBV220進行表達。PCR和酶切鑑定圖譜見圖1、2。
2.重組蛋白的非融合表達採用溫度誘導表達，即細菌30℃培養至對數期，立即升溫至42℃，培養4小時，SDS-PAGE鑑定表達情況，12肽耦聯TSST-1在大腸桿菌中獲得了表達(見圖4)。
實施例二十二肽與TSST-1基因融合蛋白的純化鑑定及與活性檢測一、材料細胞系肝細胞癌SMMC7721，BEL-7402，正常肝細胞系HL-02。
工程菌可高效表達12肽耦聯TSST-1的大腸桿菌(實施例一構建)ACTA FPLC蛋白純化系統、純化柱CM-Sepharose FF系AMESHAM產品。anti-TSST-1抗體為SIGMA公司產品、HRP標記二抗(羊抗兔抗體)二、方法1.表達蛋白的純化按前述條件，大量誘導工程菌，表達的蛋白均在破碎上清中，這就使蛋白純化較為簡便，進一步稀釋後，上樣，並收集穿透液；表達產物在上清中，其純化採用CM柱純化法，純化圖譜和純化後SDS-PAGE鑑定圖譜見圖三和圖四。純化方法參見「姜永強等，葡萄球菌B型腸毒素的製備與抗腫瘤活性分析，細胞與分子免疫學雜誌，2002，18(3)」2.融合蛋白的ELISA及競爭ELISA鑑定2.1重組表達蛋白的ELISA鑑定取封閉好的細胞培養板，於前一晚上進行封閉，次日棄封閉液，以0.5％PBST洗滌5次，每次間隔5分鐘；加入梯度稀釋的純化蛋白溶液，室溫靜置1小時；棄未結合蛋白，以0.5％PBST洗滌5次，每次間隔5分鐘；加入200μL anti-TSST-1抗體(1∶500稀釋)，室溫靜置1小時；棄未結合抗體，以0.5％PBST洗滌5次，每次間隔5分鐘；加入HRP標記二抗(羊抗兔抗體，以1∶1000稀釋)，每孔200μL，室溫靜置1小時；棄二抗，以0.5％PBST洗滌5次，每次間隔5分鐘；加入TMB顯色液，待充分顯色後，加入2N H2SO4終止反應，於450nm讀值。
2.2重組表達蛋白與dsFv-TSST-1的競爭ELISA鑑定本室構建的單鏈抗體靶向TSST-1融合蛋白(ScFv-TSST-1)，與肝癌細胞有著較好的親和性和特異性，通過重組表達蛋白與dsFv-TSST-1的競爭比較，可以反應12肽TSST-1重組蛋白的特異性和親和力。將SCFv-TSST-1復性蛋白做梯度稀釋，分別與重組蛋白混合，測A450nm的變化。
3、重組表達蛋白的體外腫瘤細胞殺傷活性重組表達蛋白細胞殺傷活性檢測採用MTS assay kit(CellTiter 96TMAQUEOUS，Promega)進行測定。具體方法為，100μl含5×103個SMMC-7721肝癌細胞(靶細胞)的RPMI1640完全培養基中加入80μl用不含血清的RPMI1640培養基稀釋的人外周血淋巴細胞(效應細胞)，效靶比為20∶1，然後每孔加入20μl梯度稀釋的樣品，37℃含5％CO2的細胞孵箱培養48小時以上，然後棄去培養基，用不含血清RPMI1640培養基洗3次，加入100μl RPMI1640完全培養基和20μlMTS繼續培養2h，490nm測OD值。
4、重組表達蛋白的體內腫瘤細胞殺傷活性以雄性BABL/C小鼠(18-22g)為試驗動物，H22肝癌細胞為接種瘤細胞，具體方法為取H22腫瘤腹水，用生理鹽水1∶4稀釋，配置成瘤細胞懸液，細胞數為(2～3)*105/ml，接種於BABL/C小鼠前肢腋皮下，雄性體重18～22g，每隻小鼠注射0.1ml(含H22細胞2*106～4*106個)，每組8隻動物。實驗之0天，接種腫瘤。第1天，將動物稱重並隨機分為融合蛋白高劑量組(2.5mg/kg)、中劑量組(0.5mg/kg)、低劑量組(0.1mg/kg)、TSST-1對照組(0.47mg/kg)及生理鹽水對照組，而後靜脈給藥，1次/2天，共三次。各組藥液給藥前配製。從第1天起隔天稱體重，測瘤長(a)、寬(b)，按V＝0.5*a*b2計算瘤體積。至第9天，動物稱體重，並剖取各組動物的腫瘤，稱重並統計各組的抑瘤率。
二、結果
1、分離純化後的表達蛋白具有較高的純度，SDS-PAGE電泳結果見圖4。
2、表達純化蛋白的肝癌親合性稀釋實驗(細胞ELISA結果)將含有線狀12肽與TSST-1序列的重組蛋白做系列梯度稀釋後，進行細胞ELISA試驗，ELISA結果見表1表1ELISA法檢測PBV220與目的片段的重組蛋白結果
3、用固定封閉好的7402、7721cell、HL-02cell細胞做融合蛋白酶聯檢測，同時設陰性對照，融合蛋白與肝癌細胞結合的A值顯著高於正常肝細胞，與正常肝細胞的結合的OD值很低，具有較好的特異性。結果見表2。
表212肽TSST-1融合蛋白與肝癌(7721、7402)和正常肝細胞(HL-02 cell)結合情況
