一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統及其製備和應用的製作方法
2024-02-29 08:43:15
一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統及其製備和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物【技術領域】，具體的說是一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統及其製備和應用。以含有來源於枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因gdh和冰核蛋白基因的質粒作為基礎質粒，將編碼目標蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列gdh-m中引入突變的鹼基，構建葡萄糖脫氫酶突變體細菌表面展示質粒；從而展示在宿主細胞表面上，得到基於冰核蛋白的葡萄糖脫氫酶突變體細菌表面展示系統。本發明製備得到的葡萄糖脫氫酶展示菌株具有高穩定性和高特異性，得到的全細胞催化劑可應用於生物能源、食品發酵、澱粉糖、功能糖、生物醫藥、化工、環境檢測、生物傳感器和生物燃料電池等領域。
【專利說明】一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展 示系統及其製備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體的說是一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫 氫酶細菌表面展示系統及其製備和應用。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖脫氫酶（⑶H) (EC1. 1. 1. 47)廣泛參與生物體中的葡萄糖代謝途徑，特別是 芽孢桿菌在芽孢形成階段的關鍵酶。藉助於輔酶NAD (P) +，葡萄糖在GDH的催化下被氧化成 葡萄糖酸內酯，輔酶NAD (P) +則被還原為NAD (P) H。自二十世紀八十年代起，研究人員就已 經克隆了來源於芽孢桿菌的GDH，並在大腸桿菌中進行了高效表達。
[0003] 來源於芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶屬於短鏈脫氫酶/還原酶家族（short-chain dehydrogenase/reductase，SDR)，是由四個相同的亞基組成的四聚體蛋白，單體的分子量 約為30kDa。野生型的GDH熱穩定性和pH穩定性都不理想，因此，在實際應用上受到了一 定的限制。鑑於此，研究人員開始對編碼GDH的基因進行體外定向進化的研究，Makino和 Nagao等人採用化學誘變的方法對來源於Bacillus megaterium IWG3的葡萄糖脫氫酶進行 了突變，得到了多株熱穩定性提高的突變體，其中E96A的熱穩定性最高，與野生型相比提 高了約ZCTC^Baik等人米用DNA重排技術突變來源於Bacillus licheniformis IF012200, Bacillus megaterium IF015308, Bacillus subtilis IF013719 和 Bacillus megaterium IWG3的一個突變體F20 (Q252L)，獲得了一個熱穩定性顯著提高的突變體DN46 (E170K/ Q252L)，DN46在66°C的半衰期為540分鐘，而F20僅為1. 3分鐘。⑶Η的三維結構研究表 明，突變體通過增強疏水作用和減小離子的排斥作用顯著增強了亞基與亞基之間的相互作 用力，穩定了酶的三維結構，從而提高了酶的穩定性。在此基礎上，Vazquez-Figueroa等人 對來自於Bacillus subtilis的葡萄糖脫氫酶進行了有理設計，得到了多個突變體，其中 K170/L252突變體的Tm值和野生型相比提高了 34. 7°C。
[0004] 在底物特異性方面，GDH對其天然底物β -D-葡萄糖的特異性並不高，對結構類似 的木糖、半乳糖、甘露糖都有較弱的催化作用。研究人員在GDH三維結構研究的基礎上，突 變了巨大芽孢桿菌ΙΑΜ1030中IV-GDH的C-末端區域的胺基酸殘基，得到了多個突變體，它 們對其底物特異性都有很大的影響。
[0005] 綜上所述，研究者廣泛採取隨機突變、DNA重排等基因工程的手段，在一定程度上 提高了 GDH的穩定性和底物特異性，但是這些方法需要將表達的突變蛋白進行純化，然後 再測定其酶活性，上述過程費時費力，需要昂貴的儀器設備，過程複雜且不易操作，尤其不 適用於高通量的突變體篩選。
[0006] 微生物表面展示技術是利用基因工程的手段將外源蛋白通過融合適當的錨定蛋 白而表達在微生物細胞的表面，例如OmpA、冰核蛋白（ice-nucleation protein，INP)和凝 集素等都可以作為錨定蛋白。這種技術被廣泛用於蛋白質工程，疫苗設計，疾病診治，工業 和環保等領域。由於被展示的蛋白在細胞表面具有相對獨立的空間結構和生物學活性，能 夠直接與底物進行充分的反應，而且表面展示文庫具有高通量、高靈敏度的特點，因此微生 物表面展示技術在研究蛋白質生物學功能方面具有很大的應用前景。Tan等利用OprI作為 錨定蛋白將聚（R)的3-羥基丁酸酯（PHB)解聚酶突變體展示在大腸桿菌的表面，篩選得到 酶活性提高的突變體，研究了參與底物識別的關鍵胺基酸殘基。由此可見，微生物表面展示 技術是用來研究蛋白功能和特性的一個非常簡單、有效的手段。INP是丁香假單胞菌等菌株 的外膜蛋白，可催化過冷卻水結冰。外源蛋白可與INP融合，通過糖基磷脂醯肌醇而錨定在 細菌表面。全長的冰核蛋白包括N端、C端和中間重複序列。與其他錨定蛋白相比，外源蛋 白可以在宿主細胞中穩定的表達，而且能夠高效的展示在細菌表面。
[0007] Quikchange定點突變技術是通過設計含有突變位點的引物，利用PCR反應，以質 粒為模板，在高保真DNA聚合酶的作用下進行延伸，得到含有突變位點的DNA雙鏈質粒，這 種質粒是未甲基化的，而大腸桿菌自身的質粒DNA是甲基化的，這樣就可以通過Dpnl酶消 化去除原始模板，最後得到突變的質粒，經過轉化得到突變的菌株。該技術操作簡便，效率 高,現已成功用於各種突變體的構建。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展 示系統及其製備和應用。
[0009] 為實現上述目的，本發明採用的技術方案為：
[0010] 一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統，以含有來源於 枯草芽抱桿菌的匍萄糖脫氫*酶基因 gdh和冰核蛋白基因的質粒作為基礎質粒，將編碼目標 蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列gdh-m中引入突變的鹼基，構建葡萄糖脫氫酶突變體細菌表 面展示質粒；從而展示在宿主細胞表面上，得到基於冰核蛋白的葡萄糖脫氫酶突變體細菌 表面展示系統。
[0011] 所述突變體，利用Quikchange定點突變方法，以質粒pTInaPbN-Gdh為模版，帶有 突變鹼基的正向和反向序列為引物，通過PCR反應得到突變體。（pTInaPbN-Gdh模版按照 如下文獻構建 Bo Liang, Liang Li, Xiangjiang Tang, Qiaolin Lang, Hongwei Wang, Feng Li,Jianguo Shi,Wei Shen，Ilaria Palchetti，Marco Mascini，and AihuaLiu*，Microbial surface display of glucose dehydrogenase for amperometric D-glucose biosensor, Biosensors and Bioelectronics2013,45,19-24.)
[0012] 具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統製備方法，以含有來 源於枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因 gdh和冰核蛋白基因的質粒作為基礎質粒，利用 Quikchange定點突變方法，以質粒pTInaPbN-Gdh為模版，帶有突變鹼基的正向和反向序列 為引物，通過PCR反應得到突變體，也就是將編碼目標蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列gdh-m 中引入突變的鹼基，構建葡萄糖脫氫酶突變體細菌表面展示質粒；該質粒含有在葡萄糖脫 氫酶宿主細胞菌中表達和表面展示的所有元件，突變體與負責跨膜定位和轉運的冰核蛋白 N端結構域的基因序列inaPb-N融合，從而展示在宿主細胞表面上，得到基於冰核蛋白的葡 萄糖脫氫酶突變體細菌表面展示系統。
[0013] 具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統的應用，所述展示系 統得到的全細胞可應用於生物能源、食品工業、生物化工、生物傳感或分析檢測中。
[0014] 本發明的效果是：
[0015] 1.本發明利用冰核蛋白表面展示系統將葡萄糖脫氫酶突變體穩定地展示在細菌 的表面，從而解決了胞內酶提取過程複雜和穩定性低的難題。
[0016] 2.本發明將定向進化和細菌表面展示技術結合起來，實現了便捷有效的葡萄糖脫 氫酶突變體篩選方法。
[0017] 3.本發明通過Quikchange定點突變的方法得到四株熱穩定性提高的突變體 Q252L/E170R、Q252L/E170R/V149K、Q252L/E170R/G259A 和 Q252L/E170R/V149K/G259A。
[0018] 4.本發明細菌表面展示的葡萄糖脫氫酶突變體熱穩定性高。其中突變體Q252L/ E170R/V149K/G259A的熱穩定性最好，在60°C條件下的半衰期是21天。
[0019] 5.本發明通過Quikchange定點突變的方法得到兩株pH穩定性提高的突變體 Q252L/E170R/V149K 和 Q252L/E170R/V149K/G259A。
[0020] 6.本發明通過Quikchange定點突變的方法得到三株底物特異性提高的突變體 Q252L/E170R/G259A、Q252L/E170R/V149K 和 Q252L/E170R/V149K/G259A。
[0021] 7.本發明細菌表面展示的葡萄糖脫氫酶突變體特異性好，其中突變體Q252L/ E170R/V149K/G259A對其他糖類，如木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、核 糖和阿拉伯糖均無催化活性。
[0022] 8.本發明提供一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示菌株 的製備方法。此方法簡便高效，得到的菌株可用於生物能源、食品發酵、澱粉糖、功能糖、生 物醫藥、化工、環境檢測、生物分析、生物傳感器和生物燃料電池等領域。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發明實施例提供的葡萄糖脫氫酶基因的突變位點。
[0024] 圖2為本發明實施例提供的全細胞GDH突變體的pH穩定性效果圖。
