一種大鯢虹彩病毒MCP抗原的製備方法及其應用與流程

2024-04-01 13:09:05

本發明涉及生物領域，具體涉及一種大鯢虹彩病毒mcp抗原的製備方法及其應用。
背景技術：
：中國大鯢(chinesegiantsalamander，andriasdavidianus)是現存個體最大的兩棲動物，俗名「娃娃魚」，是我國的珍貴特產，屬於國家二級保護動物。近年來在我國的陝西、湖北、湖南、浙江、貴州等省份的大鯢主養區暴發了大鯢虹彩病毒病(chinesegiantsalamanderiridovirusdisease，cgsivd)，該病可感染各種規格的養殖大鯢，死亡率高達90％以上，給大鯢養殖業造成了巨大的經濟損失。大鯢虹彩病毒病的病原為大鯢虹彩病毒(chinesegiantsalamanderiridovirus，cgsiv)，是虹彩病毒科(iridoviridae)，蛙病毒屬(ranavirus)的成員。虹彩病毒(iridoviruses)是一類病毒粒子較大，呈二十面體狀的雙鏈dna病毒。虹彩病毒科(iridoviridae)分為五個屬：綠虹彩病毒屬(chloriridovirus)，虹彩病毒屬(iridovirus)，淋巴囊腫病毒屬(lymphocystivirus)，巨大細胞病毒屬(megalocytivirus)和蛙病毒屬(ranavirus)。虹彩病毒可感染無脊椎動物(綠虹彩病毒屬，虹彩病毒屬)及變溫脊椎動物(蛙病毒屬，淋巴囊腫病毒屬，巨大細胞病毒屬)，包括兩棲類、爬行類、甲殼類、軟體動物、昆蟲及魚類等。脊椎動物虹彩病毒，尤其是蛙病毒屬的一些成員已經成為導致變溫動物發病的一個重要原因。為有效防控cgsiv的流行，目前眾多學者針對cgsiv建立多種診斷方法，如環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)檢測方法、巢式pcr法等檢測方法(劉星星，等.2014；meng，etal.，2013)。但這些方法均是建立在pcr檢測原理基礎之上，或者易汙染，結果假陽性率較高，或者需要的儀器設備較為昂貴，用時較長，現場使用不便利。實際生產和科研都亟需更為簡便、快速的免疫學檢測方法用於現場cgsiv的檢測和篩查。血清學檢測方法是病毒性疾病的主要免疫學方法。其中通過檢測感染後機體產生特異性抗體可以及早對機體是否感染病毒做出較為準確的判斷。研究表明，動物在感染虹彩病毒或接種相應病毒滅活疫苗最早一周之內，就可以檢測到特異性的抗體(maniero，etal.，2006；liu，etal.，2014)。elisa檢測方法以其操作簡便，檢測樣本量大等優點已經成為病毒血清學檢測的主要手段。而在血清學檢測方法的建立中，抗原的純度和良好的抗原性是基礎。主要衣殼蛋白(majorcapsidprotein，mcp)是虹彩病毒的一個晚期基因，在虹彩病毒感染的晚期大量表達，編碼核苷酸全長為1392bp，編碼胺基酸為463個胺基酸殘基，編碼的主要衣殼蛋白分子量約為50kd，構成病毒的二十面體衣殼。比較虹彩病毒mcp基因的胺基酸序列發現，虹彩病毒mcp基因的胺基酸序列是高度保守的，同一屬的同源性一般在90％以上，不同屬之間的同源性一般為40％-50％左右(tidona，etal.，1998；chinchar，etal，2011)。mcp能夠誘導機體產生中和抗體的主要保護性抗原，是製備虹彩病毒人工抗原的首選靶蛋白(qin，etal.，2002；li，etal.，2014；liu，etal.，2015；zhou，etal.，2015)。很多發明者針對各自虹彩病毒mcp製備人工抗原，但通過體外重組表達全長mcp作為人工抗原，因生產過程中mcp表達量少，導致製備成本增加。為此，多數學者通過對mcp進行截短表達，以期提高表達量。但這樣，mcp的抗原性就會變得較差。