一種檢測口腔癌的標誌物及其試劑盒的製作方法

2023-12-09 04:46:06 3

本發明涉及生物
技術領域：
，具體地，公開了一種檢測口腔癌的標誌物及其試劑盒。
背景技術：
：DNA複製起始蛋白作為目前公認的表徵細胞增殖狀態的標誌物，已經被廣泛用於宮頸癌、膀胱癌、前列腺癌等各種癌症。Williams最早將DNA複製起始蛋白應用在尿液脫落細胞的檢測，在92例宮頸癌脫落細胞塗片和57例組織切片中以MCM5、CDC6、PCNA和Ki67為檢測對象，免疫螢光實驗結果表明，惡變細胞中可以觀察這幾種蛋白在不同病理階段的表達差異，其中MCM5與CDC6比PCNA，Ki67的敏感性更高。反映了DNA複製起始蛋白比傳統的細胞增殖標誌物更為敏感，因此可以考慮將其用於口腔癌的研究。目前關於DNA複製起始蛋白在口腔脫落細胞中的研究尚無報導。技術實現要素：本發明為了克服現有技術的上述不足，提供一種檢測口腔癌的標誌物。本發明的另一個目的是提供一種檢測口腔癌的試劑盒。為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的：一種檢測口腔癌的標誌物，由CDC6、CDT1、MCM2和CDC45四種DNA複製起始蛋白組成。CDC6、CDT1、MCM2和CDC45四種DNA複製起始蛋白在製備檢測口腔癌試劑盒中的應用。一種檢測口腔癌的試劑盒，該試劑盒以CDC6、CDT1、MCM2和CDC45四種DNA複製起始蛋白作為檢測靶標，根據以上四種DNA複製起始蛋白的mRNA表達量可以判斷口腔癌或口腔癌的發展階段。正常人、口腔炎症、癌前病變、口腔癌和術後階段所述口腔癌的發展階段是指細胞發展處於癌前病變、癌症期、癌症術後等。所述檢測四種DNA複製起始蛋白的mRNA表達量時，用於構建標準品的引物序列如SEQIDNO：1～10所示，用於擴增大於200bp的QRT-PCR引物序列如SEQIDNO：11～20所示，用於擴增小於150bp的QRT-PCR引物序列如SEQIDNO：21～30所示。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：本發明旨在通過對正常人，口腔炎症、癌前病變、口腔癌和術後階段的CDC6、CDT1、MCM2和CDC45mRNA水平進行定量檢測，同時結合臨床診斷結果，判斷這些腫瘤標誌物作為口腔癌早期篩選的理想腫瘤標誌物的可行性。探討口腔脫落細胞中腫瘤標誌物含量變化的機制，以及在預後判斷上的臨床價值。附圖說明圖1.CDC6(A)、CDT1(B)、MCM2(C)和CDC45(D)在正常組、炎症、癌前損傷、口腔癌和術後組的相對表達水平的箱式圖，箱式部分代表50％的四分位數(25％以上，75％以下)，粗線代表相對表達的均值，小圓圈代表出離範圍值。圖2為DNA複製起始蛋白mRNA相對表達均值比較，A：CDC6；B：CDT1；C：MCM2；D：CDC45。具體實施方式下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。實施例1一、研究對象：包括76例患病組患者和24例正常健康人作為對照組；患病組：2007～2008年在中山大學醫學院附屬第一醫院口腔科就診的患者中選取76例患者，其中炎症14例、癌前損傷(白斑)14例、口腔癌20例、術後28例(所有病例均手術擴大切除原發灶。炎症組多為牙周炎和口底蜂窩織炎，癌前損傷組為白斑和口腔良性腫瘤，口腔癌多為舌鱗癌、頰癌、頜骨癌、牙齦癌，患者臨床診斷均由病理診斷證實為口腔鱗狀細胞癌，全身檢查無其他惡性腫瘤。