一種新鉀通道調節肽的製作方法

2023-12-10 01:51:31

專利名稱：一種新鉀通道調節肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及鉀通道調節劑領域，該調節劑用作疾病例如心律失常、多發性硬化、類風溼性關節炎和其它涉及鉀通道缺陷的綜合病症的治療分子。
背景技術：
鉀通道為膜蛋白，其確定靜息膜電位以及動作電位的作用時間，涉及複雜的生物過程例如調節心律、肌肉收縮、神經元興奮性和免疫功能(Kurokawa，J.et al.，Journal of Molecular andCellular Cardiology(2001)，33，873-882；Dodson，P.D.andForsythe，I.D.，Trends in Neurosciences(2004)，27，210-217；Koo，G.C.et al.，Cellular Immunology(1999)，197，99-107)。它們作為神經遞質、藥物、毒素等的靶並且是合理的藥物設計的引人注目的工具。例如，某K+通道阻斷劑顯示III類抗心律失常作用，用做防止或抑制折返性心律失常的性能。(Tamargo，J.et al.，Cardiovascular Research(2004)，62，9-33). 據報導Margatoxin，來源於蠍子的毒素，具有治療自身免疫失常如多發性硬化和類風溼性關節炎的性能(Shak，K et al.，CellularImmunology(2003)，221，100-106)。食魚螺毒素，來自圓錐蝸牛(cone snails)的肽，是中樞神經系統中受體和通道的最有力的配體之一。已提出kappa食魚螺毒素，k-Pviia，來自Conuspurpurascens，作為用於治療老年性痴呆(Alzheimer’sdisease)、肌無力樣綜合症(Lambert-Eaton syndrome)和重症肌無力的可能候選物(Olivera，B.M.et al.，Expert Opinion onTherapeutic Patents(2001)，11，603-623)。鉀通道為膜蛋白，其確定靜息膜電位以及動作電位的作用時間，涉及複雜的生物過程例如調節心律、肌肉收縮、神經元興奮性和免疫功能(Kurokawa，J.et al.，Journal of Molecular and CellularCardiology(2001)，33，873-882；Dodson，P.D.and Forsythe，I.D.，Trends in Neurosciences(2004)，27，210-217；Koo，G.C.et al.，Cellular Immunology(1999)，197，99-107)。它們作為神經遞質、藥物、毒素等的靶並且是合理的藥物設計的引人注目的工具。例如，某K+通道阻斷劑顯示III類抗心律失常作用，用做防止或抑制折返性心律失常的性能。(Tamargo，J.et al.，Cardiovascular Research(2004)，62，9-33).據報導Margatoxin，來源於蠍子的毒素，具有治療自身免疫失常如多發性硬化和類風溼性關節炎的性能(Shak，K et al.，CellularImmunology(2003)，221，100-106)。食魚螺毒素，來自圓錐蝸牛(cone snails)的肽，是中樞神經系統中受體和通道的最有力的配體之一。已提出kappa食魚螺毒素，k-Pviia，來自Conuspurpurascens，作為用於治療老年性痴呆(Alzheimer’sdisease)、肌無力樣綜合症(Lambert-Eaton syndrome)和重症肌無力的可能候選(Olivera，B.M.et al.，Expert Opinion onTherapeutic Patents(2001)，11，603-623)。
