一種快速鑑別七種蕓薹屬作物種子的方法
2023-04-29 14:22:21
專利名稱：一種快速鑑別七種蕓薹屬作物種子的方法
技術領域：
本發明涉及蕓薹屬作物種子鑑定技術，具體地說是應用DNA分子標記技術快速鑑 別七種蕓薹屬作物種子的方法。
背景技術：
蕓薹屬作物種類繁多，其中栽培面積較大的有不結球白菜、結球白菜、青花菜、花 椰菜、結球甘藍、球莖甘藍和甘藍型油菜等作物，它們之間親緣關係近，種子形狀相似程度 高，用常規方法很難將它們快速區分開，而分子標記技術如RAPD、SRAP, ISSR等，通過比較 材料之間的擴增譜帶，就可以較好地將其區分，既省時又可靠。SRAP(sequence-related amplifiedpolymorphism)是基於PCR的一種新型分子標記技術，由美國加州大學蔬菜作物 系Li與Quiros博士於2001年最先開發的，該技術集RAPD與AFLP兩技術優點於一體，具 有簡單、穩定、在基因組中分布均勻等特點，現已用於馬鈴薯、蘋果、油菜、棉花等植物和水 稻稻瘟病的研究。ISSR(inter_simple sequence repeat)又稱簡單序列重複區間擴增，是 利用真核生物基因組廣泛存在的簡單重複序列(SSR)設計引物，無需預知基因組序列，對 所有作物均適用，並且實驗成本低、操作簡單、穩定性好、多態性豐富，現已廣泛應用於基因 定位、種子資源分類、生物遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構建等研究領域。因此，利用分子標 記技術開發出一種快速鑑別七種蕓薹屬作物種子的方法，可以在商品種子出售前進行純度 鑑定，以避免假種子傷農事件的發生。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速鑑別七種蕓薹屬作物種子的方法，以克服現有技術 存在的不足。本發明的技術構思是這樣的DNA指紋圖譜鑑定法是以DNA的多態性為基礎的分子標記方法，可以彌補 和克服在種子的形態學鑑定及同工酶、種子蛋白電泳鑑定中的許多缺陷和難題。本 發明的七種蕓薹屬作物的DNA指紋圖譜，是由「1」和「0」組成的數據。使用引物 M9-GA18，不結球白菜、結球白菜、青花菜、花椰菜、結球甘藍、球莖甘藍和甘藍型油菜 的數據分別為 01111101011101111000101000101,10101101011101101000101010101, 10010110110100010101010001010,10010100110110000110010001010, 10010100110111110111010101100,10010100110110000110010000010 和 10011101011110011100011000011。 使用引物 UBC810 的數據分別為 10000110100101000110000,10001101101101001010000,00000001011000010101010, 00110001010010010101011,01110000100110100001011,00110001010000010101011 和 00000000000101110110100。使用引物 UBC834 的數據分別為:1100101001101101001, 1100100100000000100,011010000100100001 1, 1 11010100001011001 1, 1110111001010110011、1110001000010110011 和 0001101011111100011。其中所述數字「1」表示圖譜中某個位置上有擴增帶存在，數字「0」表示在某個位置上沒有擴增條帶存在。所說的不結球白菜、結球白菜、青花菜、花椰菜、結球甘藍、球莖甘藍、甘藍型油菜 可以採用上海市農業科學院園藝研究所公開銷售的產品。七種蕓薹屬作物種子快速鑑別的方法，包括如下步驟1)、用種子提取及純化七種蕓薹屬作物的基因組DNA ；2)、用獲得的七種蕓薹屬作物DNA為模板進行SRAP和ISSR分析；3)、選擇有代表性的多態性擴增條帶，根據所選擇條帶的有、無構建供試材料DNA 指紋圖譜。其中所述七種蕓薹屬作物都有其特異的DNA指紋，可以相互區分開來。