患者年齡在31～75歲之間，平均55歲。按照口腔患病類型分為，舌、牙齦、頰、頜骨、口底。對照組：24例正常健康人作為正常對照組，他們均來自經口腔檢查無牙周病、無炎症、無潰瘍，全身檢查無全身疾病的志願者。二、CDC6、CDT1、MCM2和CDC45的mRNA水平定量檢測，具體方法如下：1、RNA提取：受試者充分用清水漱口後，將漱口液用50ml離心管收集脫落細胞，4℃、8000g離心5min，棄上清，將管子倒置，使管中殘餘的水晾乾，按細胞的濃度加入TRIzol，提取RNA，詳細步驟參考本領域常規提取方法。2、第一鏈合成：提取的RNA逆轉錄為cDNA，貯存於-20℃備用，具體步驟詳見常規試劑盒說明書。3、螢光定量分析：由於要擴增的目的基因為真核生物，所以引物設計需要跨內含子設計。擴增的目的基因片段需要在標準品中克隆的基因片段之內，故每個基因各有一對構建標準品的引物和兩對用於螢光定量的引物(表1，2，3)。本試驗要檢測的目的基因共4個，另外還有一個看家基因，不能在同一管中完成5色的檢測，因此選用SYBRGreenI這種螢光染料。PCR擴增產物長度在80～150bp最為合適(可以延長至300bp)。試驗採用的是石蠟切片，有研究發現，石蠟包埋的組織中RNA會片段化，還有不同程度的甲基化。為了研究石蠟包埋對RNA的影響，故設計了兩種PCR引物，一對用於擴增長片段(200～300bp)，一對用於擴增短片段(80～150bp)。SYBRGreenI為雙鏈小溝結合染料，沒有序列特異性，所以對引物設計的要求較高，在擴增過程中產生的引物二聚體和非特異性擴增都會直接影響定量結果的準確性。故需要對擴增產物進行電泳和溶解曲線分析，確認PCR的特異性。採用SYBRGreenIPremixExTaqkit(TaKaRa)檢測目的基因(β-ACTIN、CDC6、CDT1、MCM2和CDC45)，嚴格按照使用說明進行操作。取上述合成的cDNA模板2μl，2×SYBRGreenIPremixExTaq10μl，上下遊引物各0.4μl，至終濃度為0.2μmol，用ddH2O補足體系為20μl。混勻後將管壁上液體稍離心到管底部。各反應管於美國Bio-Rad公司螢光定量PCR儀iQTM5進行擴增。95℃預變性10sec，進入循環94℃變性5sec，60℃退火延伸20sec，共45個循環，擴增完畢後，進行熔解曲線分析，從95℃到60℃共35℃，以0.5℃/sec的速率變化溫度，連續監測螢光。每次試驗中都設不含反轉錄酶的RT產物和無模板對照。為了得到線性的標準曲線，將質粒標準品梯度稀釋後作為模板(1×102～107copies/μl)，在每次PCR擴增時都擴增標準品。表1用於構建標準品的引物序列表2用於擴增大於200bp的QRT-PCR引物表3用於擴增小於150bp的QRT-PCR引物4、統計學分析：自建立的標準曲線得出每個樣品的確切拷貝數。為了消除RNA的提取、逆轉錄和PCR反應的差異，以β-actin為內參，那麼單細胞目的基因mRNA表達水平用targetcopynumber/β-actincopynumber比值作為標準化的表達水平指標。每個樣品重複至少兩次，cDNA模板來源於不同的逆轉錄反應。用One-WayANOVAtest和Kruskal–WallisHtest去分析癌前階段和癌變階段以後mRNA表達的整體顯著差異性。Mann–WhitneyUtest用於分析組內兩種病理階段的顯著性差異。一元線性回歸用於分析不同基因的mRNA表達與病理參數之間的相關性。ROC(receiveroperatingcharacteristiccurves)用於醫學診斷試驗性能的評價。