K+通道的分子多樣性大於其它任一組離子通道，具有超過80個的不同基因和許多剪接變體。在中樞神經系統可以顯著地觀察到此多樣性，具有眾多神經元亞類表達出一類獨特的鉀通道。電壓門控鉀通道是在神經元中動作電位復極化的原因。早期背根神經元的電生理學研究已顯示至少六種電壓門控K+電流的表達，三種瞬時電流和三種非不活化電流。

發明內容
本發明要求保護從Conus monile獲得的13-殘基肽的新鉀通道調節活性。該靶序列已通過傳統的固相多肽合成程序製備並發現與天然肽相同。此肽序列的類似物可以容易地通過合成方法製備。
電生理學研究暗示Mo1659，13-殘基肽，特別地作用於非不活化K+電流。為確定靶通道亞類和建立通道阻斷活動的分子機制必須研究克隆的K+通道和分析合成的類似物。
具體實施例方式
本發明公開一種具有胺基酸序列FHGGSWYRFPWGY(SEQ ID NO 1)的基本上純的肽。
將此肽用作鉀通道調節劑。
製備基本上純的肽的方法，其包括(i)分離該肽，和(ii)通過色譜法純化該肽。
在步驟(i)中的該肽分離自Conus monile的毒液。
該純化步驟(ii)通過HPLC(高效液相色譜)進行。
該肽用於治療神經生理學和神經學上的病症。
該肽用於治療在精神分裂症、癲癇症、躁鬱症(bipolardisorder)中或在影響神經系統的綜合症中的神經生理學和神經學上的病症。
具有或不具有藥學上可接受載體的包含具有胺基酸序列FHGGSWYRFPWGY(SEQ ID NO 1)的藥物組合物。
下面的實施例將討論而不應認為是限制本發明。
實施例1(肽的分離和純化)該樣品，Conus monile收集自印度東南海岸。解剖後的毒液管保存在乙醇中且滲出的毒液在旋轉蒸發儀中濃縮之後進行高效液相色譜(HPLC)純化。毒液粗提物施於Jupiter 4μ，Proteo 90，C18柱上(10mm×250mm)並用含0.1％TFA的乙腈線性梯度洗脫。流速保持在1ml min-1且檢測在226nm下吸光率。已實現幾個肽組分的分級分離。通過MALDI質譜分析單個HPLC分餾物來分析肽組分。選擇對應於1659Da分子量的保留時間在23.4分鐘的強組分用於質譜從頭測序。該肽組分顯示高解析度MALDI質譜，其確認了[M+H]+＝1659.1Da(單一同位素質量)。在電噴霧(electrospray)質譜中觀察該插入物顯示帶電狀態，其中+2和+3狀態是可檢測的，表明在該分子中存在至少三個可質子化基團。嘗試用DTT還原隨後用碘乙醯胺烷基化沒有改變該分子量，確認了不存在二硫鍵。使用乙酸酐和乙酸的乙醯化作用產生具有質量[M+H]+＝1701.3Da(m＝+42Da)的產物，說明存在單個伯氨基。UV和螢光光譜確認了同時存在Trp和Tyr殘基。選擇1659.1Da作為前體離子使用MALDI MS/MS技術進行肽測序。圖3顯示隨著b和y離子組(13)的分配觀察到的碎片離子。在285Da的強b2離子(intense b2 ion)的存在允許順序追蹤8殘基片斷-GGSWYRFP-。在70、110、136和159的immonium離子分別表明存在Pro、His、Tyr和Trp殘基。在285Da處的b2離子可對應於在氨基端的二肽-FH-或-HF-。在194.9Da處的質量峰的觀測表明存在二肽離子-GH-或-HG-。這支持在N端分配-FHG-序列。在質量範圍1200-1500Da的少量強片斷限制了該序列在C端的延伸。
實施例2(肽的構象)通過兩種獨立的方法實現該已確定序列的證實。首先，製備對應於該確定的Mo1659序列的合成肽且其MS/MS碎片模式顯示與天然產物的碎片模式相同(圖5)。通過HPLC(圖5，插入物)分析同樣確認了該合成和天然肽的一致性。其次，使用自動測序儀的傳統Edman測序證實了該序列。Mo1659值得注意的特點是在一段13殘基的短序列中存在多達七個芳香族胺基酸(F-2、Y-2、W-2、H-1)。帶正電的肽顯著缺乏普通脂肪族，疏水胺基酸如Ala、Val、Leu和Ile。