所述SRAP、 ISSR擴增中採用的引物是由上海生工生物工程有限公司合成的寡核苷酸引物。SRAP擴增 採用的引物為 M9 :TGAGTCCAAACCGGTAG, GA18 :GGCTTGAACGAGTGACTGA。ISSR 擴增採用的弓丨 物為 UBC810 :GAGAGAGAGAGAGAGAT, UBC834 :AGAGAGAGAGAGAGAGYT。本發明的方法可以應用於不結球白菜、結球白菜、青花菜、花椰菜、結球甘藍、球莖 甘藍和甘藍型油菜共七種蕓薹屬作物種子的快速鑑別。本發明具有如下優點1、本發明創建了一種快速鑑別七種蕓薹屬作物種子的方法，該方法能從遺傳本質 上對七種蕓薹屬作物種子進行鑑定，因此準確、可靠。2、採用本發明，在對七種蕓薹屬作物種子進行檢測時，用目前廣泛應用的快速、微 量DNA提取法提取待測種子樣品的DNA，用提取的DNA作為模板，進行SRAP或ISSR分析，在 幾個小時內就可以知道供試材料的DNA指紋，因此，就能迅速判斷出它的真實性。3、由於本發明的種子鑑別方法是用DNA指紋圖譜的形式表示，看起來比較直觀、 易懂；並由於轉換成了數碼形式，便於計算機識讀和分析。
附圖為本發明建立的SRAP、ISSR指紋圖譜，其中M為DGL 2000DNA標識；1、2、3、 4、5、6、7:分別代表不結球白菜、結球白菜、青花菜、花椰菜、結球甘藍、球莖甘藍和甘藍型油 菜。A、B、C:依次為引物M9-GA18、UBC810和UBC834的擴增電泳圖。
具體實施例方式實施例1本實施例採用CTAB法提取七種蕓薹屬作物種子的基因組DNA，通過SRAP、ISSR兩 種分子標記方法構建其DNA指紋圖譜用於種子的鑑別。具體操作如下1、選用的試驗材料材料為不結球白菜、結球白菜、青花菜、花椰菜、結球甘藍、球莖甘藍和甘藍型油菜 的種子。2、種子DNA的提取及純化按如下程序提取各份種子材料的基因組DNA 取1粒或0. 1-0. 2g種子，置於經_20°C冰箱降過溫的研缽中磨碎，轉入1. 5mL的離 心管中，加入 0. 35mL 的 55°C預熱過的 IXDNA 提取液(50mmol/LTris-HCl pH7. 5，IOmmol/LEDTApH8. 0,0. 7mmol/L NaCl, 1% β _巰基乙醇，1%07^)，31^11後加入2\0嫩提取液(濃 度為前者的兩倍)，放入培養箱中過夜，其間顛倒數次，加入0. 7mL飽和酚，在自製的 混勻器(2r/min)上混勻抽提3h，6000r/min下離心lOmin，將上清液轉入至另一管中，加入 0. 35mL飽和酚和0. 35mL氯仿-異戊醇(24 1)抽提2h，6000r/min下離心IOmin,取上清 液至另一管中，加入0.7mL氯仿-異戊醇04 1)抽提2h，6000r/min下離心lOmin，取上 清液至另一管中，加入0. 07mL3mol/LNaAc和0. 7mL異丙醇，室溫下沉澱30min，3000r/min 下離心5min，棄上清液，用70%酒精洗滌DNA，吹乾，溶於100 μ L (或適量)TE中，並在 瓊脂糖凝膠上電泳，用標準λ DNA作對照，估算DNA樣品的濃度，獲得高純度DNA。3、用獲得DNA為模板進行SRAP、ISSR分析SRAP 擴增反應採用 20yL 的反應體系，其中 25mmol/L MgC12 2. OyL, IOXPCR Buffer 2. Ομ L, 10mmol/L dNTP 0. 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，0· lymol/L 弓 |物 各3. 0 μ L，IOng/ μ L模板DNA 3. 0 μ L,滅菌雙蒸水6. 4 μ L，加蓋一滴礦物油進行擴增。擴增 程序為94°C預變性5min ；94°C變性lmin，35°C退火lmin，72°C延伸1. 5min，5個循環；94°C 變性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸1. 5min，35個循環；72°C延伸IOmin後4°C保存。擴增 產物用1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。反應結束後，PCR產物使用6%聚丙烯醯胺膠電 泳1. 