治療和預防眼疾病的方法

2023-12-08 18:50:56

治療和預防眼疾病的方法
【專利摘要】本發明提供了可用於通過CCR3的抑制而治療和預防新血管AMD的組合物和方法。所述組合物和方法可用於治療和預防包括但不限於新血管AMD的疾病和障礙。
【專利說明】治療和預防眼疾病的方法

【技術領域】
[0001] 本發明大體上涉及將能夠抑制CCR3或VEGF的表達和/或活性的試劑和VEGF信 號抑制劑單獨地或組合地用於治療和/或預防眼疾病例如繼發於幹（萎縮性）黃斑變性的 血管新生性老年性黃斑變性等眼疾病的方法。

【背景技術】
[0002] 血管新生也被稱為血管生成，是形成新的血管的過程。血管新生在正常發育期間 發生，並且還在組織受傷之後的傷口癒合中起重要作用。然而，血管新生也被認為是許多病 理學狀態包括例如癌症、類風溼性關節炎、動脈硬化、銀屑病和眼的疾病包括糖尿病性視網 膜病、糖尿病性黃斑水腫、和血管新生AMD的重要原因。在發達國家中，與血管滲漏和/或 血管新生相關的眼疾病是絕大多數視覺發病率和失明的原因 （Campochiaro (2004)Expert Opin. Bioi. Ther. 4:1395-402)。與眼部血管新生和血管滲透性增加相關的眼疾是視力減弱 和失明的主要原因。
[0003] 在發達國家中，老年性黃斑變性（AMD)是失明的主要原因。AMD有兩種主要的臨 床表現：萎縮性（乾性AMD)和溼性AMD。萎縮性AMD的特徵在於視網膜色素上皮（RPE)和 視神經視網膜的變性。萎縮性AMD的早期階段與RPE細胞層下的玻璃疣的形成有關。早期 萎縮性AMD可以發展成為末期疾病，其中RPE完全變性並且在黃斑區域中形成明顯分界的 RPE萎縮區域："地圖樣萎縮"。在此疾病形式中，RPE的變性導致黃斑的光感受器的繼發性 死亡，並且在這些情況中導致嚴重的視力減弱。
[0004] 患有乾性或地圖樣萎縮AMD的AMD患者中的約10-20%發生繼發的脈絡膜血管新 生（CNV)。此疾病形式被稱為"溼AMD"且可以與一些最嚴重的視力減弱相聯繫。在溼AMD 中，新的脈絡膜血管（新血管）在脈絡膜中增殖或可以貫穿Bruch膜並增殖進入RPE和視 神經視網膜並在其下增殖（參見例如Campochiaro et al. (1999)Mol. Vis. 5:34)。在典型 的情況中，萎縮性AMD在溼形式發生之前就在眼中發生，然而，在罕見的偶然情況中，新血 管或溼形式可以在沒有發生先前的萎縮性形式的情況下發生。在該疾病的兩種形式中，均 由於感光細胞的死亡而發生視力減弱，但在溼性AMD中，在CNV期間形成的AMD流體滲漏和 偶然發生的來自滲漏血管的內部出血（血管滲透性增加）也導致視力減弱。
[0005] 對於AMD，已成功開發出新的治療以解決溼AMD的一些方面，特別是由抑制血管內 皮生長因子（VEGF)或VEGF受體信號轉導途徑的各種分子導致的自CNV的滲漏血管出血減 少。
[0006] 趨化因子為涉及白細胞的運輸和募集的一大類小蛋白質（綜述參見Luster, New Eng. J. Med.，338, 436-445(1998))。它們由一大類細胞釋放並且起吸引和活化包括嗜酸性 粒細胞、嗜鹼性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、T和B淋巴細胞的各種細胞類型的作用。根 據與趨化因子蛋白的氨基末端鄰近的兩個保守的半胱氨酸殘基的間距分類，有兩類主要的 趨化因子，即CXC_(a )和(Χ_(β)趨化因子。
[0007] 趨化因子與屬於G-蛋白偶聯的七種跨膜-域蛋白家族的特異性細胞表面受體結 合（綜述參見Luster，1998)。除其他反應以外，趨化因子受體的活化導致細胞間鈣增加、細 胞形狀變化、細胞粘附分子的表達增加、脫粒和促進細胞遷移（趨化作用）。
[0008] 迄今為止，CC趨化因子受體的9個成員已被識別（CCR-1至9)。對於本發明特別 重要的是CC-趨化因子受體-3 (CCR-3)，其主要在嗜酸性粒細胞上表達，並且也在嗜鹼性粒 細胞、肥大細胞和Th2細胞上表達（Luster，1998)。已知在CCR-3處起作用的趨化因子例如 RANTES、MCP-3和MCP-4募集和活化嗜酸性粒細胞。
[0009] 先前已顯示人微血管內皮細胞表達CCR3 (Salcedo等，2001)且在CCR3受體處活 性的激動劑能夠起血管內皮的趨化劑的作用。通過在雞胚絨毛尿囊膜和主動脈環兩者中的 血管內皮細胞上的此趨化作用，此過程能夠促進血管的血管生成（Salcedo等，2001)。
[0010] 這些發現隨後被擴展至AMD中的研究（Takeda等，2009)，其證明抗CCR3抗體、抗 CCR3激動劑抗體、或CCR3的藥理學抑制劑的玻璃體內注射有效限制小鼠中雷射誘導後的 CNV程度。在接受雷射的在CCR3或特異性CCR3激動劑基因中具有純合基因缺陷的小鼠中 確認了這些數據。其他數據還顯示在CNV的雷射誘導之後CCR3激動劑CCL11和CCL24被 誘導（Takeda 等，2009)。