實施例2(a)還原和烷基化將已純化的肽溶於30μL，0.05M的NH4HCO3緩衝液，pH8.0，為進行還原，加入200mM原料二硫蘇糖醇(DTT)使最終濃度為8mM並在37℃溫育2小時，隨後加入碘乙醯胺原料溶液以達到濃度40mM。將所得混合物在室溫下在黑暗中溫育1小時，隨後用MALDIMS分析。
乙醯化作用將該肽溶液乾燥並重新懸浮於1∶1比例的乙酸和乙酸酐中。在室溫下溫育5分鐘之後，將該所得溶液再次乾燥並重新懸浮於1∶1(v/v)比例的0.1％TFA和乙腈中並用MALDI MS分析。胰蛋白酶消化在50μl的50mM NH4HCO3，pH8.0中用10μg酶將該經純化的樣品用經TPCK處理的胰蛋白酶(Sigma Co.，USA)在37℃消化3小時。用MALDI和ESI質譜分析該消化物。
胰蛋白酶消化在50μl的50mM的NH4HCO3，pH8.0中用10μg酶將該經純化的樣品用經TPCK處理的胰蛋白酶(Sigma Co.，USA)在37℃消化3小時。用MALDI和ESI質譜分析該消化物。
用胰蛋白酶消化Mo1659產生具有質量(MALDI)1010Da和668Da的兩片斷，分別對應於N端和C端的片斷。指定該668Da片斷為C端片斷-FPXX，之前已將其作為在圖3中的碎片離子檢測[注意在水解時，在N端片斷加入17Da(OH)和在C端片斷加入1Da(H)]。在離子阱質譜儀中使用電噴霧離子化源，進行該668Da高能量碰撞誘導的分解(CID)。在圖4中示出該觀察到的ESIMS/MS碎裂模式。在651Da處的強峰對應於NH3從C端容易地丟失表明存在C端醯胺化。Conus肽經常進行轉錄後修飾，往往觀察到具有醯胺化(14，15)。在245Da處確定的b2離子對應於該已通過MALDI MS/MS確認的-FP-片斷，使得迅速識別C端三肽為-WGY-醯胺。最終確定的序列是FHGGSWYRFPWGY-NH2，對應於經計算的平均質量1659.8Da(在ESI MS中觀察到的平均質量＝1659.3Da)。
質譜分析法從裝配有單個四極分析儀的Hewlett Packard，HP 1100 MSD系列分光計獲得電噴霧電離(ESI)質譜。該數據以陽離子模式在300至1500m/z的範圍內獲得並使用HP LC/MSDChemstation軟體進行分析。以反射陽離子模式使用裝配有337nm的氮氣雷射器的Bruker Daltonics，Ultraflex TOF/TOF系統收集MALDI光譜。通過混合等體積的肽溶液和飽和基質(α-氰基-4-羥肉桂酸)製備樣品。使用標準肽混合物作為外校準。從Esquire 3000聯用LC離子阱質譜儀(Bruker Daltonics，德國)上獲得ESI MS/MS數據。施於噴霧器的氮氣壓力和流速分別為10巴和51min-1，乾燥氣體的溫度為300℃。掃描範圍設定在50至1000m/z。將該樣品溶解於1∶1(v/v)比例的水和含有0.1％HCOOH的乙腈並以120μl h-1的流速直接注入通過注射泵(Cole-Parmer，Vernon Hills，Illinois，美國)輸送的系統。使用氦作為CID試驗的碰撞氣體。使用Esquire數據分析軟體，3.1版，分析數據。
Edman測序通過使用裝配有LC-10A HPLC系統的Shimadzu PPSQ-10蛋白測序儀確定該肽的初級序列。
實施例3(Mo 1659序列的確認)通過兩種獨立的方法實現該已確定序列的證實。首先，製備對應於該確定的Mo1659序列的合成肽且其MS/MS碎片模式顯示與天然產物的碎片模式相同(圖5)。通過HPLC(圖5，插入物)分析同樣確認了該合成和天然肽的一致性。其次，使用自動測序儀的傳統Edman測序證實了該序列。Mo1659值得注意的特點是在一段13殘基的短序列中存在多達七個芳香族胺基酸(F-2、Y-2、W-2、H-1)。帶正電的肽顯著缺乏普通脂肪族，疏水胺基酸如Ala、Val、Leu和Ile。