5小時，採用快速銀染法染色定影后拍照。ISSR 擴增反應採用 20μ L 的反應體系，其中 25mmol/L MgC12 2. OyL, 10XPCR Buffer 2. 0μ L, 10mmol/L dNTP 0. 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，0· lymol/L 弓 |物 3. OyL, IOng/ μ L模板DNA 3. 0 μ L,滅菌雙蒸水9. 4 μ L，加蓋一滴礦物油進行擴增。擴增程 序為 94°C 預變性 5min ；94°C 變性 lmin，52°C 退火 lmin，72°C 延伸 1. 5min，;35 個循環；72°C 延 伸IOmin後4°C保存。擴增產物用1. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。PCR產物在1.5%瓊 脂糖凝膠中電泳1.證，EB染色，Gel DocTM EQ 170-8060凝膠成像儀進行觀察並拍照分析。4、引物篩選使用100個ISSR引物和35對SRAP弓丨物對七份材料進行PCR擴增，其中有44個 ISSR引物和32對SRAP引物能擴增出清晰的條帶，但大多數引物的擴增結果不能將7份 蕓薹屬作物明顯地區分開，不能起到鑑別的作用。最終篩選出2個ISSR引物(UBC810和 UBC834)和1對SRAP引物(M9-GA18)能擴增出很好的多態性條帶，可將7份蕓薹屬作物逐 一區分開來。5、數字指紋的建立根據上述兩種分子標記指紋圖譜，以1和0分別代表某個等位基因位點擴增 DNA條帶的有無，按照從上到下即由大片段向小片段的讀帶方向，將分子標記指紋圖譜 轉換為由1和0組成的字符串，即構成數字指紋，是由「1」和「0」組成的數據。使用引 物M9-GA18，不結球白菜、結球白菜、青花菜、花椰菜、結球甘藍、球莖甘藍和甘藍型油菜 的數據分別為 01111101011101111000101000101,10101101011101101000101010101, 10010110110100010101010001010,10010100110110000110010001010, 10010100110111110111010101100,10010100110110000110010000010 和 10011101011110011100011000011。 使用引物 UBC810 的數據分別為 10000110100101000110000,10001101101101001010000,00000001011000010101010, 00110001010010010101011,01110000100110100001011,00110001010000010101011 和00000000000101110110100。使用引物 UBC834 的數據分別為:1100101001101101001, 1100100100000000100,0110100001001000011 , 1 11010100001011001 1, 1110111001010110011,1110001000010110011和 0001101011111100011。實施例2本發明的DNA指紋圖譜可用於蕓薹屬蔬菜種子的快速鑑別從制種基地生產的蕓薹屬蔬菜種子中各隨機抽取50-80粒，用微量DNA提取法 提取種子的DNA，用提取的DNA作為模板，用相應的引物對其進行PCR擴增和電泳分析。 如利用引物UBC834分析查出的95 %以上的種子DNA指紋是「 1100101001101101001 」 即為不結球白菜(青菜)品種，DNA指紋是「1100100100000000100」即為結球白 菜(大白菜)品種，DNA指紋是「0110100001001000011」為青花菜品種，DNA指紋是 「1110101000010110011」為花椰菜品種、DNA 指紋是「1110111001010110011」為結球甘藍品 種，DNA指紋是「1110001000010110011」為球莖甘藍品種。如果鑑定的純度低於90%，就不 能夠作為種子進行銷售，以避免假種子傷農事件的發生。如果以上蔬菜品種種子中出現有 「0001101011111100011」的DNA指紋，就說明混入甘藍型油菜種子，若混入的比例較高，就 有可能是故意混入或機械混雜造成，這樣的種子必須報廢。若用不發芽的油菜種子混入蔬 菜種子中，雖然種子出苗後不會出現雜株，但會降低種子的發芽率，也是不合格的種子，用 本發明的方法可以鑑定出蕓薹屬蔬菜品種中混入甘藍型油菜種子的比例，可以揭露不法商 販用種子形狀相似的便宜的油菜種子充當高價值的蕓薹屬蔬菜種子的做法。