再者，為便於後續蛋白的純化，已有的研究往往在表達各自虹彩病毒mcp時加入各種商業化的標籤，這樣雖然純化步驟較為簡單，但在應用時又要切割掉標籤，無形之中導致操作步驟繁瑣。近年來，杆狀病毒表達載體因其具有操作簡單、安全性高，可容納大的目的基因，表達外源蛋白效率高，有翻譯後修飾的作用，表達蛋白的免疫原性和抗原性、生物活性與天然的蛋白相似等優點，已經在表達載體上佔了主導的地位(anderson，etal.，1995；wang，etal.，2001)。技術實現要素：為解決上述問題，本發明提供了一種大鯢虹彩病毒mcp抗原的製備方法及其應用。為實現上述目的，本發明採取的技術方案為：一種重組杆狀大鯢虹彩病毒的構建方法，包括如下步驟：s1、以cgsiv-ly分離株mcp基因序列(genbankno.kf023635)為原始模板，序列表見seqidno.1；根據杆狀病毒表達系統密碼子的偏愛性人工合成cgsivmcp基因的序列，修飾後的基因序列如seqidno.2所示；根據人工修飾合成的mcp基因序列和杆狀病毒穿梭載體pfastbac1所含的酶切位點，設計特異擴增引物，分別引入ecori、hindiii酶切位點，pcr擴增人工修飾mcp基因。引物序列如下：p1：5′-ccggaattcatgtcttctgtaactgg-3′(ecori)；p2：5′-cccaagcttttacaagattgggaatcc-3′(hindiii)；總體積為50μl的反應體系為：0.5μl的t5u/μl的takaraextaq，5.0μl10×extaqbuffer(mg2+plus)，0.25nmol/ldntps4.0μl，引物50pmol/l各1.0μl，dna模板1μl，ddh2o補充至50μl；反應條件為：95℃3min，95℃45s，60℃45s，72℃1min，30個循環，72℃充分延伸10min；10g/l的瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產物，膠回收pcr產物；s2、將回收的人工修飾的mcp基因連接到pmd-18t載體，反應體系(總體積為10μl)：1μlpmd-18t載體、2μl回收的核酸片段、5μlddh2o、1μl10×ligasebuffer、1μlt4dnaligase。充分混勻後，16℃低溫水浴槽中連接過夜。轉化大腸桿菌感受態細胞後過夜培養；菌落pcr方法檢測目的片段是否連接到載體pmd-18t上；s3用質粒dna小量提取試劑盒提取質粒，分別用ecori和hindiii限制性內切酶雙酶切pfastbac1載體和重組質粒，回收純化後用t4dna連接酶連接，再轉化至e.colidh5α感受態細胞中，塗布含amp(100mg/ml)的平板，篩選陽性克隆，挑取陽性克隆擴大培養後用質粒抽提試劑盒抽提質粒，進行酶切鑑定及測序，將鑑定正確的重組質粒命名為pfastbac-mcp；s4、將重組質粒pfastbac-mcp轉化e.colidh10bac感受態細胞，塗布三抗(gen、kan、tet)、bluo-gal、iptg平板進行藍白斑篩選，挑取白色菌落三次劃線純化，經m13通用引物和mcp特異性引物pcr初步鑑定後，測序進一步鑑定，將確認結果正確的陽性重組轉座子，命名為rbacmid-mcp；s5、通過鹼裂解法提取rbacmid-mcp質粒，然後將2μg的rbacmid-mcp質粒與10μl轉染試劑輕輕混合後轉染於細胞密度約為1×106個/ml的sf9單層細胞，27℃繼續培養，待80％細胞出現病變後，收集細胞上清標記為p1代重組杆狀病毒病毒，將p1代重組病毒繼續感染sf9細胞，經3代擴大培養，得宿主細胞上清；s6、將所得的宿主細胞上清與製備好的免疫磁珠混勻，37℃孵育2h，用磁力架收集磁珠，洗滌2次，將磁珠懸浮於500μlph2.5gly-hcl，孵育5min，磁力收集磁珠，上清用100μlph8.0tris-hcl中和，即獲得純化後的大鯢虹彩病毒mcp抗原。