一種牙鮃腦細胞系的構建方法
2024-04-01 13:57:05
一種牙鮃腦細胞系的構建方法
【專利摘要】本發明公開了一種牙鮃腦組織來源細胞系建立的方法。包括腦組織原代培養、傳代培養，及其冷凍保存、復甦和鑑定，其中所採用的細胞培養液為基礎細胞培養液中添加胎牛血清和人鹼性成纖維細胞生長因子。建立的牙鮃腦細胞系形態為類上皮樣的星形膠質細胞，該細胞系可以連續傳代，能提供大量牙鮃腦細胞，直接用於牙鮃功能基因的研究。不僅可望成為牙鮃分子細胞水平理論研究的平臺，而且可作為魚類內分泌學、繁殖生物學、環境內分泌幹擾物毒理學研究的理想材料。
【專利說明】一種牙鮃腦細胞系的構建方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及海水魚類細胞培養技術，具體說是一種牙鮃腦細胞系的構建方法。
【背景技術】
[0002]構建與培養動物細胞系早已成為研究發育生物學、內分泌學、毒理學、遺傳學、病毒學、免疫學的有力工具。截至目前，已有近280餘株不同的魚類細胞系相繼建立起來，在生理學、病毒學、毒理學、腫瘤及基因工程等多個領域發揮重要作用。但相對來說，海水魚類的細胞系還較少，包括鹹水魚才僅有約100株。
[0003]魚類腦組織是魚的重要組織器官，其所有生命活動的調節和控制都受制於神經系統和內分泌系統，如性腺分化、發育、成熟、配子排放等生殖活動就是靠腦組織的內分泌反饋調節來控制。因此，腦組織細胞除了具有一般細胞系在基因功能分析、病毒學等研究中的應用價值外，還可以 應用於現在較少探究的魚類腦室膜功能研究領域，以及魚類內分泌學、繁殖生物學、環境內分泌幹擾物毒理學的相關研究。目前，魚類腦細胞系報導還較少，特別是鮃鰈魚類尚未見到相關報導。
[0004]牙鮃(Paralichthys olivaceus)俗稱牙片魚、偏口魚、比目魚,隸屬於硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鰈形目、鰈亞目、牙鮃科、牙鮃屬。其肉質鮮嫩，是一種名貴的海水經濟魚類，也是日本、韓國以及我國的重要海水增養殖魚類之一。因此，其發育生物學、繁殖生物學、內分泌學、性別控制等方面的研究已成為焦點。隨著研究深入，牙鮃細胞離體培養體系在細胞生物學及基因功能等科學問題解析中的作用越來越引起重視。但是，迄今為止，目前國內外僅有牙鮃鰭條細胞系(中國海洋大學，童裳亮，Aquaculture，1997，156:327-333.)、胚胎細胞系(中國水產研究院黃海水產研究所，陳松林，Diseases of Aquatic Organisms, 2004,60:241-246.)、腎臟細胞系(中國水產研究院黃海水產研究所，王娜，Journal of FishDiseases，2011，34:81-85.)等3個細胞系，未見有該魚種腦組織細胞系的建立。因此，如果能體外建立牙鮃腦細胞系，不僅可以為研究魚類腦室膜功能以及中樞神經內分泌系統在其性別決定、生長、繁殖中的作用提供平臺；而且，可以為離體研究魚類病原的致病機理及免疫抗病基因的功能提供材料；體外篩選實驗甚至還可用於目前較為關注的內分泌幹擾物毒理研究，即在海洋環境內分泌幹擾物的毒理學研究中發揮重要作用。同時，這種方法也可以適用於其他鮃鰈魚類甚至於其他海水魚類。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供一種牙鮃腦細胞系的構建方法。
[0006]為實現上述目的，本發明採用技術方案為:
[0007]一種魚類腦組織來源細胞系建立方法，包括以下步驟:
