一種生產重組混合l-阿拉伯糖異構酶的方法

2024-02-29 16:05:15

專利名稱：一種生產重組混合l-阿拉伯糖異構酶的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及構建微生物工程菌生產重組蛋白。具體是應用微生物工程菌生產重組混合L-阿拉伯糖異構酶。
背景技術：
L-阿拉伯糖異構酶(L-arabinose isomerase EC 5. 3. I. 4)是由微生物產生的、具有變構作用的酶。L-阿拉伯糖異構酶能催化L-阿拉伯糖為L-核酮糖；由於L-阿拉伯糖和D-半乳糖結構的相似性，故L-阿拉伯糖異構酶也能催化D-半乳糖異構為D-塔格糖。D-塔格糖是甜味劑，具有低能量，降低血糖和抗齲齒等功能。雖然多種微生物具有產生L-阿拉伯糖異構酶的功能，但是，當前的塔格糖產品仍然是主要來源於化學合成。化學合成D-塔格糖的工序複雜，生產價格高，並且產生大量中間產品汙染環境。應用L-阿拉伯糖異構酶將廉價的D-半乳糖異構為D-塔格糖，操作簡單，如果有合適的L-阿拉伯糖異構酶那麼這一生產方式獲得的D-塔格糖將是價格便宜。異構D-半乳糖異構為D-塔格糖的理想反應條件是pH5. 0-6. 0，> 60°C，並且，反應溫度越高，反應速度就越快。前者有利於減少中間副產品的生成，後者有利於D-半乳糖異構為D-塔格糖。雖然多種微生物具有產生L-阿拉伯糖異構酶的功能，但是，至今目前尚未發現符合最適PH5. 0-6. O並且最適溫度> 60°C的L-阿拉伯糖異構酶，從而影響了用L-阿拉伯糖異構酶生產D-塔格糖產業的發展。畢赤酵母(P.pastoris,)是最近迅速發展的一種真核表達宿主,營養要求不高，適合於大規模生產方式，由於畢赤酵母分泌自身的蛋白很少，有利於表達產物的純化。

發明內容
雖然來源於新阿波羅棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)的L-阿拉伯糖異構酶最適pH 7,最適合溫度80°C,但是在80°C和pH6的條件下其L-阿拉伯糖異構酶仍然具有89%的它在最適溫度和最適pH條件的酶活性；雖然來源於嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的L-阿拉伯糖異構酶最適pH 7. 5,最適溫度80°C,但是,在80°C和PH6的條件下其L-阿拉伯糖異構酶仍然具有63%的它在最適溫度和最適pH條件的酶活性；雖然來源於大腸桿菌(Escherichia coli)的L-阿拉伯糖異構酶最適pH 5. 8,最適合溫度55°C，但是在80°C和pH6的條件下其L-阿拉伯糖異構酶仍然具有32%的它在最適溫度和最適PH條件下的酶活性。從上述可見，在符合工業用途的80°C和pH6的條件下，這三種不同來源的L-阿拉伯糖異構酶都是具有酶活性的，只是酶活性低於最適的溫度和最適PH條件的酶活性。但是，在80°C和pH6的條件下上述這三種酶的活力之和顯著高於其中的任何單種酶在它的最適溫度和最適PH條件下的酶活性。若能增加酶的產量將能彌補它由於偏離最適合反應條件所造成的酶活性的損耗。本發明的目的是為了解決含單種L-阿拉伯糖異構酶基因的菌株生產的L-阿拉伯糖異構酶不能滿足當前用L-阿拉伯糖異構酶異構D-半乳糖生產D-塔格糖的需求的問題，構建含嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、新阿波、羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌，生產重組混合嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶、新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶，通過增加酶的產量來彌補它們由於偏離最適合反應條件所造成的酶活性的損耗。本發明所採用的技術方案是I.克隆酶基因應用PCR技術，從嗜熱脂肪芽孢桿菌基因組中克隆L-阿拉伯糖異構酶基因，從新阿波羅棲熱袍菌基因組中克隆L-阿拉伯糖異構酶基因，從大腸桿菌基因組中克隆L-阿拉伯糖異構酶基因。2.獲得構建表達載體所需的啟動子，重組序列，信號肽，轉錄終止子序列和抗性基因。 3.構建如附圖的畢赤酵母表達載體。4.將以上構建的含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母。篩選高表達新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶的重組子作為含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌。5.發酵含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌生產重組混合L-阿拉伯糖異構酶。本發明構建含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌生產重組混合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶的優勢在於I.含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌表達的L-阿拉伯糖異構酶的產量明顯高於用含單種以上所述的酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌表達的L-阿拉伯糖異構酶的產量。2.由於畢赤酵母工程菌表達的新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶在pH6. 0和80°C (符合異構D-半乳糖為D-塔格糖的生產條件要求)都具有異構D-半乳糖為D-塔格糖的酶活性，這種混合L-阿拉伯糖異構酶能夠混合應用於異構D-半乳糖為D-塔格糖。


附圖.含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體p.畢赤酵母三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子；S. α因子信號肽；Genel.新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因；Gene 2.嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因；Gene3.大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因；TT.轉錄終止子序列；G418.抗性基因(應用於篩選畢赤酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌複製起點；AMP.氨苄青黴素抗性基因(應用於篩選大腸桿菌轉化子)；p. pastoris rDNA.畢赤酵母的rDNA序列。
具體實施例方式下面用非限定性實施例對本發明作進一步說明。實施例I :I. I構建含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢·桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體I. I. I構建克隆載體由專業的DNA序列合成公司合成含氨苄青黴素(AMP)基因序列，多克隆接頭和大腸桿菌複製起點的兩條鹼基互補的雙鏈，並且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pPL。1.1.2獲取基因①PCR擴增新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因引物I:5』 ccGAATTCatgatcgatctcaaacagtat3 [說明5』 的 8 個喊基是酶切保護喊基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]引物2:5，AAGCGGCCGCTTA ATGATGATGATGATGATG tctttttaaaagtccccagtagagttcgttcc3』提取新阿波羅棲熱袍菌的基因組DNA，以新阿波羅棲熱袍菌的基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴增出符合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因大小的擴增帶。PCR產物經DNA序列測定和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明其PCR擴增帶是新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因。