所述免疫磁珠製備方法是將每500μlnhs磁珠洗滌後，與350μl的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單抗結合，再按照產品說明書要求即可製備免疫磁珠。上述製備的大鯢虹彩病毒mcp抗原可用於製備檢測大鯢虹彩病毒抗體elisa試劑盒，所述試劑盒包括所述的大鯢虹彩病毒mcp抗原、辣根過氧化物酶標記的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單克隆抗體、陰性對照、陽性對照、底物反應液、洗滌液和反應終止液。本具體實施本具體實施將大鯢虹彩病毒mcp表達基因整合到質粒上得到重組質粒，而後將所述重組質粒利用杆狀病毒表達系統表達大鯢虹彩病毒mcp；所述的大鯢虹彩病毒mcp表達基因是在大鯢虹彩病毒mcp天然表達基因基礎上，以杆狀病毒偏嗜密碼子替換其中的杆狀病毒非偏嗜密碼子所修飾後的基因；在此基礎上進一步優選的，所述大鯢虹彩病毒mcp表達基因，其核苷酸序列如seqidno1所示。在該優選技術方案中，所述大鯢虹彩病毒mcp天然表達基因，是指自然條件下野生型大鯢虹彩病毒mcp蛋白表達基因；所述的修飾，是指對基因的改造，這種改造行為應當保證改造前和改造後所表達的蛋白胺基酸序列不變，所述杆狀病毒表達系統是杆狀病毒表達系統。在該優選技術方案中，所述杆狀病毒表達系統專指由美國thermofisherscientific公司出品的品牌為invitrogen的杆狀病毒表達系統；所述大鯢虹彩病毒mcp表達基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示。所述的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單克隆抗體由雜交瘤細胞株mcp26分泌得到，所述的雜交瘤細胞株mcp26保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：cctccc201533。優選地，重組杆狀病毒感染宿主細胞的感染複數為10。本發明對大鯢虹彩病毒mcp蛋白編碼基因和胺基酸進行分析，根據杆狀病毒表達系統的密碼子偏好性，對大鯢虹彩病毒mcp編碼核苷酸序列進行了優化，同時通過優化表達條件，在不改變目的蛋白編碼胺基酸的前提下，提高了大鯢虹彩病毒mcp蛋白在杆狀病毒表達系統中的表達量，並利用已製備的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單抗應用免疫磁珠法進行表達的mcp蛋白的純化，純化方法具有操作簡單、用時短、收率和純度均很好的效果。另外，利用製備的大鯢虹彩病毒mcp抗原包被elisa板製備了檢測大鯢虹彩病毒抗體的elisa試劑盒，實現大鯢是否感染病毒和疫苗免疫效果評價的簡便、快速，規模化檢測。本發明具有以下有益效果：1、大鯢虹彩病毒mcp是該病毒的主要保護性抗原蛋白，也是建立大鯢虹彩病毒血清學檢測方法的首選抗原。本發明所述的大鯢虹彩病毒mcp抗原為杆狀病毒系統表達所表達，杆狀病毒表達系統表達的外源蛋白，可進行正確的摺疊、翻譯後修飾等，表達產物更接近天然蛋白。2、本發明在不減弱大鯢虹彩病毒mcp抗原性的情況下，根據杆狀病毒密碼子偏好性，重新編碼基因，通過優化表達條件，提升了重組蛋白大量表達。3、本發明在已製備小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單克隆抗體的基礎上，應用免疫磁珠法純化目的蛋白，蛋白純度達到95％以上，且純化方法操作簡單、快速，純度和抗原性均很好。4、本發明利用所製備的大鯢虹彩病毒mcp抗原製備了可用於大鯢虹彩病毒抗體檢測的阻斷elisa檢測試劑盒，具有很高的靈敏度和特異性。附圖說明圖1為本發明實施例中mcp基因擴增產物電泳圖；圖中：m：dl2000dna分子量標準；1：mcp擴增產物。