4、為了進一步評價重組蛋白的結合活性，我們做了12肽TSST-1融合蛋白與本室構建的HAb25 ScFv-TSST-1蛋白(其與SMMC-7721有很穩定的結合活性)同肝癌細胞SMMC-7721結合活性比較。結果如下12肽-TSST-1融合蛋白與Hab25ScFv-TSST-1的結合活性相當，說明12肽與TSST-1耦聯後，其與肝癌細胞具有很高的親和力。(圖5)5、表達出的12肽TSST-1融合蛋白與dsFV-TSST-1復性蛋白競爭結果利用dsFV-TSST-1系列稀釋梯度復性蛋白與上述表達出的蛋白作競爭實驗。競爭抑制實驗結果顯示隨著dsFV-TSST-1復性蛋白稀釋倍數的增加，抑制率也在增加，這就說明dsFV-TSST-1所構成的表位與篩選出的多肽的表位相同，即與肝癌細胞7721特異結合的位點相同。結果見表3。
表3dsFV-TSST-1系列稀釋梯度復性蛋白與表達蛋白競爭實驗結果
5、12肽TSST-1融合蛋白的腫瘤細胞殺傷效果12肽TSST-1融合蛋白對肝癌細胞有殺傷作用，劑量越高，殺傷效果越明顯，具有明確的劑量效應曲線。具體殺傷效果見圖6。
6、12肽TSST-1融合蛋白的體內腫瘤細胞殺傷效果(1)腫瘤體積變化在實驗的第1、3、5、7及9天用遊標卡尺測量腫瘤的長和寬，按以下公式計算腫瘤體積，用藥組的腫瘤生長明顯慢於生理鹽水對照組，具有明確的腫瘤抑制效果其變化趨勢見圖7。
(2)受試藥物對瘤重的影響及抑制率實驗結束時脫椎處死小鼠，剝取腫瘤，稱重並計算不同劑量的融合蛋白及TSST-1對腫瘤的抑制率。12肽TSST-1融合蛋白高中低三個劑量組的腫瘤抑制率均高於TSST-1對照組，且毒性有降低趨勢，TSST-1對照組在實驗過程中8隻動物中有2隻死亡，而12肽TSST-1融合蛋白中劑量組無小鼠死亡，且生長狀態良好，顯示出一定減毒增效作用。腫瘤抑制結果見表4。
表4.各組實驗動物的瘤重量(均值±SD)及抑制率
序列表110中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所120一種十二肽、含有該十二肽的複合物，其製備方法及在製備肝癌治療藥物中的應用130
1604170PatentIn version 3.1210121112212PRT213
4001Lys Ser Leu Ser Arg His Asp His Ile His His His1 5 10210221136212DNA213
4002aagtctctta gtcggcatga tcatattcat catcat 36210321178212DNA213
4003gcagaattca tgaagtctct tagtcggcat gatcatattc atcatcatgg cggctctaca60aacgataata taaaggat 78210421132212DNA213
4004cacaagcttt taattaattt ctgcttctat ag 3權利要求
1.一種與肝癌細胞特異結合的十二肽，其特徵在於具有序列表中序列1所示的胺基酸序列。
2.根據權利要求1所述的十二肽，其特徵在於其編碼基因具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。
3.含有權利要求1所述十二肽的肝癌導向治療複合物，其特徵在於由作為生物導向治療的「導航系統」的十二肽，和作為生物導向治療的「彈頭」的超抗原或其它生物毒素分子或化療藥物兩部分組成，這兩部分採用化學交鏈或基因融合的方式結合。
4.根據權利要求3的所述的含有十二肽的肝癌導向治療複合物，其特徵在於所述超抗原為葡萄球菌中毒性休克毒素TSST-1，十二肽與TSST-1的通過基因融合連接，連接肽為Gly-Gly-Ser。
5.權利要求4所述的肝癌導向治療複合物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)PCR法製備12肽與TSST-1的融合基因；(2)連入表達載體pBV220；(3)融合蛋白表達及純化。
6.權利要求1所述的十二肽在製備肝癌治療藥物中的應用。
7.權利要求3或4所述的含有十二肽的肝癌導向治療複合物在製備肝癌治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種十二肽以及含有該十二肽的導向複合物，還涉及其製備方法及其在製備肝癌治療藥物中的應用。該十二肽具有序列表中序列1所示的胺基酸序列，該十二肽對於肝癌細胞具有特異的導向作用，含有該十二肽的肝癌導向治療複合物由作為生物導向治療的「導航系統」的十二肽和作為生物導向治療的「彈頭」的超抗原或其它生物毒素分子或化療藥物兩部分組成，這兩部分採用化學交鏈或基因融合的方式結合。本發明的十二肽及含有該十二肽的導向複合物可以製備肝癌治療藥物，在肝癌的治療方面具有重要意義。
文檔編號C12N15/12GK1803832SQ20051000027
公開日2006年7月19日 申請日期2005年1月10日 優先權日2005年1月10日
發明者姜永強, 鄭玉玲, 李韓平, 王海榮, 郝淮傑, 寧保安, 馬茹 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所