家蠶微孢子蟲DNA2基因及其應用的製作方法
2024-04-03 02:53:05
本發明屬於生物技術領域。更具體地，涉及一種來源於家蠶微孢子蟲的解旋酶和核酸酶dna2基因(dnareplicationatp-dependenthelicase/nucleasedna2-like)及其應用。
背景技術：
家蠶微孢子蟲病是病原家蠶微孢子蟲(nosemabombycis，n.b)經食下傳染或胚卵(胎)傳染，使家蠶感染髮病的一種毀滅性疫病。家蠶微孢子蟲是一類細胞內專性寄生的真核生物，之前一直屬於原蟲，近些年被劃分到真菌類。因其具有垂直傳播的特點使成為了家蠶病原微生物中最受人關注的一種，也因此成為家蠶病原微生物中唯一需要檢疫的疫病。從19世紀發現到現在，家蠶微孢子蟲病對各國的養蠶業造成巨大的損失。除此之外，其他不同的微孢子蟲也可侵害其他昆蟲如蜜蜂、蝗蟲，水產如魚，哺乳動物如兔、狗，甚至也可以感染到人類，造成人角膜炎、腦炎、腸炎等疾病。
最初人們對家蠶微粒子病的檢測主要根據顯微鏡下組織研磨液中的微孢子蟲的形態和大小進行，但是顯微鏡鏡檢的缺點是對操作人員的技術及經驗要求較高，很難區分不同種屬的微孢子蟲及其類似物。
隨著pcr技術的普及，人們開始使用pcr方法來檢測家蠶微孢子蟲並且達到了較高的靈敏度。現有技術中常用的靶基因ssurrna，研究發現，基於16srdna保守區段設計的引物檢測蠶卵微孢子蟲，經常會有非目的條帶出現，推測蠶卵抽提物中可能存在某種抑制物質幹擾了對病原基因dna的pcr有效擴增。發明人團隊也先後發現了多種適用於家蠶微粒子病pcr檢測的靶基因，具有較好的檢測效果，各有優勢和缺陷。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種家蠶微孢子蟲dna2基因。
本發明另一目的是提供該基因在檢測家蠶微孢子蟲方面的應用。
本發明上述目的通過以下技術方案實現：
本發明首先獲得了一個家蠶微孢子蟲dna2基因，其全長序列如seqidno.1所示。其orf框序列如seqidno.2所示。
所述家蠶微孢子蟲dna2基因編碼蛋白的胺基酸序列如seqidno.3所示。
同時，本發明設計了用於檢測的dna2基因的引物，並對一些其他桑園昆蟲進行了了dna2基因的特異性檢測，結果顯示，檢測引物f/r對家蠶微孢子蟲具有很好的特異性和靈敏性，因此，如下所述應用均應在本發明的保護範圍之內。
家蠶微孢子蟲dna2基因在家蠶微孢子蟲特異性檢測方面的應用。
家蠶微孢子蟲dna2基因在製備家蠶微孢子蟲特異性檢測試劑方面的應用。
一種特異性檢測家蠶微孢子蟲的檢測引物f/r，上下遊引物序列分別如seqidno.6和seqidno.7所示。
一種實時螢光定量pcr檢測家蠶微孢子蟲的方法，包括如下步驟：以待測樣品的總dna、中腸dna、或蠶卵dna為模板，以權利要求6所述的檢測引物f/r進行實時螢光定量pcr檢測；當擴增結果顯示為一條特異性388bp的條帶時，則待測樣品中含有或感染了家蠶微孢子蟲。
其中，所述實時螢光定量pcr檢測的pcr體系(20μl)為：sybrgreenmix10μl，forwrdprimer(10pmol/μl)0.5μl，reverseprimer(10pmol/μl)0.5μl，cdna2μl，ddh2o7μl。
所述實時螢光定量pcr檢測的反應程序為：95℃2min；95℃10s，55.5℃30s，72℃30s，40個循環；95℃1min，55.5℃30s，95℃30s，60℃15s。
另外，所述方法在家蠶微孢子蟲特異性檢測方面的應用，也在本發明的保護範圍之內。