[0011] 將這些研究擴展至在嗜酸性粒細胞或肥大細胞（與CCR3的表達關係最密切的細 胞）的產生方面有缺陷的小鼠中，證明這些小鼠保持響應雷射光凝固術產生CNV的能力並 且在阻斷此疾病中仍然對於玻璃體內的CCR3拮抗敏感。
[0012] 所述研究強烈地暗示在限制雷射誘導的CNV生成中CCR3的作用機制不是通過對 於體嗜酸性粒細胞或肥大細胞的作用。玻璃體內的抗CCR3治療曾被用於控制這些模型中 的疾病這一事實也支持在眼中的更多局部的作用。研究還暗示抗CCR3治療不限制巨噬細 胞或中性粒細胞募集進入雷射誘導的CNV損傷（Takeda等，2009)。
[0013] 目前已有若干額外的獨立的研究確認了 CNV AMD小鼠模型中的這些發現；特別 地，在雷射有道德CNV AMD模型中口服給藥YM-344031是有效的（Mizutani等，2011)。然 而，儘管抗VEGF治療在此模型中是有效的，但當將CCR3拮抗劑給藥至視網膜下的空間時， 這樣的試劑似乎不能限制由共同給藥基質膠誘導的血管生成（Li等，2010)。
[0014] 在其他研究中，使用抗CCR3抗體的CCR3中合作用不改變響應雷射而在眼中生成 的VEGF的量，暗示CCR3和VEGF在控制CNV AMD中的作用可能是獨立的。相似地，中和抗 VEGF mAb的玻璃體內注射對於內皮細胞上存在的CCR3的表達沒有作用，進一步支持在齧 齒動物中在控制CNV中的此獨立作用的假設（Takeda等，2009)。
[0015] 檢查角膜病理性血管生成的研究也發現損傷/前列腺素 E2誘導的血管生成與 VEGF無關，但與嗜酸性粒細胞趨化因子有關，再次暗示在控制血管生成中嗜酸性粒細胞趨 化因子/CCR3軸可以為與VEGF無關的機制（Liclican等，2010)。
[0016] 通常認為抗VEGF治療在人類和動物模型中均通過降低已進入視網膜的新形成的 脈絡膜血管的血管滲透性而控制CNV，而不是直接作用於血管新生。研究也已暗示在人冠狀 動脈內皮細胞的培養物中，體外培養物的滲透性可以通過CCR3(嗜酸性粒細胞趨化因子） 的激動劑而增加（Jamaluddin等，2009)，顯示CCR3拮抗作用通常影響眼部血管的血管滲透 性的可能性。
[0017] Takeda等，2009的初始研究顯示CCR3在人CNV視網膜中表達但不在僅有萎縮 性AMD的視網膜中表達，沒有發展成為CNV疾病的臨床證據。表達用脈絡膜脈管系統的 標誌物⑶31 (PECAM-1)共同定位，且對於CNV AMD中的血管的特異性通過在視網膜纖維 化和黑素瘤兩者中均不存在染色而確認（Takeda等，2009)。在手術切除的人脈絡膜新血 管AMD組織中，天然CCR3激動劑嗜酸性粒細胞趨化因子-1 (CCL11)、嗜酸性粒細胞趨化因 子-2 (CCL24)和嗜酸性粒細胞趨化因子-3 (CCL26)也均被發現在間質中表達並且與血管共 同定位（Takeda等，2009)。在與小鼠模型相似的模型中，迄今為止沒有嗜酸性粒細胞或肥 大細胞與人AMD相關的證據，且實際上在人CNV AMD損傷中定位這些細胞的嘗試仍未獲得 任何顯著的發現（Takeda等，2009)。此外，嗜酸性粒細胞趨化因子被確認為人AMD的可能 的血清生物標誌物（Mo等，2010)，其中發現其與I型和II型AREDS患者和萎縮性AMD顯著 地相關（P〈_〇. 02-p〈0. 005)，但有趣的是與CNV AMD無關，但相同研究中的屍體解剖人眼的 檢驗暗示與早期AMD、萎縮性AMD和CNVAMD的關係，最強的染色與CNV AMD中的血管新生內 皮相關。在獲自早產患者的視網膜病變的玻璃體樣品的比較中，相對於血管惰性的疾病，還 發現嗜酸性粒細胞趨化因子與血管活性疾病顯著相關，暗示CCR3可能參與促進視網膜循 環中的血管生成（Sato等，2009)。
[0018] 因此，先前已證明AMD機械地發展自兩個不同的且不相關的途徑：血管生成和血 管滲透性。已顯示AMD可以使用抗VEGF抑制劑治療（W02007/064752)。已顯示使用CCR3 拮抗劑的玻璃體內治療可以影響CNV損傷的大小（Takeda等，2009)。
[0019] 出人意料地， 申請人:已發現，與由異位的視網膜VEGF生成誘導的或由高壓氧處理 誘導的新視網膜血管不同，CCR3拮抗作用對於特異性地降低脈絡膜新血管的血管滲透性和 血管生成具有作用，並因此可用於特異性地治療/預防（包括減慢疾病和/或其症狀的發 展）與血管新生AMD相關的脈絡膜血管滲透性。
[0020] 申請人:還已發現，阻斷疾病的血管生成途徑和滲透性途徑兩者在體內產生功能響 應。因此，用抗VEGF抑制劑和CCR3抑制劑的組合治療對於新血管AMD是有效的組合治療 和/或預防，其中兩種試劑均能獨立地影響損傷生長和血管滲透性並產生額外的作用。
[0021] 仍需要治療眼部血管新生障礙特別是血管新生AMD的新方法。本發明涉及這樣的 方法。


【發明內容】

[0022] 本發明涉及通過CCR3的抑制例如CCR3蛋白的表達和/或活性的抑制治療和/或 預防眼疾病和障礙的方法。在具體的實施方案中，能夠通過本發明的方法治療和/或預防 的眼疾病與血管新生和血管滲透性增加有關。具體而言，這樣的疾病包括例如但不限於老 年性黃斑變性等。