②PCR擴增嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因。引物I :5』 gctacgtaatgctgtcattacgtccttatgaattttgg3> [說明5』 的 8 個喊基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]引物2:5，CAGCGGCCGCTTA ATGATGATGATGATGATG ccgcccccgccagaatacttcattccatc3，[說明5』的10個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(8個鹼基)，方框中的18個鹼基是編碼6個組氨酸的DNA序列。]提取嗜熱脂肪芽孢桿菌的基因組DNA，以嗜熱脂肪芽孢桿菌的基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴增出符合嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因大小的擴增帶。PCR產物經DNA序列測定和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明其PCR擴增帶是嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因。③PCR擴增大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因序列。引物I :gcGAATTCatgacgatttttgataattatg3』 [說明5』 的 8 個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]引物2:5，CAGCGGCCGCCTA ,ATGATGATGATGATGATG gcgacgaaatccgtaatacacttcgtt3，[說 明5』的10個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個鹼基)，方框中的18個鹼基是編碼6個組氨酸的DNA序列。]提取大腸桿菌基因組DNA，大腸桿菌基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴增出符合大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因大小的擴增帶。PCR產物經DNA序列測定和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因序列。I. I. 3分別構建新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架(表達框架的DNA序列組成啟動子-a因子信號肽-基因-轉錄終止子)。①用PCR擴增畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列。提取畢赤酵母的基因組DNA，應用以基因組DNA為模板，應用如下引物(5』CCTACGTAGGATCCTITITTGTAGAAATGTC3』，5』GGGCATGCTGTGTITTGATAGITGTTCAA 3』 ；)進行 PCR 擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列[如下序列的5』端和3』端的有下劃線的8個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列]:CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCG TTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGT CTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCC CTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAA AAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAA AGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAAT TGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC[說明畢赤酵母基因組DNA提取方法將畢赤酵母細胞加於9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L山梨醇溶解)於30°C振搖30分鐘，然後按照常規的細菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]②由專業的DNA序列合成公司合成a因子信號肽[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是a因子信號肽序列]:
CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由專業的DNA序列合成公司合成轉錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是轉錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAA GAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAG GATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGG TAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTG AGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC
④用套疊PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤從畢赤酵母基因組中PCR擴增rDNA序列PCR 引物引物I :5，CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3>引物2 :5，CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，說明引物的5』端的8個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位(有下劃線的6個鹼基)。提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。⑥表達框架構建過程A.含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的構建通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組於pPL載體的多克隆位點；將a因子信號肽DNA序列重組於pPL載體的多克隆位點，並使其位於啟動子序列的下遊；將新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因序列重組於PPL載體的多克隆位點，並使其位於a因子信號肽DNA序列的下遊；將轉錄終止子DNA序列重組於pPL載體的多克隆位點，並使其位於基因序列下遊。此含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的載體稱為pPLl。B.含嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的構建通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組於pPL載體的多克隆位點；將a因子信號肽DNA序列重組於pPL載體的多克隆位點，並使其位於啟動子序列的下遊；將嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因序列重組於PPL載體的多克隆位點，並使其位於信號肽序列的下遊；將轉錄終止子序列重組於PPL載體的多克隆位點，並使其位於基因序列下遊。此含嗜熱脂肪芽孢桿菌的 L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的載體稱為pPL2。