[0008]I)配製細胞培養液:取Hyclone公司的MEM培養液，向培養液中加入佔細胞培養液總體積20%的胎牛血清，10ng/mL人鹼性成纖維生長因子，100U/mL青黴素，100 μ g/mL鏈黴素，PH值為7.0-7.4，於4°C下保存，備用；[0009]2)原代培養:將0.5-lmL腦組織小塊加入到步驟I)配製細胞培養液中懸浮，而後將懸液轉至培養瓶中於25±0.2°C培養箱正置培養，待組織塊完成貼壁後再補加l_2mL上述配製細胞培養液；
[0010]3)傳代培養:待上述原代培養組織塊周圍細胞遷出並增殖至形成巢式細胞暈時，加入0.25%胰蛋白酶消化液使細胞懸起，而後利用步驟I)配製細胞培養液進行原瓶傳代培養，待原瓶傳代細胞長滿瓶底後，以1:1-1:2分瓶傳代，以後3-7天傳代一次；傳至10代，進而細胞系建立成功。傳至10代之後，傳代所用培養液是血清含量減為總體積10%的步驟I)配製細胞培養液。目前，該細胞已經傳至40代。
[0011]所述魚類為牙鮃，同時也適用於如大菱鮃、圓斑星鰈等其他魚類腦細胞系的構建。
[0012]所述步驟2)中腦組織小塊為約Imm3大小的小塊。
[0013]所述步驟2)無菌條件下取牙鮃的腦組織，置於添加青黴素、鏈黴素的Hyclone公司MEM培養液中3-5min後，吸出培養液，用1_1.2mL PBS (pH7.2)多次衝洗腦組織，再吸出PBS,將腦組織剪成小塊，待用。
[0014]所述步驟3)待上述原代培養組織塊周圍細胞遷出並增殖至形成巢式細胞暈時，吸出培養液，用PBS(pH7.2)衝洗，吸出PBS，加入0.25%胰蛋白酶液消化，而後顯微鏡下觀察到細胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續在顯微鏡下觀察，待細胞變圓，在原瓶中加入新鮮的步驟O配製細胞培養液使細胞懸浮，而後將懸液進行傳代。
[0015]本發明的優點和積極效果如下:
[0016]1.採用本發明方法構建的牙鮃腦細胞系可以進行連續傳代，目前已傳至40代，能提供大量的牙鮃腦細胞，細胞生長溫度為25±0.2°C，細胞形態為類上皮樣，生長曲線正常，染色體眾數為正常的48條，可以應用於魚類細胞生物學、遺傳學、內分泌學、發育生物學、繁殖生物學、環境內分泌幹擾物毒理學及病毒學等方面的研究；而且，以PEGFP-N3進行基因轉染實驗，可以觀察到較強的綠色螢光，證實牙鮃腦細胞系可以直接應用於外源基因功能研究。
[0017]2.本發明通過易於操作、簡便的方式將腦組織來源細胞經原代培養和傳代培養的方式，獲得可以連續傳代且細胞能維持良好生長狀態的腦來源細胞。具體是指本發明中的牙鮃腦細胞系的構建方法操作簡單，重複性強，較之前報導的其他魚類腦細胞系建立中的胰酶或膠原酶消化法原代培養方法更容易掌握和操作，因此該構建方法更適用於構建其他魚類特別是海水魚類腦組織來源的細胞系，應用價值極大。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1A、1B分別為本發明實施例提供的相差顯微鏡下傳代培養的牙鮃腦細胞系圖，其中A為牙鮃腦細胞3代圖(100X )，B為牙鮃腦細胞23代圖(100X )。
[0019]圖2為本發明實施例提供的牙鮃腦細胞系的生長曲線圖。
[0020]圖3A、B、C分別為本發明實施例提供的牙鮃腦細胞系的染色體核型圖，其中A為染色體數目分布圖，B為中期分裂相(1000 X )，C為核型。
[0021]圖4為本發明實施例提供的牙鮃腦細胞免疫螢光顯微圖片(200X )。