[0023] 在一個實施方案中，此處中公開的方法包括：向需要治療和/或預防眼疾病的對 象給藥包含抑制CCR3的試劑例如抑制CCR3的表達和/或CCR3蛋白的活性的試劑的藥物 組合物。並非意圖將本發明限於疾病的任何具體的階段（例如早期或晚期）。
[0024] 在一些實施方案中，本發明提供了通過阻斷CCR3活化的相關的酶活性和所有的 下遊效應器而抑制CCR3的方法。
[0025] 在一些實施方案中，脈絡膜新血管滲透性的預防和/或降低導致對與新血管AMD 相關的症狀的預防和/或降低（即防止疾病的進展）。
[0026] 在另一個實施方案中，本發明提供了治療和/或預防患有AMD或具有患AMD的風 險的對象中的AMD的方法，包括向對象給藥包含能夠抑制CCR3蛋白的活性和/或表達的試 劑的藥物組合物，其中CCR3蛋白的抑制降低AMD的進展或使AMD的症狀停止。
[0027] 在另一個實施方案中，本發明提供了治療和/或預防患有AMD或具有患AMD的風 險的對象的方法，包括向對象給藥包含能夠抑制CCR3蛋白的活性和/或表達的試劑的藥物 組合物，且另外與所述試劑組合給藥抗VEGF抑制劑或VEGF信號抑制劑，其中CCR3蛋白的 抑制降低AMD的進展或使AMD的症狀停止。
[0028] 在另一個實施方案中，本發明提供了預防患有幹AMD或地圖樣萎縮AMD的對象中 的萎縮視網膜背景上的CNV損傷的發展的方法，包括向對象給藥包含能夠抑制CCR3蛋白的 活性和/或表達的試劑的藥物組合物，其中CCR3蛋白的抑制預防這樣的損傷的發展，所述 試劑可以單獨給藥或與抗VEGF抑制劑組合給藥。
[0029] 在另一個實施方案中，本發明提供了預防萎縮性和非血管性AMD轉化/進展為新 血管AMD的方法，包括向對象給藥包含能夠抑制CCR3蛋白的活性和/或表達的試劑的藥物 組合物，其中對CCR3蛋白的抑制阻止了這樣的向新血管AMD的轉化，所述試劑可以單獨給 藥或與抗VEGF抑制劑組合給藥。
[0030] 在一些實施方案中，抑制CCR3的試劑能夠抑制CCR3的表達，例如抑制CCR3RNA的 翻譯以產生CCR3蛋白。在可選的實施方案中，抑制CCR3的試劑能夠抑制CCR3蛋白活性。 對於此處所公開的方法中的應用，涵蓋任何試劑。在一些實施方案中，實際可以為小分子、 核酸、核酸類似物、蛋白、抗體、肽、適配體或其變體或片段。在一些實施方案中，試劑為核酸 試劑例如RNAi試劑，例如siRNA、shRNA、miRNA、dsRNA或核酶或其變體。
[0031] 在一些實施方案中，抑制CCR3蛋白活性的試劑為小分子，例如但不限於CCR3 蛋白的小分子可逆抑制劑或不可逆抑制劑。在一些實施方案中，這樣的小分子為基於 嗎啉-乙醯胺的化合物。在一些實施方案中，CCR3的小分子抑制劑為例如但不限於 4-[[[[[[(2s)-4-[(3,4-二氯苯基）甲基]-2-嗎啉基]甲基]-氨基]羰基]-氨基]甲 基]苯甲醯胺或其藥學上可接受的鹽（CCR3抑制劑'994)。參見美國專利第7, 157, 457號 和第 7, 531，651 號。
[0032] 在另一個實施方案中，這樣的小分子為基於嗎啉脲的化合物。在一些實施方案 中，（〇3的小分子抑制劑為例如但不限於^[[(25)-4-[(3,4-二氟苯基）甲基]-2-嗎啉 基]-甲基]-3_[(甲基磺醯基）氨基]-苯乙醯胺或其藥學上可接受的鹽（CCR3抑制劑 '575)。參見美國專利第7, 101，882號。
[0033] 在一些實施方案中，當對象被給藥包含CCR3的抑制劑的藥物組合物時，所述方法 還可以包括向對象給藥額外的治療劑，例如但不限於包括AMD的眼疾病的治療中使用的治 療劑等。應理解，用於治療眼部疾病的治療劑的給藥可以涉及某些手術的施用，例如但不 限於視網膜聚焦雷射光凝固術、全視網膜光凝固術、玻璃體內給藥的留類例如去炎松、玻璃 體內給藥的包含氟輕鬆的甾類植入物、和玻璃體內給藥的抗VEGF治療劑例如帕唑帕尼、 Lucentis?、Avastin?、和 Afiibercept?。
[0034] 在一些實施方案中，如此處公開的用於新血管眼疾病或障礙的治療和/或預防的 方法可施用於對象例如哺乳動物對象。在一些實施方案中，給藥抑制CCR3蛋白的活性或表 達的試劑的對象為人類。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1顯示用GW766994進行系統地治療後通過螢光血管造影獲得的C57B16小 鼠中的CNV組定量。上方的圖顯示每眼的平均CNV損傷大小及相應的95%置信限。下 方的圖顯示眼底檢查圖像的實例，在CNV的雷射誘導後1周和2周時用CCR3拮抗劑 4-[[[[[[(2s)-4-[(3,4-二氯苯基）甲基]-2-嗎啉基]甲基]-氨基]羰基]-氨基]甲 基]苯甲醯胺（CCR3抑制劑'994) (2-30mg/kg QD 口服）和譜選擇性激酶抑制劑帕唑帕尼 (5-[[4-[ (2, 3-二甲基-2h-吲唑-6-基）甲基氨基]-2-嘧啶基]氨基]-2-甲基苯磺醯 胺）（20mg/kg QD 口服）治療小鼠後通過小鼠視網膜的直接螢光血管造影測定。