C.含大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的構建通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，將畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組於pPL載體的多克隆位點；將a因子信號肽DNA序列重組於pPL載體的多克隆位點，並使其位於啟動子序列的下遊；將大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因序列重組於pPL載體的多克隆位點，並使其位於啟動子的下遊；將轉錄終止子序列重組於pPL載體的多克隆位點，並使其位於基因序列下遊。此含大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的載體稱為PPL3。⑦完成表達載體的構建A.將三套表達框架組裝於同一個克隆載體。通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，分別切取pPL2載體和pPL3載體表達框架，並將切下的這兩套表達框架依次插入於pPLl的多克隆位點。此載體稱為PPL123.B.通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用依次將畢赤酵母的rDNA (DNA重組序列)和G418基因重組於pPL123載體的多克隆位點，構成含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體(附圖)。I. 2構建含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌用電轉化方法將含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母GS115，將經過電轉化的GS115細胞塗布G418抗性平板。以重組子(在G418抗性平板上生長的克隆)基因組DNA為模板，分別用新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因特異引物、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因特異引物和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因特異引物進行PCR進行擴增，將擴增出符合目標分子量的PCR產物進行DNA序列測定而驗證獲得了正確的重組子。將含以上含三種L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母重組子接種於YPD[2%蛋白腖，1% yeastextract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培養基中，30°C搖床培養兩天，將發酵液離心，收穫上清。應用發酵液進行SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)，其結果表明出現新的符合這三個基因編碼的酶蛋白分子量的蛋白條帶。用His6融合蛋白純化試劑盒純化目標蛋白，用His標籤單克隆抗體對純化的兩種目標蛋白進行蛋白印跡實驗，結果表明這三種目標蛋白都能與His標籤單克隆抗體結合，證明新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因都能在畢赤酵母中表達和分泌到胞外。篩選高表達以上所述的三種L-阿拉伯糖異構酶的重組子作為含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌。I. 3生產重組混合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶
分別將含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌，只含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、只含嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌、只含大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和不含L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母分別接種於YPD培養基中，30°C搖床培養兩天。分別收集其發酵液上清於PH6和80°C與D-半乳糖反應，然後測定D-塔格糖含量，根據D-塔格糖產量換算為L-阿拉伯糖異構酶活性並將結果記錄於表I。表I結果表明含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的發酵液中的L-阿拉伯糖異構酶活性明顯高於含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌發酵液中的L-阿拉伯糖異構酶活性，也高於含嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的發酵液中的L-阿拉伯糖異構酶活性和含大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的發酵液中的L-阿拉伯糖異構酶活性，並且，前者的L-阿拉伯糖異構酶活性約是後三者的L-阿拉伯糖異構酶活性之和；表I結果還表明，在pH6和80°C條件下，混合L-阿拉伯糖異構酶活性明顯高於其中任何一種L-阿拉伯糖異構酶在其最適的pH和溫度下的酶活性。表I.發酵液的L-阿拉伯糖異構酶活性
權利要求
1.一種生產重組混合L-阿拉伯糖異構酶的方法。其特徵在於應用分子生物學技術克隆新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因，構建含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體；將上述構建的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母從而獲得畢赤酵母重組子；篩選高表達重組混合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶的畢赤酵母重組子作為含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌；用含新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌生產重組混合新阿波羅棲熱袍菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因編碼的L-阿拉伯糖異構酶。
2.根據權利要求I所述一種生產重組混合L-阿拉伯糖異構酶的方法，其特徵在於利用權利要求I所述的生產重組混合L-阿拉伯糖異構酶的方法製備重組混合L-阿拉伯糖異構酶產品。
3.根據權利要求I所述的一種生產重組混合L-阿拉伯糖異構酶的方法，其特徵在於將按照權利要求I所述的生產重組混合L-阿拉伯糖異構酶的方法生產的重組混合L-阿拉伯糖異構酶，應用於製備D-塔格糖產品。
全文摘要
本發明公開了一種生產重組混合L-阿拉伯糖異構酶的方法。屬生物技術領域。首先分別克隆嗜熱脂肪芽孢桿菌、新阿波羅棲熱袍菌和大腸桿菌的L-阿拉伯糖異構酶基因；構建含這三種L-阿拉伯糖異構酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體，並將其載體轉化畢赤酵母獲得工程菌；發酵畢赤酵母工程菌生產重組混合L-阿拉伯糖異構酶。這種重組混合酶不僅酶活性明顯高於用畢赤酵母表達其中的單種酶，而且在pH6.0和80℃(符合異構D-半乳糖為D-塔格糖的生產條件要求)具有高的異構D-半乳糖為D-塔格糖的酶活性。本發明有利於解決因尚無符合最適pH5.0-6.0並且最適溫度＞60℃的L-阿拉伯糖異構酶生產菌株而制約酶法生產D-塔格糖產業發展的問題，促進酶法生產D-塔格糖產業發展。
文檔編號C12N15/61GK102719463SQ201210141968
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月2日 優先權日2012年5月2日
發明者尹慧祥, 崔豔豔, 張添元, 張愛聯, 陳麗萍 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所