[0022]圖5為本發明實施例提供的牙鮃腦細胞系轉染PEGFP-N3後的螢光顯微圖片(IOOX)0【具體實施方式】:
[0023]本發明對目前的魚類細胞系構建方法進行了優化，構建方法操作簡單，重複性強，較之前報導的其他魚類腦細胞系的建立方法更容易掌握和操作，應用價值極大，為進一步的實驗研究提供了材料和技術支持。
[0024]下面結合實施例詳述本發明的構建、鑑定和應用方法。
[0025]實施例1
[0026]牙鮃腦來源細胞系的建立方法，步驟如下:
[0027]I)配製細胞培養液:取Hyclone公司MEM培養液，向培養液中加入佔總體積20%的胎牛血清，100U/mL青黴素，100 μ g/mL鏈黴素，10ng/mL人鹼性成纖維細胞生長因子，pH值為7.0-7.4，4°C存放，備用。
[0028]2)原代培養:無菌取體重250g牙鮃的腦組織，置於添加了 400U/mL青黴素、400 μ g/mL鏈黴素的4mL Hyclone公司MEM培養液的無菌玻璃平皿中3_5min後，吸出培養液，用1-1.2mL PBS (pH7.2)衝洗腦組織兩次，吸出PBS，將腦組織剪成大約Imm3的小塊，加ImL上述步驟I)配製細胞培養液，使腦組織小塊懸浮，而後轉至25cm2培養瓶中，於25±0.2°C培養箱正置培養。第二天向培養瓶中補充上述步驟I)配製細胞培養液lmL，然後每隔7天更換培養瓶中半量細胞培養液一次。
[0029]3)傳代培養:待步驟2)原代培養細胞不斷從組織塊周圍遷出並迅速增殖，當組織塊周圍細胞暈停止生長後，吸出培養液，用PBS (pH7.2)衝洗，吸出PBS，加入ImL的0.25%胰蛋白酶液消化。顯微鏡下觀察到細胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續在顯微鏡下觀察，待細胞變圓，在原瓶中加入新鮮的步驟I)配製細胞培養液使細胞懸浮，而後將懸液進行傳代。第一次傳代後，待細胞長滿瓶底，以2\104-2\105細胞/1^濃度進行1:1-1:2分瓶傳代；以後3-7天傳代一次；傳至10代，進而細胞系建立成功。傳至10代之後，傳代所用培養液是血清含量減為總體積10%的步驟I)配製細胞培養液。目前，該細胞已經傳至40代。細胞已能穩定增值，細胞系命名為P0BC。該細胞系主要細胞類型為類上皮樣細胞(如圖1A、B所示)。
[0030]實施例2
[0031]牙鮃腦細胞系的鑑定和應用
[0032]I)細胞的凍存與復甦
[0033]細胞的凍存:
[0034]選取上述處於指數生長期、細胞密度達到90%以上的傳代培養腦細胞，按常規方法消化:吸出培養液，用PBS(pH7.2)衝洗，吸出PBSjPA ImL的0.25%胰蛋白酶液消化。顯微鏡下觀察到細胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續在顯微鏡下觀察，待細胞變圓，在原瓶中加入2mL新鮮上述實施例步驟I)配製細胞培養液製備細胞懸液。將細胞懸液轉移至15mL離心管中，以2200rpm離心2min，去上清。用2mL預冷的凍存液(即含10% 二甲基亞碸的Hyclone公司MEM細胞培養液)懸浮細胞，並移至2mL凍存管中，將凍存管放入程序降溫盒中後依次於4°C放置30min, -20°C放置2h, _80°C放置過夜,然後移至液氮中保存,並做好記錄。
[0035]細胞的復甦:
[0036]自液氮中取出保存的凍存管，迅速置於42°C水浴中融化，2200rpm離心5min，棄上清，並加入2mL上述實施例步驟I)配製的細胞培養液懸浮上述凍存細胞，轉移至25cm2培養瓶中，放置於培養箱中25±0.2°C培養，次日待細胞貼壁後棄上清，再加入2mL新的上述實施例步驟I)配製的細胞培養液。
