一種生產重組混合異澱粉酶的方法
2024-02-29 16:16:15
專利名稱：一種生產重組混合異澱粉酶的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及構建微生物工程菌生產重組蛋白。具體是應用微生物工程菌生產重組混合異澱粉酶。
背景技術：
異澱粉酶(Isoamylase EC 3. 2. I. 68),亦稱α -1,6_葡萄糖苷酶,支鏈澱粉酶。異澱粉酶廣泛存在於微生物界，現已知產異澱粉酶的微生物有細菌和真菌兩大類。異澱粉酶能夠水解支鏈澱粉分支點的α-1，6_葡萄糖苷鍵，催化支鏈澱粉、糖原及某些分支糊精中 的α_1，6糖苷鍵的斷裂反應。異澱粉酶廣泛應用於澱粉エ業生產、啤酒生產、飼料エ業和飲食等行業。不同的用途對於異澱粉酶作用的適合溫度和PH有著不同的要求。當前市場上的異澱粉酶產品是來源於天然菌株生產的異澱粉酶，當前的異澱粉酶產品的適合反應溫度範圍和適合反應pH範圍窄，不能滿足當前市場的需求。由於異澱粉酶有多種來源，那麼，不同來源的異澱粉酶的基因序列可不相同，不同來源的異澱粉酶的理化特性可不相同。畢赤酵母(Pichia pastoris, P. pastoris)是最近迅速發展的ー種真核表達宿主，營養要求不高，適合於大規模生產方式，分泌很少的自身蛋白，表達的外源蛋白容易純化。
發明內容
根據異澱粉酶有多種來源，不同來源的異澱粉酶的基因序列可不相同，不同來源的異澱粉酶的理化特性可不相同，如果將某些不同理化特性的異澱粉酶基因重組於同一個細胞的基因組進行表達，那麼，所表達的混合異澱粉酶將具有理化特性多祥性，即具有多個最適溫度和最適pH。這種混合酶將比其中單種酶的使用價值高。來源於解澱粉假單胞桿菌(Pseudomonas amyloderamosa)的異澱粉酶最適合pH 5. 6,最適溫度是56°C ;來源於軟腐細菌(Pectobacterium chrysanthemi)的異澱粉酶最適pH7,最適溫度40°C。由於這兩種酶的功能相同，若將這兩種酶聯合應用，就有兩個最適合的PH反應點和溫度反應點，那麼，其用途將比其中的単獨酶廣。若分別用不同的菌株來表達這兩種酶，其生產成本將高於用一個菌株同時生產這兩種酶的混合酶。本發明構建含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌，生產重組混合解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因編碼的異澱粉酶和軟腐細菌的異澱粉酶基因編碼的異澱粉酶。本發明所採用的技術方案是I.克隆酶基因應用PCR技木，分別從解澱粉假單胞桿菌基因組和軟腐細菌基因組中擴增異澱粉酶基因。2.獲得應用於表達載體構建所需的啟動子，重組序列，信號肽，轉錄終止子和抗性基因。3.構建如附圖的含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體。
4.應用電轉化法將含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母基因組。[說明.表達框架啟動子-信號肽-基因-轉錄終止子]5.篩選高表達解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因編碼的異澱粉酶和軟腐細菌的異澱粉酶基因編碼的異澱粉酶的重組子作為含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌。6.發酵畢赤酵母工程菌生產重組混合異澱粉酶。本發明構建含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌生產重組混合異澱粉酶的優點體現於
本發明通過構建畢赤酵母工程菌，應用工程菌生產兩種重組異澱粉酶的混合酶產品，一方面提供最適pH7和最適pH5. 6,最適溫度40°C和50°C的混合異澱粉酶新產品，另ー方面取代發酵含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因的菌株生產異澱粉酶，發酵含軟腐細菌的異澱粉酶基因的菌株生產異澱粉酶。即用ー個發酵エ序生產兩種異澱粉酶取代用兩個エ序分別生產兩種異澱粉酶。達到節省原材料、能耗和人力資源的作用。
附圖.含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體。p.畢赤酵母三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子；S. α因子信號肽；genel.解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因；gene2.軟腐細菌的異澱粉酶基因；TT.轉錄終止子；G418. G418抗性基因(應用於篩選畢赤酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌複製起點；AMP.氨苄青黴素抗性基因(應用於篩選大腸桿菌轉化子)；p. pastoris rDNA.畢赤酵母的rDNA序列。
具體實施例方式下面用非限定性實施例對本發明作進ー步說明。實施例I :I. I構建含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母組表達載體I. I. I構建克隆載體由專業的DNA序列合成公司合成含氨苄青黴素(AMP)基因序列，多克隆接頭和大腸桿菌複製起點的兩條鹼基互補的雙鏈，並且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pPM。I. I. 2猶取基因①PCR擴增解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因引物I :5』 ggTTCGAAgccatcaacagcatgagcct3 [說明5』 的 8 個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]引物 2 : 5，C A GCGGCCGCC T A 區 TGATGATGATGATGATG
cttggagatcaacagcagcagcgat3』 [說明5』的10個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和酶識別位點(8個鹼基)，方框中的18個鹼基是編碼6個組氨酸的DNA序列。]
提取解澱粉假單胞桿菌基因組DNA，以解澱粉假單胞桿菌基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴增出符合解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因大小的擴增帯。PCR產物經DNA序列測定和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因序列。②PCR擴增軟腐細菌的異澱粉酶基因引物I :5』 gctacKtaatgggtgaactgttggcggg3 [說明5』 的 8 個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]引物2:5， CAGCGGCCGCTTA ATGATGATGATGATGATG ttgttttaccagtacgcacaccgcatt3，[說