不同的微孢子蟲也可侵害其他昆蟲如蜜蜂、蝗蟲，水產如魚，哺乳動物如兔、狗，甚至也可以感染到人類，造成人角膜炎、腦炎、腸炎等疾病。蠶桑生產環境較為複雜，混雜有其他種類的微孢子蟲。本發明dna2基因的發現對於治療和檢測的理論驗證和生產實踐均有一定的意義。
本發明具有以下有益效果：
本發明克隆獲得了一種家蠶微孢子蟲dna2基因，並以此為基礎提供了一組特異性檢測家蠶微孢子蟲的特異性檢測引物組，對家蠶微孢子蟲具有很好的特異性和靈敏性，在家蠶微孢子蟲的特異性檢測方面具有很好的應用前景。
而且，家蠶微孢子蟲dna2基因作為一個新發現的蛋白基因，具有潛在的功能應用，為家蠶微孢子蟲的相關研究提供了一個新的素材和基礎。
附圖說明
圖1為家蠶微孢子蟲dna2蛋白與其他物種dna2蛋白胺基酸系統發育樹(n-j)。註：bootstrap＝1000,圖中有下劃線的是本研究測定的家蠶微孢子蟲dna2蛋白胺基酸序列。
圖2為家蠶微孢子蟲dna2蛋白與其他物種dna2蛋白多重比對；1.家蠶微孢子蟲dna2蛋白，2.蜜蜂微孢子蟲brl01蛋白，3.蜜蜂微孢子蟲dna解旋酶蛋白，4.兔腦炎原蟲dna複製解旋酶蛋白，5.兔腦炎原蟲dna解旋酶蛋白，6.兔腦炎原蟲ecuniii-l蛋白，7.腸腦炎微孢子蟲dna解旋酶，8.線蟲dna複製解旋酶蛋白。
圖3為家蠶微孢子蟲dna2基因的pcr引物設計簡圖。
圖4中a、b、c分別為引物1f/r、2f/r、3f/r對幾種不同的微孢子蟲特異性pcr擴增的結果；註：m:dl2000marker；泳道：1.斜紋夜蛾微孢子蟲；2.桑螟微孢子蟲；3.玉米螟微孢子蟲；4.柞蠶微孢子蟲；5.浙江小孢子；6.家蠶微孢子蟲；7.正常家蠶中腸(陰性對照)；8.滅菌水。
圖5為檢測引物f/r對幾種不同的微孢子蟲特異性pcr擴增的結果；註：m:dl2000marker；泳道：1.斜紋夜蛾微孢子蟲；2.桑螟微孢子蟲；3.玉米螟微孢子蟲；4.柞蠶微孢子蟲；5.浙江小孢子；6.家蠶微孢子蟲；7.正常家蠶中腸(陰性對照)；8.滅菌水。
圖6為檢測引物f/r對家蠶微孢子蟲的檢測靈敏性；註：m:dl2000marker；泳道：1.10-1ng/uldna；2.10-2ng/uldna；3.10-3ng/uldna；4.10-4ng/uldna；4.10-4ng/uldna；5.10-5ng/uldna；6.無菌水。
圖7為感病家蠶中腸中n.bdna2基因的表達水平。
圖8為感病家蠶蠶卵中n.bdna2基因的表達水平。
具體實施方式
以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明採用的試劑、方法和設備為本技術領域常規試劑、方法和設備。
除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
實施例1dna2基因克隆
1、引物設計
同源性分析預測：通過與其他種微孢子蟲基因組基因進行同源性分析等手段，設計了家蠶微孢子蟲dna2基因序列編碼區的擴增引物orf-f/orf-r：
引物orf-f(seqidno.4所示)：
5'attatcatatgaacaacaataagtc3'；
引物orf-r(seqidno.5所示)：
5'atatgaagcttcataaaatctctaat3'。
2、pcr擴增和克隆
利用家蠶微孢子蟲基因組dna為模板，以引物orf-f/orf-r進行pcr擴增目的基因，將克隆的片段連接到pet28a載體上，然後送去公司(上海生工)進行測序，對測序結果進行驗證分析後，獲得家蠶微孢子蟲dna2基因全長序列如seqidno.1所示，編碼區序列如seqidno.2所示。