通過改變診斷界點，獲得多對真陽性率(TPR)與假陽性率(FPR)值，以FPR為橫坐標，TPR為縱坐標，繪製ROC曲線，計算與比較ROC曲線下面積，以此反映診斷試驗的價值。即分析各不同的DNA複製起始蛋白作為檢測舌林狀細胞癌的精確性。在ROC曲線下的面積(areasunderthecurves，AUC)代表了診斷準確性的高低，一般來說這一指標取值範圍在0.5至1之間,完全無價值的診斷AUC＝0.5，完全理想的診斷AUC＝1。一般認為AUC為0.5-0.7時，表示診斷價值較低；為0.7-0.9時，表示診斷準確性為中等；為0.9以上時表示診斷價值較高。p＜0.05認為差異具有顯著性。以上的統計分析通過SPSS13.0軟體進行。5、結果：目的基因的表達都是相對於看家基因β-actin的相對標準化的數值。這5個基因的線性相關性非常高達到R2>0.994。各目的基因的相對表達值和不同的病理參數如表4所示。表4臨床病理參數及mRNA相對表達值(n＝100)上表通過螢光定量PCR分析了在不同的樣本中CDC6、CDT1、MCM2、CDC45的相對表達數值，所有數值均為相對於同一樣品的β-actin的比值。6、CDC6螢光定量PCR結果分析：螢光定量PCR結果顯示CDC6mRNA的表達水平在正常與患病組中有整體上的顯著性差異(P＝0.000；Kruskal–Wallistest)。在正常與癌前損傷、鱗狀細胞癌和術後的CDC6的表達兩兩比較發現，正常組除了與癌前損傷和口腔癌之間有顯著型差異外(P＝0.000,0.000；Mann–Whitneytest)，還與術後有顯著性差異(p＝0.000)，表明CDC6在術後一段時間仍有較高表達。結果如圖1A和表5所示。另外CDC6的平均表達水平在炎症與癌前損傷之間無顯著性差異(P＝0.054)，而炎症與口腔癌之間的差異性顯著(P＝0.007)。值得注意的是CDC6的表達在癌前損傷和口腔癌的表達示有顯著性差異(p＝0.028)，也就是說通過CDC6可以有效地將癌前損傷與口腔癌區分開來。然而在炎症和術後(p＝0.078)，癌前損傷和術後(p＝0.303)，口腔癌和術後組(p＝0.428)的比較發現CDC6mRNA的表達並沒有顯著性差異(p＝0.311)，以上的結果表明CDC6mRNA表達水平隨著舌鱗癌的發展進程是上調的。7、CDT1螢光定量結果分析：CDT1mRNA的表達水平在正常與患病組中的mRNA表達水平沒有顯著性差異的(P＝0.077；Kruskal–Wallistest)(圖1B，表5)。另外,在正常組分別與炎症、癌前損傷、術後進行差異顯著性比較，CDT1在這三組之間表達沒有顯著性差異(p＝0.918,0.442,0.270，Mann–Whitneytest)。CDT1正常對照與口腔癌組之間比較差異顯著(p＝0.001)。另外炎症與口腔癌，術後與口腔癌之間也有顯著性差異(p＝0.008，0.007)。其餘各組兩兩比較都沒有顯著性差異。從以上結果我們發現CDT1作為檢測脫落細胞的腫瘤標誌物僅能將相對低表達的正常組、炎症組、術後組與相對高表達的口腔癌組區分開，而對於其他組之間則不能有效的區別開來。8、MCM2螢光定量結果分析：比較MCM2在臨床病理不同分類的表達情況發現(圖1C，表5)，正常對照組與口腔患病組及術後組在整體上有顯著性差異(P＝0.000；Kruskal–Wallistest)。