明5』的10個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和酶識別位點(8個鹼基)，方框中的18個 鹼基是編碼6個組氨酸的DNA序列。]提取軟腐細菌基因組DNA，以軟腐細菌基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳證明PCR擴增出符合軟腐細菌的異澱粉酶基因大小的擴增帯。PCR產物經DNA序列測定和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是軟腐細菌的異澱粉酶基因。I. I. 3分別構建含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架。①用PCR擴增畢赤酵母的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列。提取畢赤酵母的基因組DNA，應用以基因組DNA為模板，應用如下引物(5』 CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTC3』，5』 GGGCATGCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAA 3』 )進行 PCR 擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是其三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列[如下序列的5』端和3』端的有下劃線的8個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和酶識別位點出個鹼基)，沒有下劃線的是三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列]:CCTACGTAGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTCGTCCAATCAGGTAGCCATCTCTGAAATATCTGGCTCCG TTGCAACTCCGAACGACCTGCTGGCAACGTAAAATTCTCCGGGGTAAAACTTAAATGTGGAGTAATGGAACCAGAAACGT CTCTTCCCTTCTCTCTCCTTCCACCGCCCGTTACCGTCCCTAGGAAATTTTACTCTGCTGAGAGCTTCTTCTACGGCCCC CTTGCAGCAATGCTCTTCCCAGCATTACGTTGCGGGTAAAACGGAGGTCGTGTACCCGACCTAGCAGCCCAGGGATGGAA AAGTCCCGGCCGTCGCTGGCAATAATAGCGGGCGGACGCATGTCATGAGATTATTGGAAACCACCAGAATCGAATATAAA AGGCGAACACCTTTCCCAATTTTGGTTTCTCCTGACCCAAAGACCTTAAATTTAATTTATTTGTCCCTATTTCAATCAAT TGAACAACTATCAAAACACAGCATGCCC[說明畢赤酵母基因組DNA提取方法將畢赤酵母細胞加於9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)於30°C振搖30分鐘，然後按照常規的細菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA。]②由專業的DNA序列合成公司合成α因子信號肽[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是α因子信號肽序列]:CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC③由專業的DNA序列合成公司合成轉錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是轉錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCG GTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCT TCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTC TTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGG GGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGT ACAGAAGATTAAGTGAGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCC④用套疊PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]
GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGG⑤從畢赤酵母基因組中PCR擴增rDNA序列PCR 引物引物I :5，CCGGTACCggcttccaggacgtatcgcggatcgctgcgttcttcatc3>引物2 :5， CCTTCGAAagccccgtggcacacgaccaatcttcccagccgaca 3，說明引物的5』端的8個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和酶識別位(有下劃線的6個鹼基)。提取畢赤酵母基因組DNA，以基因組DNA為模板，應用引物I和引物2進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是畢赤酵母基因組中的rDNA序列。⑥表達框架構建過程A.含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架的構建通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，將三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組於pPM載體的多克隆位點；將α因子信號肽DNA序列重組於pPM載體的多克隆位點，並使其位於啟動子序列的下遊；將PCR擴增獲得的解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因序列重組於PPM載體的多克隆位點，並使其位於信號肽序列的下遊；將轉錄終止子序列重組於pPM載體的多克隆位點，並使其位於基因序列下遊。此含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架的載體稱為PPM1。B.含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的構建通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，將三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組於pPM載體的多克隆位點；將α因子信號肽DNA序列重組於pPM載體的多克隆位點，並使其位於啟動子序列的下遊；將PCR擴增獲得的軟腐細菌的異澱粉酶基因序列重組於PPM載體的多克隆位點，並使其位於信號肽序列的下遊；將轉錄終止子序列重組於PPM載體的多克隆位點，並使其位於基因序列下遊。此含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的載體稱為PPM2。⑦完成畢赤酵母表達載體的構建A.將兩套表達框架組裝於同一個克隆載體。