圖2為本發明實施例中重組質粒pfastbac-mcp的酶切鑑定圖中：m：dl5000分子量標準；1.pfastbac1單酶切產物；2：pfastbac-mcp雙酶切產物。圖3為本發明實施例中重組杆粒rbacmid-mcp的pcr鑑定；圖中：m：dl5000dna分子量標準；1：mcp的pcr擴增產物2：rbacmid-mcp的pcr擴增產物。圖4為本發明實施例中重組杆狀病毒(acnpv-mcp)的免疫電鏡觀察圖。a：正常sf9細胞對照；b：重組杆狀病毒感染的sf9細胞(箭頭為膠體金標記的重組杆狀病毒)圖5為本發明實施例中重組mcp蛋白的sds-page鑑定；圖中：a：野生型杆狀病毒感染的sf9細胞(72h)；b：感染acnpv-mcp後72h的sf9細胞。圖6為本發明實施例中間接免疫螢光法檢測重組mcp蛋白的表達圖中：m：蛋白分子量標準；1：陰性對照；2：rbacmid-mcp轉染sf9昆蟲細胞(moi＝10)；3：rbacmid-mcp轉染sf9昆蟲細胞(moi＝5)；4：rbacmid-mcp轉染sf9昆蟲細胞(moi＝2)。圖7為本發明實施例中純化重組mcp蛋白的sds-page圖圖中1為純化的mcp；m為蛋白分子量標準圖8為表達的mcp蛋白和純化後的mcp蛋白的western-blot鑑定圖中m：蛋白分子量標準；c：陰性對照：1：未經純化的mcp蛋白；2：純化的mcp蛋白。圖9為本發明實施例中大鯢虹彩病毒衣殼蛋白天然表達基因與修飾後的基因核苷酸序列對照圖；圖中，optimized字樣代表修飾後的基因序列，original字樣代表大鯢虹彩病毒衣殼蛋白天然表達基因序列，二者序列存在差異的部分通過下劃線表示。具體實施方式為了使本發明的目的及優點更加清楚明白，以下結合實施例對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。實施例1人工修飾cgsivmcp基因的重組質粒pfastbac-mcp的構建1.cgsivmcp基因的人工修飾合成在保持胺基酸不變的前提下，將密碼子改造為杆狀病毒偏嗜密碼子，提高表達量。進行密碼子優化時，優先選擇昆蟲細胞使用頻率最高的密碼子。根據具體情況(避免多個重複序列的出現等)作適當調整，若不能使用頻率最高的密碼子，則選擇使用頻率次高的密碼子。根據上述理論，以cgsiv-ly分離株mcp基因序列(genbankno.kf023635)為原始模板，根據密碼子的偏愛性人工合成cgsivmcp基因的序列，修飾後的基因序列如seqidno.2所示，修飾前後的基因序列對比情況圖9所示。以上修飾前後基因所編碼的胺基酸序列如seqidno.3所示2.人工修飾mcp基因的擴增根據人工修飾合成的mcp基因序列和杆狀病毒穿梭載體pfastbac1所含的酶切位點，設計特異擴增引物，分別引入ecori、hindiii酶切位點。引物序列如下：p1：5′-ccggaattcatgtcttctgtaactgg-3′(ecori)；p2：5′-cccaagcttttacaagattgggaatcc-3′(hindiii)。體積為50μl的反應體系為：0.5μltakaraextaq(5u/μl)，5.0μl10×extaqbuffer(mg2+plus)，0.25nmol/ldntps4.0μl，引物(50pmol/l)各1.0μl，dna模板1μl，ddh2o補充至50μl。反應條件為：95℃3min，95℃45s，60℃45s，72℃1min，30個循環，72℃充分延伸10min。10g/l的瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產物，檢測大小為1392bp(圖2)，符合預期。膠回收pcr產物。3.