[0036] 圖2顯示057816小鼠中平均0爪^組定量及相應的95%置信限，是在0爪^的雷射誘 導後1周和2周時用CCR3抑制劑'994(8-30mg/kg QD和8mg/kg BID 口服）和譜選擇性激 酶抑制劑帕唑帕尼（pazopanib，20mg/kg QD 口服）治療小鼠後通過突光血管造影測定。
[0037] 圖3顯示JR5558小鼠中平均CNV組定量，是在用CCR3抑制劑'994進行系統地治 療後通過螢光血管造影測定。上方的圖顯示每眼的平均總CNV損傷面積及相應的95%置信 限。中間的圖顯示每眼的CNV損傷總數及相應的95%置信限，下方的圖顯示用CCR3抑制 劑'994(2-30mg/kg QD)治療小鼠後小鼠視網膜的直接螢光血管造影。在P14和P26之間 給藥化合物12天。
[0038] 圖4顯示用8mg/kg CCR3抑制劑'994BID系統性治療後通過螢光血管造影測定的 在JR5558mice小鼠中的CNV的組定量。上方的圖顯示每眼的平均CNV損傷總面積及相應 的95%置信限。中間的圖顯示每眼的CNV損傷總數及相應的95%置信限，下方的圖顯示用 CCR3抑制劑'994(8mg/kg BID)治療小鼠後小鼠視網膜的直接螢光血管造影。在P14和P26 之間將化合物給藥12天。
[0039] 圖5顯示用CCR3抑制劑'994 (8-30mg/kg QD)治療小鼠之後JR5558的脈絡膜（移 除視網膜）中血管CNV的組織化學檢測，使用同工凝集素 Μ染色。在P14和P26之間給藥 化合物12天。
[0040] 圖6顯示用CCR3抑制劑'994 (8-30mg/kg QD)治療小鼠之後JR5558的脈絡膜（移 除視網膜）中血管CNV的組織化學檢測，使用同工凝集素 Μ染色。在P14和P26之間將化 合物給藥12天。
[0041] 圖7顯示使用5ul l-10mg/ml CCR3抑制劑'994BID給藥至雙眼進行局部治療，通 過螢光血管造影測定的JR5558小鼠中的CNV的組定量，並與系統性給藥8mg/kg CCR3抑制 劑'994腹腔注射BID相比較。上方的圖顯示每眼的平均CNV損傷總面積及相應的95%置 信限。下方的圖顯示用CCR3抑制劑'994局部施用或系統性施用（8mg/kg腹腔注射BID) 治療小鼠之後每視網膜的CNV損傷總數及相應的95%置信限。在P14和P26之間將化合物 給藥12天。
[0042] 圖8顯示在用運載體、100ug抗-VEGFR2腹腔注射QD、30mg/kg CCR3抑制劑'994 腹腔注射QD、lOOug抗-VEGFR2腹腔注射QD加30mg/kg CCR3抑制劑'994腹腔注射QD和 50ug抗-VEGFR2腹腔注射QD加30mg/kg CCR3抑制劑'994腹腔注射QD的任一種系統性 給藥之後通過螢光血管造影測定的JR5558小鼠中的CNV的組定量。上方的圖顯示每視網 膜的CNV損傷總面積及相應的95%置信限。下方的圖顯示每視網膜的CNV損傷總數及相 應的95%置信限。在P14和P26之間給藥CCR3抑制劑'994,持續12天。自P14起給藥 抗-VEGFR2,持續6天，且自P19起再給藥5天。
[0043] 圖9顯示在用運載體、100ug抗-VEGFR2腹腔注射QD、30mg/kg CCR3抑制劑'994 腹腔注射QD、或lOOug抗-VEGFR2腹腔注射QD加30mg/kg GW766994腹腔注射QD任一種系 統性給藥之後通過螢光血管造影測定的JR5558小鼠中單個CNV損傷的血管滲透性的組定 量。在P24和P26之間將CCR3抑制劑'994和抗-VEGR2以及各種組合給藥2天。
[0044] 圖10顯示在通過雷射光凝固術誘導CNV之後獼猴個體的右眼和左眼中IV級損 傷的分析，在雷射前1天順序地給藥運載體，20mg/kg GW782415X ((S)-1-((4-(3, 4-二氯苄 基）嗎啉-2-基）甲基）-3-((2-甲基-2H-四唑-5-基）甲基）脲）（以下稱為"'415化 合物"）口服TID或3mg/kg TID 口服，持續16、24、或30天。
[0045] 圖11顯示獼猴全血中嗜酸性粒細胞趨化因子-1對嗜酸性粒細胞形狀變化的濃 度響應曲線，1〇ηΜ和ΙΟΟηΜ '415化合物的預溫育的作用示於附錄1中。Schild分析確定 '415化合物對於獼猴全血中嗜酸性粒細胞趨化因子-1刺激的嗜酸性粒細胞形狀變化的平 均PA2值為7. 8。
[0046] 圖12顯示將C57B16小鼠暴露於高壓氧（氧誘導的視網膜病變模型）之後，視網 膜血管生成（血管新生）的組定量的作用和8mg/kg腹腔注射BID的作用。
[0047] 圖13顯示將C57B16小鼠暴露於高壓氧（氧誘導的視網膜病變模型）之後，視網 膜血管生成（血管新生）的組定量的作用，以及l〇mg/ml局部給藥和SU4312 (5ug每5天， 眼周）給藥至一隻眼BID的作用。

【具體實施方式】
[0048] 發明人已發現CCR3抑制劑可以被用於眼部疾病特別是與新血管AMD相關的血管 滲透性的治療和/或預防，包括進展。