[0037]2)細胞生長曲線繪製
[0038]為了分析牙鮃細胞系的生長情況，取22代腦細胞，按照1.2 X IO5個細胞/孔的密度在24孔板中接種18孔，將細胞培養板置於25°C培養箱中培養。分別在接種後的第1，3，5,7,9,11天按照常規胰蛋白酶液消化法消化，收集3孔細胞，用細胞計數板計數。以培養時間為橫坐標，以每mL培養液中的細胞數量為縱坐標,繪製生長曲線,如圖2所示。
[0039]3)染色體分析
[0040]取25代牙鮃腦細胞，用按照上述實施例步驟I)配製的2mL細胞培養液懸浮，接種於25cm2的培養瓶中，接種密度為I X IO6個細胞/瓶。25±0.2°C下培養24h，加入終濃度I μ g/mL的秋水仙素3h後,按照常規胰蛋白酶液消化法消化,2200rpm離心2min收集細胞，細胞沉澱中加入IOmL0.075mol/LKC1溶液37°C水浴低滲處理20min後，加入ImL預冷的卡諾氏固定液(甲醇:乙酸=3:1 (v/v)),預固定2min, 1000rpm離心5min後棄上清,細胞沉澱用5mL預冷卡諾氏固定液固定15min後，以1000rpm離心5min收集細胞,重複操作兩次。然後將細胞重懸於0.5mL預冷卡諾氏固定液中，將細胞懸液以冷滴法滴片，風乾，10%吉姆薩染色lOmin，用Nikon顯微 鏡觀察。結果顯示牙鮃腦細胞的染色體數目在29~93之間，其中染色體眾數為48條(圖3A)，均為端部著絲粒染色體，染色體核型為2n=48t (圖3B、C)。
[0041]4)細胞免疫螢光鑑定
[0042]取28代牙鮃腦細胞，用按照上述實施例步驟I)配製的2mL細胞培養液懸浮，按照I X IO5個細胞/孔的密度在24孔板中接種，置於25±0.2°C培養箱中培養。待細胞密度達到95-100%，用預冷PBS (pH7.2)洗3次，每次IOmin ;用4%多聚甲醛固定IOmin,用PBS洗5min ;用0.5%預冷的Triton穿孔15min,用PBS洗2次,每次5min。清洗後用1%BSA封閉30min 後加一抗(2.5μ L Rabbit ant1-GFAP [X] 18-0063 溶於 200 μ L 的 1%BSA)4°C 過夜；用PBS 洗 2 次,每次 5min,再加二抗(2.5 μ L Labeled Donkey Anti Rabbit IgG Antibodies溶於200 μ L的1%BSA) 25°C孵育lh，用PBS洗2次，每次5min，最後加入25 μ L DAPI染色2min。用Nikon ECLIPSE TE2000-U螢光顯微鏡觀察，發現有綠色螢光的表達，表明該細胞為星形膠質細胞(圖4)。
[0043]5) GFP報告基因在腦細胞中的表達
[0044]轉染前一天，取第22代腦細胞，用按照上述實施例步驟I)配製的2mL細胞培養液懸浮，以2X IO5個細胞/孔的密度接種於24孔板中，25±0.2°C培養。轉染時，細胞密度超過 80%,以 Invitrogen 公司的 Lipofectamine2000 轉染 pEGFP_N3。具體步驟為將 IyLLipofectamine2000加入到包含49 μ L Hyclone公司的MEM細胞培養液的1.5mL離心管中，另一個離心管中加入2μ L pEGFP-N3 (400ng/μ L)和48 μ L Hyclone公司的MEM細胞培養液。5min後，將上述兩管溶液混合，室溫放置25min。