權利要求
1.一種快速鑑別七種蕓薹屬作物種子的方法，其特徵在於，包括如下步驟1)、用種子提取及純化七種蕓薹屬作物基因組的DNA；2)、用獲得的七種蕓薹屬作物DNA為模板進行SRAP和ISSR分析；3)、選擇有代表性的多態性擴增條帶，根據所選擇條帶的有、無構建供試材料DNA指紋 圖譜。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，七種蕓薹屬作物的DNA指紋圖譜， 是由「1」和「0」組成的數據。使用引物M9-GA18，不結球白菜、結球白菜、青花菜、花椰 菜、結球甘藍、球莖甘藍和甘藍型油菜的數據分別為01111101011101111000101000101、 10101101011 101101000101010101, 10010110110100010101010001010, 10010100110110000110010001010,10010100110111110111010101100, 10010100110110000110010000010 和 1001110101111001110001100001Io 使用引 物 UBC810 的數據分別為10000110100101000110000、10001101101101001010000、 00000001011000010101010、00110001010010010101011、01110000100110100001011、 00110001010000010101011 和 00000000000101110110100。使用引物 UBC834 的數 據分別為1100101001101101001、1100100100000000100、0110100001001000011、 1110101000010110011,1110111001010110011,1110001000010110011 和 0001101011111100011。其中所述數字「1」表示圖譜中某個位置上有擴增帶存在，數字「0」 表示在某個位置上沒有擴增條帶存在。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述SRAP擴增中採用的引物為M9: TGAGTCCAAACCGGTAG, GA18 :GGCTTGAACGAGTGACTGA。ISSR 擴增中採用的引物為 UBC810 GAGAGAGAGAGAGAGAT, UBC834 :AGAGAGAGAGAGAGAGYT。
4.權利要求2所述的方法的應用，其特徵在於，用於親緣關係近，種子形狀相似程度高 的七種蕓薹屬作物種子的快速鑑別。
全文摘要
本發明公開了一種快速鑑別不結球白菜、結球白菜、青花菜、花椰菜、結球甘藍、球莖甘藍和甘藍型油菜共七種蕓薹屬作物種子的方法。內容包括1、七種蕓薹屬作物種子DNA的提取；2、用獲得的七種蕓薹屬作物的DNA為模板進行SRAP和ISSR分析；3、選擇有代表性的多態性擴增條帶構建供試材料DNA指紋圖譜；在DNA指紋圖譜中七種蕓薹屬作物都有特異的DNA指紋，可以相互區分開來。由於本發明的種子鑑別方法是用DNA指紋圖譜的形式表示，看起來比較直觀、易懂；並將其轉換成數碼表示形式，便於計算機識讀和分析。本發明能從遺傳本質上對親緣關係近，種子形狀相似程度高的七種蕓薹屬作物種子進行鑑別，結果準確、可靠，檢測迅速。
文檔編號C12Q1/68GK102108394SQ200910200830
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月25日 優先權日2009年12月25日
發明者繆體雲, 薄天嶽, 陳錦秀, 馬金駿 申請人:上海市農業科學院, 上海科園種子有限公司, 上海科立特農科(集團)有限公司