人工修飾的mcp基因連接到pmd-18t載體將回收的人工修飾的mcp基因連接到pmd-18t載體，反應體系(總體積為10μl)：1μlpmd-18t載體、2μl回收的核酸片段、5μlddh2o、1μl10×ligasebuffer、1μlt4dnaligase。充分混勻後，16℃低溫水浴槽中連接過夜。轉化大腸桿菌感受態細胞後過夜培養，菌落pcr方法檢測目的片段是否連接到載體pmd-18t上。4.重組質粒pfastbac-mcp的構建用質粒dna小量提取試劑盒提取質粒，分別用ecori和hindiii限制性內切酶雙酶切pfastbac1載體和重組質粒，回收純化後用t4dna連接酶連接，再轉化至e.colidh5α感受態細胞中，塗布含amp(100mg/ml)的平板，篩選陽性克隆，挑取陽性克隆擴大培養後用質粒抽提試劑盒抽提質粒，進行酶切鑑定(圖3)及測序，結果表明已正確構建了重組質粒，將其命名為pfastbac-mcp。實施例2人工修飾mcp基因的重組杆狀病毒的製備1.重組杆粒的製備將重組質粒pfastbac-mcp轉化e.colidh10bac感受態細胞，塗布三抗(gen、kan、tet)、bluo-gal、iptg平板進行藍白斑篩選，挑取白色菌落三次劃線純化，經m13通用引物和mcp特異性引物pcr初步鑑定後(圖4)，並將陽性菌落送武漢天一輝遠生物科技有限公司測序進一步鑑定。將確認結果正確的陽性重組轉座子，命名為rbacmid-mcp。2.重組杆狀病毒的製備按insecttransfectionreagent操作說明書的方法，首先鹼裂解法提取rbacmid-mcp質粒，然後將2μg的rbacmid-mcp質粒與10μl轉染試劑輕輕混合後轉染於sf9單層細胞(細胞密度約為1×106個/ml)，27℃繼續培養，待80％細胞出現病變後，收集細胞上清標記為p1代重組杆狀病毒病毒，將p1代重組病毒繼續感染sf9細胞，經3代擴大培養；同時參照bactobacbaculovirusexpressionsystems使用手冊中的蝕斑法測定各代重組病毒滴度，進行重組病毒的篩選。病毒滴度測定結果顯示，p1代重組病毒的滴度為5×106pfu/ml，p2代重組病毒的滴度逐漸升高，為2×107pfu/ml；p3代和p4代病毒的滴度均為1×108pfu/ml。因此，選擇p3代重組病毒感染細胞的培養上清作為重組病毒母液，4℃避光保存備用。將該重組杆狀病毒命名為acnpv-mcp。3.重組杆狀病毒acnpv-mcp的鑑定膠體金免疫電鏡法acnpv-mcp感染sf9細胞72h後，棄掉培養液，刮集細胞於10ml離心管中，3000rpm離心20min，棄上清；經2.5％戊二醛固定，乙醇脫水，環氧樹脂包埋後，用leicacm1950超薄切片機製備厚度為50～80nm的超薄切片，將切片至於1％h2o2中10min，pbs洗3次，加入5％bsa室溫孵育20～30min，然後置於膠體金標記的鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單抗中室溫孵育30min，雙蒸水洗滌3-5次。最後將切片置於有支持膜的銅網上，醋酸鈾及檸檬酸鉛染色，然後置於h-7650型透射電鏡(日立)在80kv下觀察。如圖5所示，在對照細胞中，幾乎看不到特異性的膠體金顆粒，而在重組杆狀病毒感染的sf9中可以看到大量被特異性膠體金標記的杆狀病毒，大小約為200nm×40nm，，具有典型的杆狀病毒形態，說明已成功獲得了大量重組杆狀病毒。間接免疫螢光法(ifa)鑑定將無菌蓋玻片置於6孔板(corning)中培養單層的sf9細胞，acnpv-mcp感染細胞72h後棄去培養液，經4％多聚甲醛固定過夜，pbst洗滌，3％bsa封閉2h，以小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單抗(1∶3000)為一抗，室溫下孵育2h。pbst洗滌後，以fitc標記的羊抗小鼠igg(1∶2500)為二抗，室溫避光孵育2h。