實施例4(conopeptide Mo1650的新穎性)現有蛋白序列資料庫的檢索顯示與該已確定的Mo1659序列不匹配。通過不同資料庫檢索確認了該肽的唯一性，使用不同運算法則如下述Blast，BlastP等序列FHGGSWYRFPWGY(SEQ ID NO 1)的唯一性序列FHGGSWYRFPWGY的唯一性在以下方法中示出用Prosite檢索該序列F-H-G-G-S-W-Y-R-F-P-W-G-Y(SEQ ID NO 1)最近該序列在PDB，Swissprot，TrEMBL，TrEMBL中檢索該序列。沒有發現命中記錄。
同樣用Prosite檢索下面的變體[FY]-H-G-G-S-W-[YF]-[RK]-[FY]-P-W-G-[YF]沒有發現命中記錄。
實施例5(分析肽的鉀通道活性)DRG神經元製備按以下製備用於電生理研究的背根神經元(DRG)用二乙醚麻醉出生後第五天的雄Wistar大鼠。將整個脊柱分離並轉移至含有預充氧的磷酸鹽緩衝的鹽水中。在保持此脊柱下將來自脊柱背根的骨條切去。將該背根神經節與背和腹根一起用微細解剖鉗單獨地取出並轉移至含有1.5mg ml-1胰蛋白酶(來自豬胰腺，Sigma，美國)的磷酸緩鹽衝的鹽水中。用解剖彈簧剪(dissecting spring scissors)將該DRGs切碎，並在37℃溫育30分鐘。在胰白酶處理之後，該細胞通過在1000rpm下離心5分鐘來沉澱。移去上層清液，並用1ml含10％FBS的DMEM洗滌。隨後重新懸浮於含10％FBS的新制的DMEM中，通過使用火焰拋光的巴斯德吸液管研碎來獲得單細胞懸浮液。為增加細胞密度，將局部加工的8mm直徑光學拋光的玻璃環放置在消過毒的35mm組織培養皿的底部上。將該懸浮細胞置於由該玻璃環形成的井中。將該細胞在37℃下培養1小時。將已分離的神經元用於電生理試驗。
電生理用EPC-8放大器(Heka)記錄在整個細胞模型中使用膜片鉗技術分離的來自DRG神經元的K+電流。具有1-3mega-ohm電阻的膜片鉗電極是由用硼矽酸鹽玻璃(英國的Clark Electromedical Instruments)製成的。外浸浴液包含(以mM計)130氯化膽鹼、3KCl、2.5CoCl2、0.6MgCl2、10Hepes、1.2NaHCO3和10葡萄糖，pH7.4(用Tris鹼)；摩爾滲透壓濃度325mosmol，用蔗糖調節。內浸浴液包含(以mM計)140KCl、1CaCl2、2H2O、2MgCl2·6H2O、11EGTA、10Hepes，pH7.2(用Tris鹼)；摩爾滲透壓濃度310mosmol。在所有試驗中將該神經元電壓夾持在-80mV下。使用P/4減少方案來進行容量和漏電流減少。在所有試驗中使用50％Rs補償來將電壓誤差最小化。用pClamp8軟體和Digidata 1320模擬/數字轉化儀(AxonInstruments Inc.)來控制數據獲得和脈衝方案。將浴溫度保持在20℃。將該毒素溶於水中。使用該毒素的丸劑以達到最終浴濃度200nM。這裡報導的Mo1659對K+電流的影響是在施用肽15分鐘之後記錄的。
Mo1659顯示在DRG神經元中K+通道調節活性。圖6示出Mo1659對來自DRG神經元的混合全細胞外向K+電流中的影響。對外浴液中的200nM Mo1659A觀察到在所有電位中電流幅度的顯著減低。該混合K+電流具有快速的瞬時電流和持續電流成分。用兩種不同的預脈衝電壓接著用在圖7中圖示的相同電壓方案，來從持續電流中分割快速時電流成分。雖然僅使用調節預脈衝電壓(18)不能完全分割K+電流，但其結果表明在外浴液中添加Mo1659明顯影響持續K+電流成分。注意到Mo1659對隨著電流痕跡的減少獲得的瞬時電流成分的影響不顯著。在5個不同的試驗中得到類似的結果。因此Mo1659似乎影響非不活化電壓依賴鉀通道。通過阻斷鉀通道來減低在應激細胞中總K+電流是開發用於心律失常和心臟衰竭的療法的重要方法。開發新類型抗心律失常劑的可能策略是用鉀通道阻斷劑來增強動作電位的持續時間。