[0049] 發明人已發現CCR3抑制劑可以與抗VEGF治療劑和VEGF信號抑制劑組合使用用 於眼部疾病特別是與AMD相關的血管滲透性的治療和/或預防，包括進展。
[0050] 發明人還已發現CCR3抑制劑與抗VEGF抑制劑的組合可以特別地用於眼部疾病特 別是與AMD相關的脈絡膜血管新生的治療和/或預防，包括進展。由於CCR3抑制劑的相似 的作用在經歷暴露於高壓氧之後的血管新生（氧誘導的視網膜病變）的視網膜血管上不能 被證明，因此這些作用看起來是對脈絡膜特異性的。
[0051] 發明人已發現CCR3抑制劑可以用於萎縮視網膜背景例如患有與幹萎縮或地圖樣 萎縮相關的AMD的患者中的眼部疾病特別是脈絡膜血管新生的治療和/或預防，包括進展。
[0052] 發明人已發現CCR3抑制劑可以與抗VEGF治療劑和VEGF信號抑制劑組合用於萎 縮視網膜背景例如患有與幹萎縮或地圖樣萎縮相關的AMD的患者中的眼部疾病特別是脈 絡膜血管新生的治療和/或預防，包括進展。
[0053] 定義
[0054] 為了方便起見，此處收集整個申請（包括說明書、實施例、和所附的權利要求）中 使用的某些術語。除非另有定義，否則此處使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所 屬領域的普通技術人員通常理解的含義相同的含義。
[0055] 術語"疾病"或"障礙"此處可以互換地使用，指身體或一些器官的狀態的任何 變化，打斷或擾亂功能的執行和/或導致患病的人或與之接觸者諸如不適、機能障礙、痛 苦或甚至死亡等症狀。疾病或障礙也可以涉及犬癌熱（distemper)、生病（ailing)、微 恙（ailment)、重疾（malady)、障礙（disorder)、疾恙（sickness)、病痛（illness)、病 (complaint)、或感染（affectation) 〇
[0056] 術語"脈絡膜血管滲透性"或"可滲透的血管"通常被本領域技術人員稱為"滲漏 血管"。所述術語在此處中互換地使用以指脈絡膜脈管系統受損和血管滲透性增加。
[0057] 術語"試劑"指通常不存在於細胞中或不以給藥的水平存在於細胞中的任何實體。 試劑可以選自包含以下的組：化學品；小分子；核酸序列；核酸類似物；蛋白；肽；適配體； 抗體；或其片段。核酸序列可以為RNA或DNA，並且可以為單鏈的或雙鏈的，並且可以選地包 含以下的組：編碼感興趣的蛋白的核酸、寡核苷酸、核酸類似物例如肽-核酸（PNA)、假互補 PNA(pc-PNA)、鎖核酸（LNA)等。這樣的核酸序列包括例如但不限於編碼蛋白的核酸序列例 如起轉錄抑制因子、反義分子、核酶、小抑制性核酸序列例如但不限於RNAi、shRNAi、siRNA、 微RNAi (mRNAi)、反義寡核苷酸等的那些。蛋白和/或肽或其片段可以為任何感興趣的蛋 白，例如但不限於：突變蛋白；治療性蛋白和截短蛋白，其中所述蛋白通常不存在於細胞中 或在細胞中以較低的水平表達。蛋白也可以選自包含以下的組：突變蛋白、基因工程蛋白、 肽、合成肽、重組體蛋白、嵌合蛋白、抗體、中型抗體、微型抗體、三鏈抗體、人源化蛋白、人源 化抗體、嵌合抗體、修飾蛋白及其片段。可選地，由於將核酸序列引入細胞中及其導致在細 胞中產生CCR3的核酸和/或蛋白抑制劑的轉錄，所述試劑在細胞中可以為細胞內的。在一 些實施方案中，所述試劑為任何化學品、實體或部分，包括但不限於合成的和天然存在的非 蛋白質的實體。在某些實施方案中，所述試劑為具有化學部分的小分子。例如，包括未取代 的或取代的烷基、芳香的、或雜環基部分的化學部分，包括大環內酯、輕肌蛋白及其相關的 天然產物或類似物。可以已知試劑具有期望的活性和/或性質，或可以選自一類不同的化 合物。
[0058] 此處使用的術語"抑制"指CCR3蛋白或其變體或同源物的表達或活性被降低至足 以產生期望的作用的一定程度和/或一段時間，例如其中CCR3蛋白的抑制降低或停止血管 滲透性和/或脈絡膜血管新生等的症狀。活性的降低可以是由於影響CCR3的一個或多個 特徵，包括降低其催化活性或通過抑制CCR3的輔因子或通過與CCR3結合，活性的程度使得 結果是治療或預防眼部障礙。具體而言，CCR3的抑制可以使用用於CCR3抑制的分析測定， 例如但不限於通過使用如此處所公開的用於CCR3蛋白的生物學分析。
[0059] 術語"患者"、"對象"和"個體"在此處可以互換地使用，並且指被提供治療（包括 預防性治療）的動物，特別是人。此處使用的術語"對象"指人和非人動物。術語"非人動 物"和"非人哺乳動物"在此處可以互換地使用，包括脊椎動物例如哺乳動物例如非人靈長 類（特別是高級靈長類）、綿羊、狗、齧齒動物（例如小鼠或大鼠）、豚鼠、山羊、豬、貓、兔、奶 牛，和非哺乳動物例如雞、兩棲動物、爬行動物等。在一個實施方案中，對象為人。在另一個 實施方案中，對象為實驗動物或作為疾病模型的動物替代物。
