一種水飛薊賓的檢測方法

2023-12-12 04:40:27 1

專利名稱：一種水飛薊賓的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物檢測方法，特別涉及一種治療肝病的藥物水飛薊賓的檢測方法。
背景技術：
水飛薊賓是菊科植物水飛薊中提取分離得到的黃酮類化合物，具有保肝、護肝等功效。近年來藥效學研究表明，水飛薊賓還具有較強的抗炎，抗腫瘤活性。定天明等採用膠束電泳毛細管色譜法對水飛薊賓的非對映體(水飛薊賓A和水飛薊賓B)進行了分離，從而證明了水飛薊賓為兩個非對映體的混合物，其化學結構見圖1。目前，已有多篇文獻報導了水飛薊賓在動物和人體內的定量分析研究，但有關水飛薊賓A和水飛薊賓B各自的藥動學研究報導極少。Rickling等採用高效液相色譜-電化學法(HPLC-ECD)測定人血漿中水飛薊賓A和水飛薊賓B的濃度，但該方法的靈敏度低，且樣品預處理較為繁瑣，不能滿足藥動學研究需要。本實驗建立了一種簡單、快速、靈敏的LC-MS/MS方法，同時測定大鼠血漿中水飛薊賓A和水飛薊賓B濃度，並成功用於水飛薊賓A和水飛薊賓B各自的藥動學及生物利用度研究。

發明內容
本發明建立一種簡單、快速、靈敏的液-質聯用法(LC-MS/MS)，該方法用於測定血漿中水飛薊賓A與水飛薊賓B濃度。本發明的方法，包括以下步驟步驟1、含有水飛薊賓A與水飛薊賓B的血漿經沉澱蛋白預處理；步驟2、將經過預處理的血漿，經液-質聯用儀，測定其中水飛薊賓A與水飛薊賓B 濃度。優選的本發明的方法如下0. ImL血漿樣品經沉澱蛋白預處理後，以甲醇-0. 1% 甲酸 08 52，ν/ν)為流動相，採Eclipse XDB-C18 色譜柱(150X2. 1 匪，5 μ m) 分離，以ESI源負離子模式、選擇反應監測(SRM)方式進行定量分析。本發明的檢測方法，其中水飛薊賓A與水飛薊賓B在血漿中的線性範圍為 2.0-500001^.111171,最低定量限(LLOQ)為Z.Ong.mr1。藥物的日內、日間精密度在9. 1 % 以內，準確度(相對誤差)小於士5.7%。


圖1水飛薊賓A (a)和水飛薊賓B (b)的化學結構圖2水飛薊賓A(a)、水飛薊賓B(b)和柚皮苷(c)的質譜3血漿樣品色譜4水飛薊賓A和水飛薊賓B在大鼠體內的平均藥-時曲線
a-水飛薊賓A，靜脈注射13. 3mg/kg;b-水飛薊賓A，灌胃給藥13. 3，26.6 and 53. 2mg/kg ；C-水飛薊賓B，靜脈注射14. 7mg/kg;d-水飛薊賓B，灌胃給藥14. 7，29. 4 and 58. 8mg/kg.
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步敘述，以使公眾對發明內容有更深入的了解，並非對本發明的限制，凡依照本發明公開內容所進行的任何本領域等同替換， 均屬於本發明的保護範圍。實施例11材料與方法1. 1藥品與試劑水飛薊賓A和水飛薊賓B標準品(天津天士力集團研究院自製，純度>98. 5%)； 內標柚皮苷(中國藥品生物製品檢定所，純度> 99.0%，批號110722-200610)；水飛薊賓膠囊(天津天士力製藥股份有限公司，規格35mg水飛薊賓/粒，批號090509)；乙腈為色譜純(美國Fisher公司)；其餘試劑均為分析純。1. 2 儀器Finnigan TSQ Quantum三重四極杆液-質聯用儀(美國Finigan公司)；XW-80A 微型漩渦混合儀(上海盧西分析儀器廠有限公司)；TG 16W微量高速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)。1. 3色譜條件色譜柱ZorbaxEclipse XDB-C18 柱(150X 2. 1mm，5 μ m)，美國 Agilent 公司；流動相甲醇-0. 甲酸(48 52，ν/ν)；流速0. 25mL · min—1 ；柱溫:30°C ；進樣量=IOyL01. 4質譜條件離子源為電噴霧離子源，負離子方式檢測；噴霧電壓3800v ；毛細管溫度390°C ；鞘氣(N2)壓力25Psi ；輔助氣(N2)壓力3psi ；碰撞氣(Ar)壓力為1. 4mTorr ；掃描方式為選擇性反應監測(SRM)；碰撞能量(CE)分別為20eV(水飛薊賓A和水飛薊賓B)和34eV(柚皮苷)，用於定量分析的離子反應分別為m/z481. 1 — m/z 300. 9 (水飛薊賓A和水飛薊賓 B)和m/z 579.2 —m/z 271.1(柚皮苷)。水飛薊賓Α、水飛薊賓B和內標柚皮苷的二級全掃描質譜圖見圖2。1. 5實驗動物與實驗方案1. 5. 1實驗動物Wistar大鼠，雄性，體重Q20 士 20) g(北京維通利華實驗動物中心)。1. 5. 2靜注、灌胃用水飛薊賓溶液的配置精密稱取水飛薊賓140mg，溶於25mL聚乙二醇200 乙醇二純水(5:2: 3,v/v/v)混合溶液中，即得水飛薊賓靜注溶液；分別取4，8和16粒水飛薊賓膠囊，去殼，混懸於70mL 二純水中，配置成水飛薊賓低、中、高3個劑量的灌胃液。上述給藥溶液均需現用現配。1.5.3給藥及血樣採集5隻大鼠按^mg ^kg4靜脈注射給予水飛薊賓靜注溶液(相當於水飛薊賓A13. 3mg · kg—1，水飛薊賓B14. 7mg · kg—1) ；15隻大鼠分別按沘，56和lUmg^g—1灌胃給予低、中、高3個劑濃度的水飛薊賓混懸液(相當於水飛薊賓A13. 3，26. 6 和 53. 2mg · kg、水飛薊賓 B14. 7，29. 4 和 58. 8mg · kg-1)。大鼠給藥後 0,0. 17,0. 33，0. 67， 1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12. Oh,經大鼠眼球後靜脈叢採集靜脈血約0. 3mL,置肝素化試管中，3500r · miiT1離心lOmin，分離血漿，置_20°C冰箱中冷凍保存待測。1. 6血漿樣品預處理取血漿樣品100 μ L置於1. 5mL Eppendorf管中，依次加入乙腈100 μ L，內標溶液 (200ng · mL-1柚皮苷溶液，乙腈配置)100 μ L，旋渦Imin,然後於12000r · mirT1離心8min, 取上清液 ο μ L進行LC-MS/MS分析。2 結果2. 1專屬性考察由圖3可見，在「1. 3」所述條件下，水飛薊賓Α、水飛薊賓B和內標的保留時間分別為6. 45，7. 35和2. 55min，且血漿中的內源性物質不幹擾待測物與內標的測定。2. 2線性範圍及靈敏度取大鼠空白血漿，加入水飛薊賓A、水飛薊賓B標準溶液，配製成含水飛薊賓A和水飛薊賓 B2，5，20，50，500，2000，20000 和 50000ng · ml/1 的血漿樣品，按 「 1. 6 」 項操作， 記錄色譜圖；以血漿樣品中待測物的濃度為橫坐標，待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標，用加權(W = 1/X2)最小二乘法進行回歸運算，求得水飛薊賓A的回歸方程為Y = 0. 00125Χ+0. 00063 (r = 0. 9981)，水飛薊賓 B 的回歸方程為Y = 0. 00122Χ+0. 00096 (r =0. 9959)，本法水飛薊賓A和水飛薊賓B的線性範圍均為2 50000ng · mL"1, LLOQ為 2ng · mL-1 (S/N > 10)。2. 3精密度與準確度取大鼠空白血漿若干份，分別加入水飛薊賓A和水飛薊賓B標準溶液，配置成水飛薊賓A和水飛薊賓B濃度為20，500，20000ng -πιΓ1的血漿樣品，按「1. 6」項操作，每個濃度進行6樣本分析，連續測定3天，計算精密度(日內、日間RSD)與(RE)結果見表1。2.4提取回收率取空白血漿100 μ L，製備水飛薊賓A和水飛薊賓B濃度為20，500，20000ng · mL-1 的血漿樣品，按「1. 6」項操作，每個濃度進行3樣本分析，記錄色譜峰。同時，另取純水 IOOy L代替空白血漿，同法操作，獲得相應峰面積，以二者色譜圖的峰面積之比考察樣品的提取回收率。結果表明，在上述3個濃度下水飛薊賓A的提取回收率分別為95. 2士2. 2%, 93. 2士 1. 7%和95. 4士4. 5%，水飛薊賓B的提取回收率分別為94. 3士5. 1%,94. 7士4. 1% 禾口 96. 1 士 1. 9%，內標的提取回收率為93. 8士5. 4%。2. 5穩定性考察本實驗分別考察了血漿樣品-20°C凍存2個月，凍-融3個循環及血漿樣品處理後室溫放置Mh的穩定性。結果表明，水飛薊賓A和水飛薊賓B在上述3個條件下穩定性良好。2. 6藥動學及生物利用度研究水飛薊賓A和水飛薊賓B在大鼠體內的藥-時曲線圖見圖4，Topfit 2.0軟體用於計算其主要藥動學參數，見表2和表3。經統計分析，水飛薊賓A和水飛薊賓B的主要藥動學參數Cmax，AUCchJP AUCchoo與給藥劑量呈線性關係。由公式F = (AUCi. g./AUCi. J X 100%,計算得到水飛薊賓A和水飛薊賓B的絕對生物利用度分別為2. 86%和1. 93%。本實驗對正離子和負離子兩種電離模式進行了比較，結果顯示負離子模式下水飛薊賓A和水飛薊賓B的響應值遠高於正離子模式，故選負離子模式檢測。水飛薊賓和內標的分子離子峰[Μ-ΗΓ分別為m/z 481. 1和579. 2，由圖2可見，水飛薊賓和內標分別在m/z 300. 9和271. 1的子離子峰強度最大，故分別選擇m/z 481. 1 — m/z 300. 9和m/z 579. 2 -m/z 271. 1檢測水飛薊賓和內標。儘管水飛薊賓A和水飛薊賓B定量分析的離子反應均為為m/z 481. 1-m/z 300. 9，但本實驗通過比較所選定的色譜條件保證水飛薊賓A 和水飛薊賓B具有良好的分離度，從而確保了方法具有良好的專屬性。本實驗建立了一種簡單、快速、靈敏的LC-MS/MS方法，同時測定大鼠血漿中水飛薊賓A和水飛薊賓B濃度，並首次報導了水飛薊賓A和水飛薊賓B在動物體內的藥動學及生物利用度研究數據，為水飛薊賓及其製劑的深入研究奠定基礎。以下為附表表1精密度與準確度實驗結果Tab. 1 Precision and accuracy of the method
權利要求
1.一種水飛薊賓的檢測方法，包括以下步驟步驟1、採集含有水飛薊賓A與水飛薊賓B的血漿，經沉澱蛋白預處理；步驟2、將經過預處理的血漿，經液-質聯用色譜儀，測定血漿中水飛薊賓A與水飛薊賓 B濃度。
2.權利要求1的檢測方法，其特徵在於，所述色譜條件為色譜柱=ZortaxEclipse XDB-C18柱體積為150 X 2. Imm,粒徑為5 μ m，美國Agilent公司；流動相甲醇-0. 1 %甲酸為 48 52 ；流速0. 25mL · mirT1 ；柱溫:30°C ；進樣量10μ L。
3.權利要求1的檢測方法，其特徵在於，其中水飛薊賓A與水飛薊賓B在血漿中濃度的線性範圍為2. 0-50000ng · mL—1，最低定量限為2. Ong · mL—1，藥物的日內、日間精密度在 9. 以內，相對誤差小於士5. 7%。
4.權利要求1的檢測方法，其特徵在於，所述預處理包括取血漿樣品100μ L置於 1. 5mLEppendorf管中，依次加入乙腈100 μ L，內標溶液為200ng · mL—1柚皮苷溶液，乙腈配置，用量100 μ L，旋渦lmin，然後於12000r · mirT1離心8min，取上清液10 μ L進行LC-MS/ MS測定。
5.權利要求1的檢測方法，其特徵在於，所述血漿來源於動物，是動物經過服用水飛薊賓A和水飛薊賓B藥物後經過取血後處理得到的。
6.權利要求5的檢測方法，其特徵在於，所述服用包括靜注和口服。
7.權利要求5的檢測方法，其特徵在於，所述水飛薊賓A和水飛薊賓B藥物用以下方法得到稱取水飛薊賓140mg，溶於25mL聚乙二醇200 乙醇二純水為5 2 3混合溶液中，即得水飛薊賓靜注溶液；取水飛薊賓膠囊，去殼，混懸於70mL 二純水中，配置成水飛薊賓的口服液。
8.權利要求1的檢測方法，其特徵在於，所述液-質聯用色譜儀器為FirmiganTSQ Quantum三重四極杆液-質聯用儀。
9.權利要求1的檢測方法，其特徵在於，所述質譜條件為離子源為電噴霧離子源， 負離子方式檢測；噴霧電壓3800v ；毛細管溫度390°C ；鞘氣隊壓力25Psi ；輔助氣隊壓力 3psi ；碰撞氣Ar壓力為1. 4mTorr ；掃描方式為選擇性反應監測SRM ；碰撞能量CE分別為水飛薊賓A和水飛薊賓B20eV、柚皮苷34eV，用於定量分析的離子反應分別為水飛薊賓A和水飛薊賓 B m/z481. 1 — m/z 300. 9、柚皮苷 m/z 579. 2 — m/z 271.1。
10.權利要求1的檢測方法，其特徵在於，所述採集血漿方法如下靜脈注射給予水飛薊賓靜注溶液，灌胃給予水飛薊賓混懸液，給藥後經靜脈採集靜脈血，置肝素化試管中，離心，分離血漿待測。
全文摘要
本發明屬於醫藥領域，具體涉及一種水飛薊賓的檢測方法，本發明的方法，包括以下步驟步驟1、含有水飛薊賓A與水飛薊賓B的血漿經沉澱蛋白預處理；步驟2、將經過預處理的血漿，經液-質聯用儀，測定其中水飛薊賓A與水飛薊賓B濃度。
文檔編號G01N30/02GK102478553SQ201010556030
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月23日 優先權日2010年11月23日
發明者萬梅緒, 周水平, 李偉, 慄志文, 褚揚, 郭嘉華, 馬曉慧 申請人:天津天士力製藥股份有限公司