pbst洗滌後用螢光染料hoechest33258進行染色。將蓋玻片有細胞的一面朝下，50％甘油封片置於載玻片上，螢光顯微鏡(olympusbx-51)下觀察，拍照。同時，設野生型杆狀病毒感染的sf9細胞作陰性對照。間接免疫螢光檢測結果顯示，acnpv-mcp感染的sf9細胞出現特異性的綠色螢光(圖6)，且螢光分布在細胞表面，而陰性對照細胞未出現螢光。以上所述的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單抗由雜交瘤細胞株mcp26分泌得到，所述的雜交瘤細胞株mcp26保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：cctccc201533。實施例3重組mcp的表達及sds-page分析根據病毒滴度，確定不同感染複數(multiplicityofinfection，moi)時病毒的用量，將acnpv-mcp按不同感染複數(moi＝2、5、10)接種處於對數生長期的sf9細胞(細胞密度約為1×106個/ml)，進行mcp基因表達。待80％以上細胞出現明顯細胞病變後，收集細胞，1000rpm離心10min，上清4℃避光保存，收集細胞沉澱。將細胞沉澱用預冷的pbs洗滌兩次，加入細胞裂解液緩衝液重懸，之後超聲破碎(200hz，運行15s間歇30s，3個循環)，13000rpm4℃離心30min，然後取上清以12％凝膠進行sds-page電泳，完畢後經考馬斯亮藍染色，後將凝膠置於syngene化學發光凝膠成像系統進行觀察和拍照。同時設野生型杆狀病毒感染的sf9細胞為對照。mcp蛋白的理論相對分子量為50kd，而acnpv-mcp感染sf9昆蟲細胞後，經sds-page分析，和對照相比，在53ku處出現一條較為明顯的目的條帶，而且感染複數moi為10時，目的蛋白的表達量最高(圖7)。實施例4重組mcp蛋白的純化及westernblot鑑定根據操作說明書，經試驗確定，按每500μl磁珠可結合350μl的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單抗製備免疫磁珠。將確定的最佳表達條件下收穫的含有目的蛋白表達產物的sf9細胞用tritonx-100冰上裂解1min，4℃600g離心3min，收集上清，再與製備好的免疫磁珠混勻，37℃孵育2h，用磁力架收集磁珠，洗滌2次，將磁珠懸浮於500μlph2.5gly-hcl，孵育5min，磁力收集磁珠，上清用100μlph8.0tris-hcl中和，即獲得純化後的目的蛋白。取純化的目的蛋白經sds-page電泳，利用灰度分析測定純度，bca蛋白濃度測定試劑盒(sigma)測定蛋白濃度。純化蛋白經sds-page電泳檢測。結果只有一單一條帶，相對分子質量約為53kd(圖8)，與預期大小相符合。純化蛋白的純度和定量測定結果顯示，純化目的蛋白的純度為95.8％，蛋白濃度為1.05mg/ml。為檢測純化蛋白的生物活性，按常規將未經純化的mcp和純化的mcp蛋白樣品進行sds-page電泳，之後將電泳產物電轉到pvdf膜上，同時以野生型杆狀病毒感染sf9細胞的裂解物為陰性對照。氨基黑染色5min，甲醇褪去背景色。4℃，50g/l脫脂奶粉封閉2h；用pbst洗滌後，置於1∶500稀釋的兔抗大鯢虹彩病毒mcp血清中，室溫孵育過夜；pbst洗滌後，加hrp標記的羊抗兔igg(1∶3000)，室溫孵育2h；pbst洗滌3次，ecl法檢測。westernblot反應，結果如圖8所示：未純化的重組mcp蛋白和純化蛋白在pvdf膜上均可見單一條帶印記，且大小符合預期，而陰性對照則無此條帶，表明表達的目的蛋白具有抗原活性，且能夠被兔抗大鯢虹彩病毒mcp血清識別。以上所述的兔抗大鯢虹彩病毒mcp血清已由發明人公開(周小願，張星朗，賈秋紅，等.大鯢虹彩病毒mcp蛋白主要抗原表位區原核表達及抗血清製備[j].