[0060] 此處使用的術語"治療"包括降低、緩解或預防（包括預防進展）與AMD相關的病 症、疾病或障礙的至少一種不利作用或症狀。預防與AMD相關的病症、疾病或障礙的至少一 種不利作用或症狀的進展包括但不限於預防具有發展脈絡膜血管新生和/或隨後的脈絡 膜血管滲透性增加的對象中的萎縮視網膜背景上的CNV損傷的發展；和/或預防萎縮性和 非血管AMD轉化成為新血管AMD。用於測量治療的幾集結果的方法包括但不限於通過光學 相干層析成像測量的視網膜下的水腫的減少或保持、視力減弱的減少或保持、或通過最佳 矯正視敏度評價的視力獲得。血管滲透性增加和脈絡膜血管新生也通過螢光眼底血管造影 測定。
[0061] 此處使用的術語"有效量"指降低、停止或預防至少一種疾病的症狀或障礙例如 AMD的症狀或障礙的藥物組合物的治療劑的量。例如，使用此處公開的方法的有效量應被認 為是足以降低或預防疾病或障礙的症狀的量，例如AMD的完全或部分解決和/或保持（通 過0CT測量）或大於5個字母的最佳矯正視敏度的增加和/或保持（通過EDTRS視力表評 價）、或新血管的大小或血管滲透性降低（通過螢光眼底血管造影測定）。此處使用的有效 量還應包括足以預防或延遲黃斑水腫的發展、滲透性增強、CNV損傷的大小和相關的視力減 弱的量。此處使用的有效量還應包括足以預防或延遲疾病的症狀的發展、改變疾病症狀的 過程（例如但不限於減緩疾病的症狀的進展）、或逆轉疾病的症狀的量。
[0062] 此處使用的術語預防或防止具有發展脈絡膜血管新生和/或隨後的脈絡膜血管 滲透性增加的"風險的對象"中的CNV損傷的發展指例如患有幹或地圖樣萎縮AMD的患者。 [0063] 此處使用的術語"給藥"和"引入"互換地使用，指通過導致試劑在期望的位點至 少部分定位的方法或途經將如此處公開的抑制CCR3的試劑置於對象中。本發明的化合物 可以通過在對象中導致有效治療的任何適合的途徑給藥。
[0064] 此處使用的冠詞"一"指一個或指多於一個（即至少一個）冠詞的語法上的主語。 以舉例的方式，"一元素"指一個元素或多於一個元素。
[0065] 抑制CCR3的試劑
[0066] 在一些實施方案中，本發明涉及CCR3的抑制。在一些實施方案中，抑制為對編碼 CCR3的核酸轉錄物的抑制，例如對信使RNA(mRNA)的抑制。在可選的實施方案中，CCR3的 抑制為對CCR3的基因產物例如CCR3的多肽或蛋白或其同工型的表達的抑制和/或活性的 抑制。此處使用的術語"基因產物"指由基因轉錄的RNA或由基因編碼或由RNA翻譯的多 肽。
[0067] 在一些實施方案中，通過試劑抑制CCR3。人們可以使用任何試劑，例如但不限於核 酸、核酸類似物、肽、噬菌體、噬粒、多肽、類肽物、核糖體、適配體、抗體、小的或大的有機或 無機分子，或其任意組合。在一些實施方案中，可用於本發明的方法中的試劑包括起CCR3 表達的抑制劑作用的試劑，例如編碼CCR3的mRNA的抑制劑。
[0068] 可用於此處公開的方法中作為CCR3抑制劑的其他試劑可以為化學品、小分子、大 分子、或實體或部分，包括但不限於合成的和天然存在的非蛋白實體。在某些實施方案中， 試劑為具有如此處公開的化學部分的小分子。
[0069] 小分子
[0070] 在一些實施方案中，抑制CCR3的試劑為小分子。在本發明的方法中可以使用CCR3 的不可逆抑制劑或可逆抑制劑。
[0071] 在人類中有效的CCR3抑制劑為本領域技術人員公知的，並且包括經歷評價的 那些，例如經歷臨床前評價和臨床評價，包括第二階段臨床測試。SmithKline Beecham 及其繼任者GlaxoSmithKline已提交和公開了若干申請。CCR3的不可逆抑制劑已於TO 2002/26723A1、W003/082293、美國申請第 7, 101，882 號、第 7, 157, 457 號、第 7, 531，651 號 和第7, 560, 548號中公開，其全文具體地援引加入本文，並且其中公開了為CCR3抑制劑的 不同系列的嗎啉-乙醯胺和嗎啉脲化合物。
[0072] 在人類中有效的VEGF治療劑為本領域技術人員公知的，並且包括經歷評價的那 些，例如經歷臨床前評價和臨床評價，包括第二階段臨床測試，和/或在售的那些，包括帕 唑帕尼、Lucentis?、Avastin?、和 Afiibercept?。
[0073] 化合物4-[[[[[[(28)-4-[(3,4-二氯苯基）甲基]-2-嗎啉基]甲基]-氨基]羰 基]-氨基]甲基]苯甲醯胺（CCR3抑制劑'994)或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物為特 別有效的CCR3抑制劑，且可特別地用於此發明。
[0074] 化合物^[[(25)-4-[(3,4-二氟苯基）甲基]-2-嗎啉基]-甲基]-3_[(甲基磺 醯基）氨基]-苯乙醯胺（CCR3抑制劑'575)或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物為特別有 效的CCR3抑制劑，且可特別地用於此發明。
[0075] 可用於此處公開的方法中的其它CCR3抑制劑描述於已公開的專利和申請TO 2002/26723A1、W003/082293、美國專利第 7, 101，882 號、第 7, 157, 457 號、第 7, 531，651 號 和第7, 560, 548號中，並且可以使用此處公開的CCR3抑制分析發現。