將上述100 μ L混合液加入到包含500 μ L不含血清的上述實施例步驟I)配製的細胞培養液(即不含血清的配製細胞培養液，取Hyclone公司MEM培養液，向培養液中加入100U/mL青黴素，100 μ g/mL鏈黴素，IOng/mL人鹼性成纖維細胞生長因子，pH值為7.0-7.4，4°C存放，備用。)的24孔板的一孔中，25±0.2°C培養4.5h後，吸出培養液，加500 μ L按照上述實施例步驟I)配製的細胞培養液，72h後，用Nikon ECLIPSE TE2000-U螢光顯微鏡觀察綠色螢光的表達，發現約有20%以上的細胞表達較強螢光(具體參見圖5)。
[0045]上述實施例表明，用本發明方法建立的牙鮃腦組織來源細胞系，生長曲線正常，染色體為正常的48條，可以進行連續傳代，也可以對其進行冷凍保存。以PEGFP-N3進行基因轉染實驗，也觀察到 較強的綠色螢光。細胞免疫螢光鑑定結果表明所培養細胞為腦部星形膠質細胞。證實牙鮃腦組織來源細胞系可以直接應用於外源基因功能研究。
[0046]本發明牙鮃腦組織來源細胞系的建立方法重複性強，經染色體鑑定結果可信，取材的牙鮃體重恰當，操作方法簡便，也可以適用於構建其他魚類腦組織來源的細胞系。
【權利要求】
1.一種魚類腦組織來源細胞系建立方法，包括以下步驟: O配製細胞培養液:取Hyclone公司的MEM培養液，向培養液中加入佔細胞培養液總體積20%的胎牛血清，10ng/mL人鹼性成纖維生長因子，100U/mL青黴素，ΙΟΟμ g/mL鏈黴素，PH值為7.0_7.4，於4°C下保存，備用； 2)原代培養:將0.5-lmL腦組織小塊加入到步驟I)配製細胞培養液中懸浮，而後將懸浮液轉至培養瓶中於25±0.2°C培養箱正置培養，待組織塊完成貼壁後再補加l_2mL步驟1)配製細胞培養液； 3)傳代培養:待上述原代培養組織塊周圍細胞遷出並增殖至形成巢式細胞暈時，加入0.25%胰蛋白酶消化液使細胞懸起，而後利用步驟I)配製細胞培養液進行原瓶傳代培養，待原瓶傳代細胞長滿瓶底後，以1:1-1:2分瓶傳代，以後3-7天傳代一次；傳至10代,進而細胞系建立成功。
2.按照權利要求1所述的魚類腦組織來源細胞系建立方法，其特徵在於:所述傳至10代之後，傳代所用培養液是血清含量減為總體積10%的步驟I)配製細胞培養液。
3.按照權利要求1所述的一種牙鮃腦組織來源細胞系的建立方法，其特徵在於:所述步驟2)無菌條件下取牙鮃的腦組織，置於添加青黴素、鏈黴素的Hyclone公司MEM培養液中3-5min後，吸出培養液，用1-1.2mLPBS(pH7.2)多次衝洗腦組織，再吸出PBS，將腦組織剪成小塊，待用。
4.按照權利要求1所述的魚類腦組織來源細胞系建立方法，其特徵在於:所述步驟2)中腦組織小塊為約Imm3大小的小塊。
5.按照權利要求1所述的一種牙鮃腦組織來源細胞系的建立方法，其特徵在於:所述步驟3)待上述原代培養組織塊周圍細胞遷出並增殖至形成巢式細胞暈時，吸出培養液，用PBS (pH7.2)衝洗，吸出PBSjPA 0.25%胰蛋白酶液消化，而後顯微鏡下觀察到細胞收縮即吸棄胰蛋白酶液，繼續在顯微鏡下觀察，待細胞變圓，在原瓶中加入步驟I)配製細胞培養液使細胞懸浮，而後將懸液進行傳代。
【文檔編號】C12R1/91GK103789263SQ201410071475
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年2月28日 優先權日:2014年2月28日
【發明者】尤鋒, 鄭媛, 彭麗敏, 鄒玉霞, 吳志昊, 譚訓剛, 焦爽 申請人:中國科學院海洋研究所