分別將正常組與炎症、癌前損傷、口腔癌和術後組進行差異顯著性比較，發現正常組與炎症和術後組之間沒有顯著性差異(p＝0.108，0.681>0.05；Mann–Whitneytest)，而在正常組與癌前損傷組及口腔癌組之間有顯著性差異(p＝0.002，0.000)MCM2的表達水平隨著口腔病變程度的升高而升高。炎症與癌前損傷、口腔癌組、術後之間也有顯著性差異(p＝0.007，0.000，0.029)，MCM2可以將炎症與癌前損傷，癌，與術後區別開來，炎症組的表達高於正常組和術後，說明在炎症階段細胞增殖速度加快，而術後，由於切除了癌變部位，口腔黏膜上皮的增生得到控制，故術後MCM2的表達顯著下調到正常水平，使得術後與口腔癌組之間產生顯著性差異(p＝0.000)，正常組與術後組之間沒有顯著性差異。然而當我們將癌前損傷組分別與口腔癌組、術後組比較時，可觀察到顯著性差異(分別為p＝0.018和p＝0.002)。表明MCM2可以有效地將癌前損傷和口腔癌階段區別開，並在術後MCM2顯著下調。以上數據揭示了MCM2mRNA的相對表達水平可作為將癌前病變至口腔癌階段惡性程度的判斷標準，另外對於預後的判別有一定的臨床參考價值。9、CDC45螢光定量結果分析：CDC45的表達水平在正常對照組與口腔患病組及術後組在整體上有顯著性差異(P＝0.000，Kruskal–Wallistest)，結果如圖1D，表5所示。正常組分別與炎症、癌前損傷和口腔癌組相比都有顯著性差異(分別為p＝0.003,0.001和0.000；Mann–Whitneytest)。這個結果顯示用CDC45可以把正常組與口腔炎症，癌前損傷以及口腔鱗癌區別開來。炎症組分別與癌前損傷組和口腔癌組比較結果顯示，在這三個階段，CDC45的表達呈逐漸上調的趨勢，但是兩兩之間不構成顯著性差異(p＝0.198，0.085)。術後組與正常組、癌前損傷組與癌變組分析結果顯示，CDC45術後mRNA的表達與正常的表達無顯著性差異(p＝0.34)，而與癌前損傷(p＝0.004)，口腔癌(p＝0.000)有顯著性差異。提示CDC45與術後口腔上皮細胞的增殖狀態有關。但是CDC45並不能把癌前損傷和口腔癌區別開來(p＝0.304)。表5為DNA複製起始蛋白的在各組的差異顯著性比較(p<0.05)CharacteristicCDC6CDT1MCM2CDC45Kruskal–Wallis0.0000.0770.0000.000Normal-inflammation0.1260.9180.1080.003Normal-lesion0.0000.4420.0020.001Normal-OSCC0.0000.0010.0000.000Normal-surgery0.0000.2700.6810.340Inflammation-lesion0.0070.2900.0070.198Inflammation-OSCC0.0000.0080.0000.085Inflammation-surgery0.0290.2700.0290.117Lesion-OSCC0.0780.0840.0180.304Lesion-surgery0.3030.4350.0020.004OSCC-surgery0.4280.0070.0000.000對各組基因相對表達進行均值分析，結果如圖2所示：CDC6、CDT1、MCM2、CDC45在正常，炎症、癌前損傷、癌變、階段表達均呈上升趨勢，在術後，除CDC6稍高與癌前損傷，其它3個基因均降低到趨於正常水平。表6描述了目的基因表達與臨床病理參數之間的聯繫。相關性分析表明CDC6(r＝0.305,P＝0.000)有顯著性相關性，而CDT1(r＝0.101,P＝0.200),MCM2(r＝0.082，P＝0.307)和CDC45(r＝0.067，P＝0.413)均沒有相關性。