·
通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，切下pPM2載體的表達框架，並將其切下的表達框架重組於PPMl的多克隆位點。此載體稱為pPM12.B.通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用依次將畢赤酵母的rDNA序列(DNA重組序列)和G418基因重組於pPM12載體的多克隆位點，構成含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體(附圖)。I. 2構建含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌用電轉化方法將以上構建的畢赤酵母表達載體(見附圖)轉化畢赤酵母GS115，將經過電轉化的GSl 15細胞塗布G418抗性平板。以重組子(在G418抗性平板上生長的克隆)基因組DNA為模板，分別用解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因的特異引物和軟腐細菌的異澱粉酶基因的特異引物進行PCR進行擴増，將擴增出符合目標分子量的PCR產物進行DNA序列測定而驗證獲得了正確的重組子。將含以上含兩種異澱粉酶基因表達框架的重組子在接種於YPD[2%蛋白腖，1% yeast extract (酵母提取物)，2%葡萄糖]培養基中，30°C搖床培養兩天，將發酵液離心，收穫上清。應用發酵液進行SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)，其結果表明出現新的符合這兩個基因編碼的酶蛋白分子量的蛋白條帶。用His6融合蛋白純化試劑盒純化目標蛋白，用His標籤單克隆抗體對純化的兩種目標蛋白進行蛋白印跡實驗，結果表明這兩種目標蛋白都能與His標籤單克隆抗體結合，證明解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因和軟腐細菌的異澱粉酶基因都能在含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母中表達和分泌到胞外。篩選高表達以上所述的兩種混合異澱粉酶的重組子作為含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌。I. 3生產重組混合解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因編碼的異澱粉酶和軟腐細菌的異澱粉酶基因編碼的異澱粉酶分別將含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌，只含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌，只含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌和不含異澱粉酶基因的畢赤酵母分別接種於YPD培養基中，30°C搖床培養兩天。分別收集其發酵液上清於兩個條件(①pH 5. 6、56°C，②pH 7、40°C )測定異澱粉酶活性，將結果記錄於表I。表I結果表明含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和軟腐細菌的異澱粉酶因表達框架的畢赤酵母工程菌的發酵液在pH 5.6、56°C和pH 7、40°C都具有良好的酶活性，但是，含單種異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的發酵液只是在其中的ー個條件下具有良好的酶活性。含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉 酶基因表達框架和軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的發酵液在pH 5.6、56°C條件下和在pH 7、40°C的條件下的異澱粉酶活性約為含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的發酵液和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌的發酵液在同樣條件下的異澱粉酶活性之和。表I.發酵液水解異澱粉試驗試驗
權利要求
1.一種生產重組混合異澱粉酶的方法。其特徵在於應用分子生物學技術克隆解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因和軟腐細菌的異澱粉酶基因，構建含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體；將畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母從而獲得畢赤酵母重組子；篩選高表達以上所述的兩種異澱粉酶的畢赤酵母重組子作為含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌；用含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和含軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌生產重組混合異澱粉酶。
2.根據權利要求I所述一種生產重組混合異澱粉酶的方法，其特徵在於利用權利要求I所述的生產重組混合異澱粉酶的方法製備成混合異澱粉酶產品。
全文摘要
本發明公開了一種生產重組混合異澱粉酶的方法。屬生物技術領域。首先分別克隆解澱粉假單胞桿菌和軟腐細菌的異澱粉酶基因；構建含解澱粉假單胞桿菌的異澱粉酶基因表達框架和軟腐細菌的異澱粉酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體，並將其表達載體轉化畢赤酵母，篩選高表達以上所述的兩種異澱粉酶的重組子作為工程菌；發酵畢赤酵母工程菌生產重組混合異澱粉酶。與傳統的由單基因編碼的異澱粉酶不同，本發明生產的重組混合異澱粉酶出現酶反應的兩個最適溫度和pH，理化特性高，適合於多種用途；由於實現兩個酶基因同時在其畢赤酵母中表達，使其異澱粉酶產量顯著提高，起到降低生產成本的作用。
文檔編號C12R1/38GK102719420SQ201210141970
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月2日 優先權日2012年5月2日
發明者劉振旺, 張添元, 張愛聯, 易國輝, 羅進賢, 陳麗萍 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所