[0076] 上述段落中列舉的所有申請都援引加入本文。相信這些文獻中公開的任何或所有 化合物都可用於AMD的預防或治療。如實施例中列舉的此處描述的模型可被本領域技術人 員使用以確定何種所公開的化合物或CCR3的其他抑制劑例如抗體或RNAi可有效地治療和 預防此處主張的眼部疾病或障礙。
[0077] 實施例
[0078] 此處所示的實施例涉及通過CCR3抑制用於眼部新血管障礙等的預防和/或治療 的方法和組合物。在整個此申請中引用了多個公開。全部這些公開和這些公開中引用的那 些參考文獻的公開全文援引加入本文，以更完全地描述本發明所述的【技術領域】的狀態。以 下實施例並非意圖將權利要求的範圍限於本發明，而是意圖例舉某些實施方案。本領域技 術人員想到的示例的方法的任何變體都意圖落入本發明的範圍內。
[0079] 在一些實施方案中，可以在此處公開的動物模型中評價抑制CCR3的試劑在降低 雷射誘導的CNV中的作用。
[0080] 在一些實施方案中，可以在此處公開的動物模型中評價抑制CCR3的試劑，例如獼 猴中的雷射誘導的脈絡膜新血管AMD研究。
[0081] 在一些實施方案中，可以在動物模型中評價單獨的抑制CCR3的試劑或其與抗 VEGF抑制劑的組合，例如在CNV AMD的JR5558獼猴模型中限制CNV的發展。
[0082] 實施例1
[0083] 方法
[0084] C57/BL6小鼠中雷射誘導的CNV
[0085] 將成年的12周齡雌性C57BL/6小鼠用於產生雷射誘導的CNV模型。通過腹膜內 鹽酸氯胺酮（25mg/kg)和賽拉嗪（10mg/kg)將小鼠麻醉，並通過局部託批卡胺（1% )使其 瞳孔擴張。在直視下使用二極體雷射器^80nm ;210mW功率、100ms持續時間、100m光斑直 徑）進行雷射光凝固術，使用手持蓋玻片作為接觸鏡並定位至雙眼中的視網膜的後極的2 點、10點和6點鐘位置。這些雷射設置持續地產生視網膜下的氣泡，其與Bruch膜的雷射 誘導的破裂和CNV的成功誘導密切相關。僅將其中形成氣泡的損傷包括入分析中。在誘導 CNV後1周和2周時使用Kowa Genesis小動物眼底照相機進行突光素血管造影。通過數 字圖像分析早期（螢光素注射後90秒）期間每損傷的強螢光的平均面積來對CNV損傷的 大小進行定量。通過局部託吡卡胺1%使瞳孔擴張，通過腹膜內注射給藥〇. 2ml螢光素鈉 (2% )。如果眼有能夠影響雷射能量輸送或血管造影的顯著的白內障或角膜病變，則將其排 除在外。
[0086] TR5558CNV 和分析
[0087] JR5558小鼠自發產生CNV (在萎縮背景中），在出生後約12天時CNV損傷第一次出 現。由P14開始，用不同量的大鼠抗小鼠 VEGF受體（VEGFR)-2阻斷抗體（MAB4431 ;R&D系 統）或純化的大鼠未免疫同型匹配對照IgG2a抗體（R&D系統）腹膜內處理JR5558小鼠， 在11天內總計10次給藥，並於P25進行最後一次給藥之24小時後通過螢光素血管造影術 (FA)分析CNV進展。對於用CCR3抑制劑'994處理的小鼠，自P14開始，通過腹膜內或通過 滴眼劑對其給藥不同濃度的所述藥物，持續總計12天，並且在P26時最後一次給藥之24小 時後，通過FA分析CNV進展。為了研究抗-VEGFR2抗體和CCR3抑制劑'994的組合作用， 自P14起，用各物質單獨地或組合地腹膜內處理小鼠，在11天內總計10次給藥，於P25進 行最後一次給藥的24小時後通過FA分析CNV進展。進行多個實驗來研究VEGF-A和CCR3 拮抗劑對現有CNV損傷所致的血管滲透性的影響，所用的JR5558小鼠在發生CNV損傷後僅 給藥兩天，並且是用不同量的VEGFR-2抗體或CCR3抑制劑'994或其組合在P24和P25時 處理。在P26進行螢光素血管造影術（FA)。
[0088] 螢光素血管誥影術（FA)和圖像分析
[0089] 使用2.5(%託批卡胺0^118(311&]^〇1]113，1?〇(31168七61'，附）使小鼠的瞳孔擴張並通過腹 膜內注射給藥0. 2ml於水中稀釋的突光素鈉（Bausch&Lomb) oKowa Genesis-Df眼底照相機 (Kowa, Tokyo, Japan)用於獲得染料運輸的早期（突光素注射後90秒）和晚期（7分鐘）時 的螢光素血管造影圖。在早期時，CNV組織的脈管系統明顯地由血管內的螢光素染料界定。 在晚期時，明顯有高螢光斑點形式的血管外螢光素。為了定量CNV面積，使用早期FA圖像 經Image J程序確定各眼中各個高螢光CNV的大小。用Image J從晚期（螢光素注射後7 分鐘）FA圖像的高螢光面積減去早期（螢光素注射後90秒）FA圖像的高螢光面積，來確定 各CNV的滲透性。
[0090] CNV損傷的視網臘全封固染色