一元線性回歸分析在兩兩之間表達的相關性，結果顯示在CDC6和MCM2之間(r＝0.206,P＝0.035)，CDT1和CDC45(r＝0.596,P＝0.000)之間有顯著相關性，結果如圖2A，2B所示。但是在其它的兩兩比較之間沒有相關性。表6病理參數與CDC6、CDT1、MCM2和CDC45之間的相關性本研究採用QRT-PCR方法檢測了口腔病變患者脫落細胞中DNA複製起始蛋白mRNA的含量，同時與正常對照進行比較，發現口腔鱗癌患者脫落細胞DNA複製起始蛋白含量顯著高於正常對照組，在統計學上有極顯著性差異。提示該方法可以有效地將正常口腔脫落細胞及癌變脫落細胞有效的區分開來。癌前病變是指口腔黏膜白斑、紅斑、扁平苔癬；乳頭狀瘤和黏膜下纖維性病變等。口腔黏膜白斑是WHO認定的口腔癌前病變，其癌變率為7％～15％，非均質型白斑可達15％～40％。這些病變並非都會癌變，但臨床上許多癌前病變表現無明顯症狀，要經歷長時間，變為惡性癌細胞，因此問題是如何確定這些病損的轉歸，那麼就需定期檢查，一經發現惡變可立即採取治療，這樣可增加口腔癌治癒的可能性。許多學者開始致力於口腔白斑癌變標誌物的研究，可以有效地將癌前與癌變階段區別開，這對於口腔癌的早期治癒至關重要。這也是本研究的主要目的。經統計學結果發現，MCM2和CDC6在區分癌前病變階段的表達均顯著低於癌變階段脫落細胞中相應基因的表達，這對於區別癌前病變和癌變有著積極的作用。我們的先前的發現表明CDC6也是一個敏感的檢測異常增生和惡變細胞的標誌物。它隨著細胞周期的進行在核與細胞質之間穿梭。但是相對於MCM來說，CDC6是一個相對低豐度，不穩定的蛋白，CDC6並不適用於癌症的大量篩查。而CDT1和CDC45雖然在癌前病變階段的表達低於癌變階段，但是在統計學上不構成顯著性差異，所以不建議作為區別這兩個階段的標誌物。另外，如何準確預測口腔鱗癌患者治療的預後，研究與預後相關的臨床指標，有助於臨床醫師對患者的治療提供一定的臨床參考價值。目前臨床上對於口腔鱗癌原發病灶、復發病灶以及轉移病灶的診斷主要依靠臨床醫師的臨床經驗，同時結合臨床輔助檢查，最終需要通過病理活檢方法實現。而這些檢查通常是要等到腫瘤長到一定程度，臨床上表現出來時才能夠發現對於那些部位隱蔽，或者手術治療後採用組織瓣修復局部缺損的病變，往往不能夠早期發現局部復發。我們的檢測結果提示口腔鱗癌，癌前損傷，和術後不同階段脫落細胞DNA複製起始蛋白含量，只有CDC6在術後一段時間仍有較高表達，推測CDC6的高表達不能作為預後的標誌基因。其原因尚待進一步的研究。另外，CDT1、MCM2和CDC45在術後均低表達，與癌變階段有顯著性的差異，與正常對照組之間無差異顯著性。以上結果說明這三個DNA複製起始蛋白檢測對於判斷口腔鱗癌患者的預後，尤其是對於判斷口腔鱗癌患者治療後腫瘤復發的風險具有一定的輔助參考價值。其確切結論尚有待於將來進一步的跟蹤隨訪。綜上所述，通過QRT-PCR技術檢測脫落細胞中DNA複製起始蛋白mRNA變化，可以監測口腔鱗癌的早期病變，並為預後提供有用的信息。另外脫落細胞學技術在口腔癌作為一種簡便快速、非侵入性和相對無痛苦的檢查方法，容易為患者所接受，適用於口腔病變的人群普查、腫瘤診斷和療效監測等方面。隨著各種新技術的發展以及臨床醫學與實驗醫學的緊密結合，必然會有更多的新技術應用於其中，將會有力地促進口腔癌的診斷與治療。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp