梳式斑點免疫檢測法的製作方法

2023-12-11 23:40:32

專利名稱：梳式斑點免疫檢測法的製作方法
技術領域：
本發明涉及人類免疫缺陷病毒HIV1+2型抗體檢測法，具體是一種梳式斑點免疫檢測法。
國際上檢出愛滋病的方法有多種如間接ELISA測定法、直接FIA測定法、免疫印跡法測定法、Biochrom測定法、IAF Biochem測定法、Pharmacia測定法等[AIDS.1990 Apr；4(4)355-60]。其中以合成多肽作為愛滋病的診斷試劑，因其肽是通過純化學法合成，不引入任何汙染抗原，具有高特異性和高敏感性等優點，是很有發展前途的一種診斷試劑[國外醫學預防1989，12(5)，193-195]。95年美國Schwartz-DH等敘述各種商用HIV抗體診斷試劑盒對測試的血清樣品，其HIV感染的檢出是100％的靈敏，Murex Single應用診斷系統和UntiedBiomedical公司的HIV-1/2酶免疫測定(ELA)試劑盒檢出HIV-1gp41的抗體的專一性達98～100％[Clin-Diagn-Lab-Immunol.1995 May；2(3)268-71]。94年西班牙Fernandez-Rodriguez-E等敘述使用快速診斷免疫酶測定(測試包為HIV1/HIV-2)，在唾液裡檢出HIV抗體，此法對靜脈藥物泛用的人群意義尤為重大。文獻敘述了從70名愛滋病患者的血清和唾液裡，均能用此法同時和預期測量抗-HIV抗體[Rev-Clin-Esp.1994 Jul；194(7)523-5]。
國內中國發明專利CN 1052310是美國病毒技術公司在90年10月在中國申請的專利，文中敘述特異性肽片段HIVp17被用作檢測和治療愛滋病的診斷劑和疫苗。
本發明的目的是提供一種梳式斑點免疫檢測法，用於檢測血清、血漿或全血的HIV1+2抗體。
本發明的上述目的是通過以下方式實現的一種梳式斑點免疫檢測法，包括將含HIV-1gp41和HIV-2gp36的人工合成多肽抗原色被於梳齒上，經與標本中存在的HIV反應形成抗原——抗體複合物，再與金標A蛋白作用，抗體陽性者梳齒尖即呈現紅色斑點，陰性者無色。
本發明的優點是明顯的，本方法通過特殊的合成肽，減少了非特異性反應；採用金標代替酶標，大大縮短檢測所需的時間；使用梳條代替酶標板，無需任何設備，結果易於判斷並可永久存檔，而且靈敏度高達100％，特異性為99.9％；時間短，在20分鐘可獲得檢測結果，所以適於臨床、基層血站和落後邊緣地區推廣使用；另外，它適於長期存放，置於37℃可達二周，22℃三個月，4℃一年靈敏度，特異性不受影響。
本發明方法中採用的HIV-1gp41和HIV-2gp36合成抗原的純度＞95％，溶解度≥1mg/ml，在濃度＜2μg/ml時有強的抗原性，HIV-1gp41和HIV-2gp36其序列分別為gp41Arg-Ile-leu-Ala-val-Glu-Arg-Tyr-leu-lys-Asp-Gla-Gln-lev-Gly-Ile-Trp-Gly-Cys-Ser-Gly-lys-lev-ile-Cys-NH2gp36AGln-Asp-Gln-Ala-Arg-leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Ary-Gln-Val-Cys-NH2。
A蛋白是一分子量42KD的多肽，是金黃色葡萄球菌S.aureus的正常膜組份。抗體分子有兩個A蛋白的結合位點，位於重鏈的第二和第三恆定區。但是由於來源於不同動物的抗體以及不同的抗體型和亞型之間，其FC片斷不同，因此A蛋白與不同抗體的親合能力也不相同。A蛋白與來源於人、免、鼠的抗體具有很強的親合力。
A蛋白與抗體FC片斷的結合是通過疏水作用完成的，因此不會改變該抗體與抗原的結合活性。通過與酶、螢光素、膠體金等的結合，A蛋白可以用來對抗體進行定位或定量。
本發明使用的A蛋白，每mg可結合10-11mg人IgG。並具有如下的質量指標外觀肉眼觀察為冰凍乾燥粉未。
光吸收在275nm光吸收，當10mg/mL濃度的A蛋白溶液A275≥1.32，樣品光吸度(275nm)不低於此標準品的88％。
光譜特性在250-350nm的光掃描圖譜，其最大光吸收在275nm，最小光吸收在250nm，在267nm存在一個峰，在320nm的光吸收應小於0.04。
純度用聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定為銀染色單一條帶(42KD)。
以下將結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。
實施例梳式斑點免疫檢測法一、試劑和包被梳的製備(1)點梳液的配製配方HIV-1gp41(購自美國BCI公司)0.1mgHIV-2-gp36(購自美國BCI公司)0.15mgNa2CO3(AR)0.6gNaHCO3(AR)0.29g用重蒸餾水稀釋至100ml的溶液PH＝9.6，採用8μl/孔點於18齒塑料梳尖上，於4℃過夜。
(2)封閉液的配製配方NaCl(AR)1.7g 0.2MNa2HPO47.7ml0.2M NaH2PO42.3ml蔗糖(AR)10gBSA(購自美國Sigma公司)0.2g用重蒸餾水稀釋成200ml的溶液pH＝7.4，採用10μl/孔封閉上述(1)梳點，於37℃二小時，乾燥真空包裝後備用。
(3)顯示劑的配製配方1％氯化金60ml1％檸檬酸鈉240ml加重蒸餾水至5000ml後，加熱煮沸15分鐘，冷卻至30℃，再加入A蛋白(購自美國BCI公司)9mg5％BSA(購自美國Sigma公司)1g於12000轉/分離心60分鐘，棄上清液，沉澱中加入乙二醇(AR)20mlNaN3(購自美國Sigma公司)1g用0.01M PBS(AR)稀釋至2000ml(λ＝525nm 0D＝0.35)。
(4)樣品稀釋液配製配方0.2M Na2HPO428ml0.2M NaH2PO472mlNaCl(AR)17gNaN3(購自美國Sigma公司)0.48BSA(購自美國Sigma公司)0.2gTween-20(購自美國Sigma公司)1ml用重蒸餾水稀釋至2000ml(5)抗HIV1+2陽性對照配製配方HIV1+2陽性血清(購自美國BCI公司)80mlNaN3(購自美國Sigma公司)0.1g將其混勻後使用。
(6)抗HIV1+2陰性對照配製配方HIV1+2陰性血清(購自美國BCI公司)80ml
NaN3(購自美Sigma公司)0.1g將其混勻後使用。
(7)洗滌液配製配方NaCl(AR)170gNaN3(購自美國Sigma公司)4g0.2Mna2HPO4770ml0.2MNaH2PO4230mlTween-20 20ml加重蒸餾水至20000ml pH＝7.4。
二、檢測方法(1)標記待檢樣品和檢測梳的編號、位置和日期。
(2)在微孔反應板的每一標孔內加上述樣品稀釋液1滴，再分別加入待檢樣品或上述抗HIV1+2陽性和陰性的對照品1滴(50μl，充分混勻。
(3)將檢測流插入相應的標本行中，室溫孵育10分鐘。
(4)在微孔反應板的第二排孔內，每孔加入上述顯示劑3滴。
(5)在洗滌槽中加入由20ml加80ml重蒸餾水的上述洗滌液。
(6)將孵育完畢的梳子取出，把齒尖放在吸水紙上吸去多餘液體。
(7)將梳齒插入稀釋好的洗滌液中，來回擺動10次，然後將齒尖放在吸水紙上吸去多餘液體。
(8)將梳齒插入上述顯示劑中，室溫孵育10分鐘，重複(6)～(8)，將檢測梳標記面向上放在吸水紙上晾乾。
(9)在強光或日光下與眼平齊、垂直觀察結果，梳尖具有粉紅色圓點均為陽性(即使是很淺的粉紅色圓點，沒有顏色為陰性。
(10)將梳子裝入檔案夾內存檔備查。
採用本方法檢測血清、血漿或全血的HIV1+2抗體的靈敏度高達100％，特異性為99.9％，操作簡單，無需反覆洗滌，操作時間短，僅需20分鐘，而其它諸如ELA法則需二小時左右，操作過程不需要特殊設備，結果易於判別，且可留檔備查，以便於與日後結果比較更具客觀性。
上述實施例僅為了說明的目的，本發明的保護範圍將在權利要求書中體現。
權利要求
1.一種梳式斑點免疫檢測法，其特徵包括將含HIV-1gp41和HIV-2gp36人工合成多肽抗原包被於梳齒上，梳齒與標本中存在的HIV反應，再與金標A蛋白作用，以梳齒顯示或不顯示粉紅色點進行判別，有粉紅色圓點為陽性，沒有顏色者為陰性。
2.如權利要求1所述的檢測法，其特徵包括(1)標記待檢樣品和檢測梳；(2)在微孔反應板的每一標孔內加樣品稀釋液1滴，再分別加入待檢樣品或抗HIV1+2陽性和陰性的對照品1滴後充分混勻；(3)將檢測梳插入相應的標本中，室溫孵育10分鐘；(4)在微孔反應板的第二插孔內，每孔加入顯示劑3滴；(5)在洗滌槽中加入由20ml加80ml重蒸餾水的洗滌液。(6)將孵育完畢的梳子取出，把齒尖放在吸水紙上吸去多餘液體。(7)將梳齒插入稀釋好的洗滌液中，來回擺動10次，然後將齒尖放在吸水紙上吸去多餘液體。(8)將梳齒插入顯示劑中，室溫孵育10分鐘，重複(6)～(8)，將檢測梳標記面向上放在吸水紙上晾乾。(9)在強光或日光下與眼平齊、垂直觀察結果，梳尖具有粉紅色圓點均為陽性(即使是很淺的粉紅色圓點)，沒有顏色為陰性。
全文摘要
本發明揭示一種人類免疫缺陷病毒HIV
文檔編號G01N33/53GK1195772SQ97106358
公開日1998年10月14日 申請日期1997年4月4日 優先權日1997年4月4日
發明者朱紹榮 申請人:上海榮盛生物技術有限公司