實施列6(生產Mo1659 Monile肽的方法)從蝸牛毒液中純化樣品，Conus monile收集自印度東南海岸。解剖後的毒液管保存在乙醇中且滲出的毒液在旋轉蒸發儀中濃縮之後進行高效液相色譜(HPLC)純化。毒液粗提物施於Jupiter 4μ，Proteo 90，C18柱上(10mm×250mm)並用含0.1％TFA的乙腈線性梯度洗脫。流速保持在1ml min-1且在226nm下監測吸光率。在保留時間23.4分鐘時的強成分為所要的Mo1659肽。此部分的同質性通過用HPLC在分析柱(Zorbax C18 RP，300孔徑大小，5μ顆粒大小)中的再次分析證明。此外，通過LC-ESI和MALDI質譜證明此肽的識別以及無汙染物。
將由此獲得的肽進行電生理活性檢測並保存在+4℃備用。
實施例7(Monile肽的化學合成，Mo 1659)使用Fmoc化學通過標準固相肽合成方法合成該肽。所有胺基酸在N端用Fmoc基團(Nova Biochem)保護。Tyr和Ser側鏈用t-Bu基團保護，Arg用Mtr基團，His用三苯甲基基團保護。在Fmoc-Rink醯胺AM樹脂(200-400目，Nova Biochem)上使用被保護胺基酸的OPfp酯進行偶合反應。用具有0.63mMg-1珠容量的300mg樹脂進行合成。通過用來自固體支持物的氨基功能基團形成醯胺鍵將C端胺基酸(Tyr)連接至樹脂。通過使用HBTU(N-[(1H-苯並三唑-1-基)(二甲氨基)亞甲基]-N-甲基甲銨(methanaminium)六氟磷酸鹽N-氧化物)將Ser和His偶合。在二甲基甲醯胺中用20％哌啶進行Fmoc去保護。在合成之後使用含5％苯甲醚(400μl)和1％乙二硫醇(80μl)的94％TFA(7.52ml)作為陽離子清除劑將肽從100mg樹脂上切下。在5-6小時之後將樹脂濾出，在真空中通過蒸發除去TFA且該肽用醚沉澱。用醚重複洗滌該沉澱並通過RP HPLC純化。
可以通過重組DNA技術利用本發明描述肽序列的優點，並基於可從每一胺基酸已知的三聯體密碼產生DNA序列來生產此肽。如此得到的該DNA序列可以合成/相關的基因序列可以從使用如cDNA克隆、聚合酶鏈式反應等方法從蝸牛DNA中獲得並克隆進在原核或真核表達系統中的表達載體中。通過已知方法可以設計如此獲得的克隆以生產肽Mo1659並通過已知方法純化至同質。
權利要求
1.一種具有胺基酸序列FHGGSWYRFPWGY(SEQ ID NO1)的基本上純的肽。
2.根據權利要求1所述的基本上純的肽，其中該肽用作鉀通道調節劑。
3.根據一種製備根據權利要求1的基本上純的肽的方法，包括(i)分離該肽，和(ii)通過色譜法純化該肽。
4.根據權利要求3所述的製備基本上純的肽的方法，其中，在步驟(i)中的該肽分離自一種食蟲圓錐蝸牛的毒液。
5.根據權利要求4所述的製備基本上純的肽的方法，其中，該食蟲圓錐蝸牛是Conus monile。
6.根據權利要求3所述的製備基本上純的肽的方法，其中，該純化步驟(ii)通過HPLC(高效液相色譜)進行。
7.根據權利要求1的基本上純的肽，其中，該肽用於治療神經生理學和神經學上的病症。
8.根據權利要求7所述的基本上純的肽，其中，該肽用於治療在精神分裂症、癲癇症、躁鬱症中或在影響神經系統的綜合症中的神經生理學和神經學上的病症。
9.一種具有或不具有藥學上可接受載體的包含具有胺基酸序列FHGGSWYRFPWGY(SEQ ID NO1)的肽的藥物組合物。
全文摘要
已從食蟲圓錐蝸牛，Conus monile，的毒液中分離出一種新的13殘基肽Mo1659。該毒液提取物的HPLC級分產生具有1659Da質量的強UV吸收級分。使用基質輔助雷射解吸電離和電噴霧MS/MS方法結合蛋白水解片斷分析從頭測序成功地給出了胺基酸序列，FHGGSWYRFPWGY－NH
文檔編號A61K38/10GK1972957SQ200480042803
公開日2007年5月30日 申請日期2004年10月8日 優先權日2004年2月20日
發明者寇扎爾曼淖姆·撒布拉曼尼阿撒斯特利·克利施南, 帕德瑪那汗·巴拉蘭姆 申請人:國家生命科學中心