[0025] 圖3為本發明實施例提供的全細胞GDH突變體的溫度穩定性效果圖。
[0026] 本發明目的、功能及優點將結合實施例，參照附圖做進一步說明。
【具體實施方式】
[0027] 本發明利用Quikchange定點突變方法，構建基於冰核蛋白的細菌表面展示系統， 將葡萄糖脫氫酶突變體展示在大腸桿菌的表面，具體為：
[0028] 1.利用Quikchange定點突變方法突變葡萄糖脫氫酶的特定位點；
[0029] 2.將葡萄糖脫氫酶突變體展示在大腸桿菌的表面；
[0030] 3.測定葡萄糖脫氫酶突變體展示菌株全細胞的酶活性、穩定性和底物特異性。
[0031] 實施例1
[0032] 葡萄糖脫氫酶突變體的獲得：
[0033] 1.野生型葡萄糖脫氫酶展示載體的構建：將編碼枯草芽孢桿菌（Bacillus subtillus)中葡萄糖脫氫酶的基因 gdh與含有INP的表達質粒pTInaPb-N連接，轉 化大腸桿菌感受態DH5ci，挑取轉化子，提取測序鑑定正確的轉化子的質粒，命名為 pTInaPbN-Gdh，待用。
[0034] 2.單點突變體Q252L的構建
[0035] 突變PCR :以pTInaPbN-Gdh質粒DNA為模板，根據突變位點設計併合成引物（表 1)，進行PCR擴增，得到編碼葡萄糖脫氫酶突變體的基因。
[0036] PCR反應體系為：無菌水32. 5 μ L，模板DNA1 μ L，5 X PrimeSTAR HS緩衝液 (Mg2+plus) 10 μ L，dNTP 混合液（各 2. 5mmol/L) 4 μ L，引物 Q252L 正向（20pmol/μ L) 1 μ L， 引物 Q252L 反向（20pmol/yL)lyL，TaKaRaPrimeSTAR HS DNA 聚合酶 0.5yL。反應條件 為：95°C預變性 5min，94°C 10s，60°C 15s，72°C 7.5min，18 個循環，最後 72°C延伸 lOmin。
[0037] 1)酶切：將反應完成的PCR產物取出，按1 : 50的比列加入Dpnl酶，37°C酶切6 個小時。
[0038] 2)取出，轉化至大腸桿菌DH5a感受態，在含有卡那黴素的LB平板上塗布，37°C過 夜培養。
[0039] 3)轉化子長出後，挑取單克隆送去測序。
[0040] 3.雙點突變體的構建：雙點突變體Q252L/E170R的構建是在單點突變體Q252L基 礎上，利用E170R的引物（表1)進行PCR反應，引入E170R的突變位點。
[0041] 4.三點突變體的構建：三點突變體Q252L/E170R/V149K和Q252L/E170R/G259A的 構建是在雙點突變體Q252L/E170R基礎上，分別利用V149K和G259A的引物（表1)進行 PCR反應，分別引入V149K和G259A的突變位點。
[0042] 5.四點突變體的構建：四點突變體Q252L/E170R/V149K/G259A的構建是在三點突 變體Q252L/E170R/V149K基礎上，利用G259A的引物（表1)進行PCR反應，引入G259A的 突變位點。
[0043] 表lQuikchange定點突變方法所用到的PCR引物
[0044]
【權利要求】
1. 一種具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統，其特徵在於：以 含有來源於枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因 gdh和冰核蛋白基因的質粒作為基礎質粒， 將編碼目標蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列gdh-m中引入突變的鹼基，構建葡萄糖脫氫酶突 變體細菌表面展示質粒；從而展示在宿主細胞表面上，得到基於冰核蛋白的葡萄糖脫氫酶 突變體細菌表面展示系統。
2. 按權利要求1所述的具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系統， 其特徵在於：利用Quikchange定點突變方法，以質粒pTInaPbN-Gdh為模版，帶有突變鹼基 的正向和反向序列為引物，通過PCR反應得到突變體。
3. -種權利要求1所述的具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系 統製備方法，其特徵在於：以含有來源於枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶基因 gdh和冰核蛋 白基因的質粒作為基礎質粒，利用Quikchange定點突變方法，以質粒pTInaPbN-Gdh為模 版，帶有突變鹼基的正向和反向序列為引物，通過PCR反應得到突變體，也就是將編碼目標 蛋白葡萄糖脫氫酶的基因序列gdh-m中引入突變的鹼基，構建葡萄糖脫氫酶突變體細菌表 面展示質粒；該質粒含有在葡萄糖脫氫酶宿主細胞菌中表達和表面展示的所有元件，突變 體與負責跨膜定位和轉運的冰核蛋白N端結構域的基因序列inaPb-N融合，從而展示在宿 主細胞表面上，得到基於冰核蛋白的葡萄糖脫氫酶突變體細菌表面展示系統。
4. 一種權利要求1所述的具有高穩定性和高特異性的葡萄糖脫氫酶細菌表面展示系 統的應用，其特徵在於：所述展示系統得到的全細胞可應用於生物能源、食品工業、生物化 工、生物傳感或分析檢測中。
【文檔編號】C12N15/63GK104120102SQ201310152468
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月27日 優先權日:2013年4月27日
【發明者】劉愛驊, 梁波, 唐湘江 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所