[0091] FA後24小時時摘除眼球，並在4°C下用4%多聚甲醛（PFA)在PBS中的溶液固定3 小時。將移除了視網膜或未移除視網膜的眼杯解剖，在室溫下在含0.3% Triton X-100和 5% FBS的PBS緩衝液（封閉緩衝液）中封閉1小時，並在4°C下用在封閉緩衝液中1:200 稀釋的0.5%突光素異硫氰酸酯$11'〇-同工凝集素134(￥6(31:〇1'，13111'1;[叩31116,04)溫育整 夜。洗滌5次之後，用含DAPI的介質將樣本封固，並使用落射螢光顯微鏡觀察。
[0092] 獼猴中的雷射誘導的脒絡臘新血管AMD研究
[0093] 如表A中所示對獼猴給藥運載體或CCR3拮抗劑工具化合物' 415化合物，持續29 天，在雷射光凝固術之1天後出現雷射。在雷射後14、21和28天時進行螢光血管造影術分 析。
[0094]

【權利要求】
1. 治療和/或預防對象中與血管新生相關的眼部障礙或疾病的方法，所述方法包括： 識別患有與血管新生相關的眼部疾病或障礙或具有發展與血管新生相關的眼部疾病 或障礙的風險的對象，和 向有需要的對象給藥包含用於抑制CCR3蛋白的活性和/或表達的試劑的藥物組合物。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述眼部疾病或障礙為新血管AMD。
3. 治療和/或預防對象中與脈絡膜血管滲透性增加相關的眼部障礙或疾病的方法，所 述方法包括： 識別患有與脈絡膜血管滲透性增加相關的新血管AMD或障礙或具有發展與脈絡膜血 管滲透性增加相關的新血管AMD或障礙的風險的對象，和 向需要其的對象給藥包含用於抑制CCR3蛋白的活性和/或表達的試劑的藥物組合物。
4. 如權利要求1所述的方法，其中所述眼部疾病或障礙為乾性AMD或地圖樣萎縮AMD。
5. 治療和/或預防患有AMD的對象或具有患AMD的風險的對象中的AMD的方法，包括 向所述對象給藥包含能夠抑制CCR3蛋白的活性和/或表達的試劑的藥物組合物。
6. 如權利要求5所述的方法，其中CCR3蛋白的抑制降低AMD的症狀或使AMD的症狀停 止。
7. 治療和/或預防患有AMD的對象或具有患AMD的風險的對象中的AMD的方法，包括 向所述對象給藥包含能夠抑制CCR3蛋白的活性和/或表達的試劑的藥物組合物，其中CCR3 蛋白的抑制降低AMD的症狀或使AMD的症狀停止，此外，所述試劑與抗-VEGF抑制劑組合給 藥。
8. 預防具有發展脈絡膜血管新生和/或隨後的脈絡膜血管滲透性增加的風險的對象 中的萎縮視網膜背景上的CNV損傷的發展的方法，包括向所述對象給藥包含能夠抑制CCR3 蛋白的活性和/或表達的試劑的藥物組合物，其中所述CCR3蛋白的抑制預防這樣的損傷的 發展，所述試劑可以單獨給藥或與抗-VEGF抑制劑組合給藥。
9. 預防萎縮性AMD和非血管AMD轉化成為新血管AMD的方法，包括向對象給藥包含能 夠抑制CCR3蛋白的活性和/或表達的試劑的藥物組合物，其中所述CCR3蛋白的抑制防止 這樣的向新血管AMD的轉化，所述試劑可以單獨給藥或與抗-VEGF抑制劑組合給藥。
10. 如權利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，其中所述試劑為 4-[[[[[[(2s)-4-[(3,4-二氯苯基）甲基]-2-嗎啉基]甲基]-氨基]羰基]-氨基]甲 基]苯甲醯胺，或其藥學上可接受的鹽。
11. 如權利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，其中所述試劑為N- [ [ (2S) -4- [ (3, 4-二氟 苯基）甲基]-2-嗎啉基]-甲基]-3-[(甲基磺醯基）氨基]-苯乙醯胺，或其藥學上可接 受的鹽。
12. 如權利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，其中所述對象為哺乳動物。
13. 如權利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，其中所述對象為人類。
14. 如權利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，另外包括向對象給藥額外的治療劑。
15. 如權利要求14所述的方法，其中所述額外的治療劑為選自帕唑帕尼、 Lucentis?、Avastin?、和 Aflibercept? 的抗-VEGF 抑制劑。
16. 如權利要求1、3、5、7、8或9所述的方法，另外包括在給藥包含能夠抑制CCR3的試 劑的藥物組合物之後通過測量所述對象的視敏度來監控治療。
17. 能夠抑制CCR3的表達和/或活性的試劑在製備用於治療和/或預防眼部新血管障 礙的藥物中的用途。
18. 能夠抑制CCR3蛋白的表達和/或活性的試劑在製備用於治療和/或預防AMD的藥 物中的用途。
【文檔編號】A61K31/395GK104203231SQ201280068923
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2012年11月30日 優先權日:2011年12月1日
【發明者】P.亞當森, D.希馬, Y.S.E.恩格 申請人:葛蘭素集團有限公司