另外研究得出，家蠶微孢子蟲dna2基因所編碼蛋白序列如seqidno.3所示。
3、序列同源性分析
通過在微孢子蟲資料庫進行同源性比對，blast分析表明家蠶微孢子蟲dna2基因與庫中蛋白的同源性不高(如圖1和2所示)，而其對於微孢子蟲又極為重要，因此該基因是一種新發現的蛋白基因，家蠶微孢子蟲dna2基因是家蠶微孢子蟲的解旋酶和核酸酶基因，在dna的複製、修復、重組、轉錄等多個生理過程中具有不可替代的作用。
實施例2利用dna2基因檢測微孢子蟲
1、設計了如表1所示的檢測引物組(如圖3所示)：
表1家蠶微孢子蟲(廣東株)轉錄組的dna2基因驗證及檢測的pcr引物
2、檢測特異性
以幾種不同的微孢子蟲dna模板，利用上述引物進行pcr檢測，結果顯示，表1中的引物組均對家蠶微孢子蟲具有檢測特異性。如圖4和圖5所示。
3、檢測靈敏性
靈敏性檢測結果顯示，檢測引物f/r的靈敏度最好(如圖6所示)，家蠶微孢子蟲dna2基因作為檢測桑園環境中家蠶微孢子蟲特異性引物，能檢測到濃度為10-4ng/ul的dna。
而且，檢測引物f/r的擴增片段較短，更利於檢測。
因此，檢測引物f/r對家蠶微孢子蟲具有很好的特異性和檢測靈敏性，在家蠶微孢子蟲的檢測方面具有很好的應用前景。
實施例3dna2基因表達水平
1、檢測感染家蠶微孢子蟲的家蠶中腸和蠶卵中n.bdna2基因的表達水平，結果分別如圖7和圖8所示。
圖7：感病家蠶中腸中n.bdna2基因在各時間段的相對表達量如下：
6h：1.55；12h：16.67；24h：118.96；48h：194.99:；72h：17.17；96h：5.49；120h：25.89；144h：4.33；168h：2.14；192h：1.32；216h：1.20；240h：1.03；對照組表達量：1。
圖8：感病家蠶蠶卵中n.bdna2基因在各時間段的相對表達量如下：
1h：1.06；12h：7.48；24h：55.83；48：13.66；72h：5.91；96h：3.39；120h：2.01；144h：1.52；168h：1.30；192h：1.23；對照組表達量：1。
結果顯示，家蠶微孢子蟲感染家蠶以後，可在早期就及時的從中腸何蠶卵中檢測到家蠶微孢子蟲，結合實時螢光定量pcr檢測，可在
綜上研究及結果，本發明提供了一種實時螢光定量pcr檢測家蠶微孢子蟲的方法，具體如下：
以待測樣品的總dna、中腸dna、或蠶卵dna為模板，以檢測引物f/r(序列如seqidno.6和seqidno.7所示)進行實時螢光定量pcr檢測；當擴增結果顯示為一條特異性388bp的條帶時，則待測樣品中含有或感染了家蠶微孢子蟲。
其中，所述實時螢光定量pcr檢測的pcr體系(20μl)為：sybrgreenmix10μl，forwrdprimer(10pmol/μl)0.5μl，reverseprimer(10pmol/μl)0.5μl，cdna2μl，ddh2o7μl。
所述實時螢光定量pcr檢測的反應程序為：95℃2min；95℃10s，55.5℃30s，72℃30s，40個循環；95℃1min，55.5℃30s，95℃30s，60℃15s。
sequencelisting
華南農業大學
家蠶微孢子蟲dna2基因及其應用
7
patentinversion3.3
1
5582
dna
家蠶微孢子蟲dna2基因全長
1
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家蠶微孢子蟲dna2基因編碼的蛋白序列
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