細胞與分子免疫學雜誌，2016，32(10)：1407-1411.)實施例5一種檢測大鯢虹彩病毒的阻斷elisa抗體檢測試劑盒，該試劑盒包括：本發明製備的大鯢虹彩病毒mcp蛋白作為包被板抗原，辣根過氧化物酶標記的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp蛋白的單克隆抗體，小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單克隆抗體由雜交瘤細胞株mcp26分泌得到，所述的雜交瘤細胞株mcp26保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：cctccc201533。所述的試劑盒還包括：抗原包被板、陽性對照、陰性對照、樣品稀釋液、20倍濃縮洗滌液、顯色液a、顯色液b、終止液；所述抗原包被板是用0.1mol/l，ph9.6的碳酸氫鈉溶液作為包被液，將本發明表達並純化的mcp蛋白稀釋一定濃度後，包被elisa板；所述的陽性對照為大鯢虹彩病毒滅活疫苗免疫的高免血清，將高免血清按1000u/ml加入青黴素和鏈黴素，無菌過濾，作為陽性對照；所述的陰性對照為未感染過大鯢虹彩病毒和未經大鯢虹彩病毒滅活疫苗免疫的健康大鯢血清，是將獲得的大鯢陰性血清按1000u/ml加入青黴素和鏈黴素，無菌過濾，作為陰性對照；所述的樣品稀釋液是稱取牛血清白蛋白(bsa)5g、吐溫20(tween-20)0.5ml、氯化鈉(nacl)8.0g、氯化鉀(kcl)0.2g、磷酸二氫鉀(kh2po4)0.24g、磷酸氫二鉀(k2hpo4)1.8g加注射用水溶解並定容至1000ml；所述的20倍濃縮洗滌液是稱取氯化鈉(nacl)160g、氯化鉀(kcl)4g、磷酸二氫鉀(kh2po4)4.8g、磷酸氫二鉀(k2hpo4)36g、吐溫20(tween-20)10ml，加注射用水溶解並定容至1000ml；所述的顯色液a為含有50mg/ml過氧化氫脲的檸檬酸鹽緩衝液，顯色液b為含有0.2mg/mltmbph5.0的檸檬酸/檸檬酸鈉緩衝液；所述的終止液為含有0.25％體積比氫氟酸溶液。所述的抗原包被板的製備，其步驟是：將本發明製備的純化好的大鯢虹彩病毒mcp蛋白用ph9.6的碳酸氫鈉溶液稀釋為1.00μg/ml，按100μl/孔加入96孔酶標板中，4℃放置過夜，甩幹，按120μl/孔用5mg/mlbsa的磷酸鹽緩衝液(ph7.4)，37℃封閉2h，甩幹，置乾燥室乾燥後，裝入含乾燥劑的包裝中密封保存。所述的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單克隆抗體由雜交瘤細胞株mcp26分泌得到，其是否具有阻斷作用按以下步驟進行判定。將所述的雜交瘤細胞株mcp26的培養上清收集起來，在包被好本發明製備的純化mcp抗原的酶標板上加100μl稀釋好的大鯢虹彩病毒陰、陽性對照血清，於37℃溫育45min，洗滌3次後，再加上述細胞培養上清100μl，37℃反應30min，洗滌3次，加稀釋好的羊抗鼠igghrp，再洗板3次，加入顯色液，10min後用酶標儀測每孔od630nm讀值。結果顯示，陽性血清孔的od630nm值小於陰性血清孔od630nm值一半。因此，所述的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單克隆抗體具有阻斷作用。所述的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單抗已按照發明人公開的方法(周小願，張星朗，賈秋紅，等.抗大鯢虹彩病毒mcpcoe蛋白單克隆抗體的製備及初步應用[j].水產學報，2016，40(12)：1923-1930)進行了大量製備和純化。所述的小鼠抗大鯢虹彩病毒mcp單抗的標記，其步驟是：稱取5mg辣根過氧化物酶(hrp)溶於1ml雙蒸水中，加500μl新配置的0.06mol/l的naio4，4℃放置30min，此時溶液呈早綠色，加入0.5ml乙二醇(0.16mol/l)室溫避光反應30min。再加入5mg/ml的純化單克隆抗體1ml，在0.05mol/lph9.5的碳酸鹽緩衝液中4℃透析過夜。吸出後加5mg/ml新配置的nabh40.2ml，4℃放置2h，再加等體積的飽和硫酸銨溶液，4℃放置30min，7000rpm離心10min，棄上清，用生理鹽水重懸，再在0.15mol/lph7.4的pbs中透析過夜。收集透析袋中標記的抗體進行工作濃度標定，然後分裝於20ml瓶中，4℃保存備用。(每個批次的酶標抗體都要進行工作濃度標定)。實施例6一種大鯢虹彩病毒阻斷elisa抗體檢測試劑盒在檢測大鯢虹彩病毒抗體中的應用，其步驟是：1)從試劑盒中取出已包被有本發明製備的mcp蛋白抗原包被板，將待檢血清用樣品稀釋液按1∶4稀釋，每孔100μl加入到抗原包被板中，同時設陰、陽性對照孔，各設2孔，每孔100μl；2)輕輕振勻孔中樣品，置37℃45min，甩掉孔中的溶液，用洗滌液洗板3次，200μl每孔，最後一次在吸水紙上拍幹；3)每孔加酶標單抗100μl，置37℃30min，洗滌3次，方法同步驟(2)，每孔加顯色液a、顯色液b各50μl，混勻，室溫(20～25℃)避光顯色10min，每孔加終止液50μl，15min內用酶標儀測定每孔od630nm讀值。本發明試劑盒判定標準為：試驗成立條件是陰性對照的平均od630nm值大於0.50，陽性對照的阻斷率(pi％)大於50％。若樣品的阻斷率(pi％)大於或等於40％，判為大鯢虹彩病毒抗體陽性。若樣品的阻斷率(pi％)小於或等於30％，判為大鯢虹彩病毒抗體陰性。若樣品的阻斷率(pi％)在30％～40％之間，該樣品必須重測，如果結果相同，則過一段時間後重新從動物取樣進行檢測。阻斷率(pi％)＝(陰性對照平均od630nm值-樣品od630nm值)/陰性對照平均od630nm值×100％。1.特異性試驗用大鯢虹彩病毒阻斷elisa抗體檢測試劑盒檢測大鯢虹彩病毒(cgsiv)、中華鱉病毒(soft-shelledturtlevirus，stv)、飾紋汀蛙病毒(bohleiridovirus，biv)、鯉春病毒血症病毒(springviremiaofcarpvirus，svcv)、草魚呼腸孤病毒(grasscarpreovirus，gcrv)、虹鱒傳染性胰腺壞死病病毒(infectiouspancreaticnecrosisvirus，ipnv)、錦鯉皰疹病毒(koiherpesvirus，khv)等陽性血清，所述的上述病毒陽性血清由上述活病毒感染各自的天然宿主得到。檢測結果表明，除了大鯢虹彩病毒陽性血清的阻斷率(pi％)明顯大於50％外，其餘血清的阻斷率(pi％)均＜30％，符合陰性血清的判定標準，表明這種方法特異性良好。表1特異性血清的檢測血清cgsivstvbivsvcvgcrvipnvkhv陽性對照陰性對照od6300.1401.0421.1020.9070.9851.0230.9650.1251.230pi(％)88.6215.2810.4126.2619.9216.8321.54--2.靈敏度試驗取5份大鯢虹彩病毒陽性血清按不同稀釋倍數稀釋後用本發明製備的elisa試劑盒進行檢測，可以看到當陽性血清最高稀釋到16倍時，檢測結果仍為陽性，表明試劑盒具有很高的靈敏度。3.本發明製備的大鯢虹彩病毒抗體elisa檢測試劑盒應用用本發明製備的elisa檢測試劑盒對來自陝西不同地區的大鯢養殖場採集的85份大鯢血清樣品進行了檢測，結果顯示，在85份送檢樣品中，陽性樣品44份，陰性樣品41份，陽性率51.76％。表2靈敏度檢測以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁12