檢測和評價力量訓練效果的miRNA標誌物或其組合及其應用的製作方法

2023-12-09 04:47:16 2

本發明屬於生物
技術領域：
，涉及檢測和評價力量訓練效果的miRNA標誌物或其組合及其應用。
背景技術：
：在預防疾病(如2型糖尿病、心血管疾病、肌萎縮等)方面，提高生活質量方面，以及提升運動能力方面，骨骼肌的質量和功能起到關鍵作用(1-4)。力量練習是提高和維持骨骼肌的質量和功能一個最有效的運動方式。近30年，力量訓練普及率迅速提高，在日常的運動實踐中，可以根據不同的目的(提升骨骼肌耐力、提高骨骼肌肥大程度、增強肌肉最大力量)，選擇不同的運動學參數(力量訓練方式、訓練強度和量、選擇練習手段和順序、組間休息時間、速度和次數)，設計不同的力量訓練計劃，以極大促進大眾的健康。如何評定力量訓練效果，是力量訓練研究中的一個重點問題。力量訓練的標誌物應對於訓練負荷敏感，不受其它因素影響(如飲食、生物節律)。但是，直至今日仍沒有可行的標誌物符合這一標準。通過測量急性力量訓練後循環血液中激素(睪酮、皮質醇、胰島素生長因子1)和肌肉損傷標誌物(肌酸激酶、白介素-6、白介素-10和C反應蛋白)的變化來進行力量訓練評定，是傳統使用的手段。然而，長期力量訓練後，儘管力量增加、骨骼肌肥大，但是靜息狀態下這些激素無顯著變化。另外，激素檢測方面存在下列問題：首先，影響血液中激素濃度水平因素眾多，包括樣本的保存、批內和批間變異等。其次，用來檢測激素的一些技術的重複性較差(5)。此外，一些研究認為力量訓練可引起骨骼肌細胞損傷，研究推測這些損傷標誌物可能在運動性骨骼肌肥大過程中起著重要的作用，但是在肥大形成時，通常缺少肌肉的損傷(6)。因此，尋找一種新型運動生理分子標誌物，用以評定力量訓練的效果，有著重要理論和實際意義。在這方面血液中的循環microRNA(miRNA)可能更具有優勢。miRNA是一類由動物、植物和病毒基因組所編碼的長約22個核苷酸並參與基因轉錄後水平調控的非編碼單鏈小核糖核酸分子。miRNA能夠與靶mRNA的3』非翻譯序列完全或部分互補結合，使mRNA降解或抑制mRNA表達，從而導致特定基因的沉默(7)。miRNA在維持骨骼肌的結構和功能方面具有非常重要的作用，參與了病理或生理狀態下肌肉生成、肌肉質量的增加和肌肉營養代謝等過程。運動時，來源於不同組織miRNA可被細胞內的微小囊泡(exosome)包裹，釋放入血，進入到循環系統中的miRNA可能被下遊靶細胞接收並調控下遊靶細胞的功能，因此檢測血漿中循環miRNA可揭示運動狀態下各種生理過程的變化(8)。通過對這些miRNA進行研究，有可能發現一組與力量訓練相關的循環miRNA，進而作為標誌物用於檢測不同力量訓練方案的效果。技術實現要素：本發明的目的是通過研究不同目的力量訓練方案後血漿miRNA的動態且特異性的變化，篩選出在肌肉耐力訓練、肌肉肥大訓練、肌肉最大力量訓練後表達差異顯著的血漿miRNA，通過檢測這些miRNA，為預測力量訓練方案的效果提供新的信息和指標。血漿miRNA生物標誌物的檢測將提供分子水平的遺傳信息，有助於揭示力量訓練後的運動適應過程，對預測不同目的力量訓練的效果提供新的指標。目前，本發明已發現不同目的力量訓練(肌肉耐力訓練、肌肉肥大訓練、肌肉最大力量訓練)後血漿miRNA存在動態的、特異性的變化，並且發現特異性的miRNA組合與力量訓練後的運動適應過程密切相關，可作為預測不同目的力量訓練效果的生物分子標誌物。本發明的上述目的是採用以下技術方案來實現的：一種與力量訓練(肌肉耐力訓練、肌肉肥大訓練、肌肉最大力量訓練)相關的miRNA標誌物或其組合，包括下列miRNA中的任意一種或多種：miR-208b、miR-532、miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-21、miR-181a和miR-221。miRNA對應的核苷酸序列序列編號miR-208bAUAAGACGAACAAAAGGUUUGUSEQIDNO.1miR-532-5pCAUGCCUUGAGUGUAGGACCGUSEQIDNO.2miR-133aUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUGSEQIDNO.3miR-133bUUUGGUCCCCUUCAACCAGCUASEQIDNO.4miR-206UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGSEQIDNO.5miR-181aAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUSEQIDNO.6miR-21CAACACCAGUCGAUGGGCUGUSEQIDNO.7miR-221AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUCSEQIDNO.8一種與肌肉耐力訓練相關的血漿miRNA組合，由miR-208b和miR-532組成。相比於訓練前安靜狀態，肌肉耐力訓練後miR-532的水平持續升高，在訓練後24小時達到最高水平；miR-208b在肌肉耐力訓練後即刻顯著降低，訓練後1小時表達水平略微升高，在訓練後24小時再次降低。一種與肌肉肥大訓練相關的血漿miRNA組合，由miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-21、miR-181a和miR-221組成。miR-133a在肌肉肥大訓練後即刻降低，訓練後1小時恢復至正常水平；相比於肌肉肥大訓練後即刻，miR-133b在訓練後24小時顯著升高；相比於運動後即刻，miR-206在肌肉肥大訓練後1小時顯著升高，訓練後24小時恢復至正常水平；miR-21在肌肉肥大訓練後即刻降低，訓練後1小時回升且高於正常水平，訓練後24小時恢復至正常水平；miR-181a在肌肉肥大訓練後1小時達到最高水平；miR-221在肌肉肥大訓練後即刻升高，訓練後1小時降低至低於正常水平，訓練後24小時表達量回升且高於正常水平。一種與肌肉最大力量訓練相關的血漿miRNA組合，由miR-133a和miR-133b組成。miR-133a在肌肉最大力量訓練後即刻降低，訓練後1小時恢復至正常水平；相比於訓練後即刻，miR-133b在肌肉最大力量訓練後1小時顯著升高，訓練後24小時恢復至正常水平。上述miRNA組合的篩選方法包括以下步驟：(1)構建三種不同目的力量訓練(肌肉耐力訓練、肌肉肥大訓練、肌肉最大力量訓練)方案，將受試者隨機分配為三組，各組對應執行一組力量訓練方案。(2)收集血漿樣本，包括所有志願者運動前安靜狀態、運動後即刻、運動後1小時、運動後24小時4個時間點的血漿樣本，並提取總RNA；(3)採用高靈敏度、高特異性、高重複性和寬動態範圍的人類微小RNA晶片(TaqManLowDensityArray)，對上述RNA進行檢測，初步篩選出三組力量訓練運動前後發生特異性變化的miRNA；(4)進一步使用實時螢光定量PCR方法驗證。具體來說，上述篩選方法包括以下步驟：(1)採用經典訓練方式，構建三種不同目的力量訓練方案(肌肉耐力訓練、肌肉肥大訓練、肌肉最大力量訓練)，將受試者隨機分配為三組，各組對應執行一組力量訓練方案；(2)分別收集力量訓練前安靜狀態、力量訓練後即刻、力量訓練後1小時、力量訓練後24小時受試者的血漿，並提取總RNA，其中所述力量訓練包括肌肉耐力訓練，肌肉肥大訓練和肌肉最大力量訓練；(3)根據人的已知的754個miRNA，對上述RNA進行高通量檢測，初篩出力量訓練前後血漿中表達差異明顯的一組miRNA；(4)從個體血漿中提取RNA，逆轉錄成cDNA，採用螢光定量PCR(TaqMan探針法)方法進一步對初篩出的miRNA進行復篩，挑選出穩定、特異性變化的miRNA，作為力量訓練效果的生物標誌物，特異性檢測和評價肌肉耐力訓練、肌肉肥大訓練和肌肉最大力量訓練三種力量訓練的效果。檢測本發明所述的血漿miRNA標誌物或其組合的試劑在檢測力量訓練的效果和/或為力量訓練方案的設計提供評判標準中的應用；所述的力量訓練選自肌肉耐力訓練、肌肉肥大訓練、肌肉最大力量訓練中的一種或多種。檢測所述的血漿miRNA組合的試劑在檢測肌肉耐力訓練的效果和/或為肌肉耐力訓練方案的設計提供評判標準中的應用。所述的血漿miRNA組合由miR-208b和miR-532組成。檢測本發明所述的血漿miRNA組合的試劑在檢測肌肉肥大訓練的效果和/或為肌肉肥大訓練方案的設計提供評判標準中的應用。所述的血漿miRNA組合由miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-21、miR-181a和miR-221組成。檢測本發明所述的血漿miRNA組合的試劑在檢測肌肉最大力量訓練的效果和/或為肌肉最大力量訓練方案的設計提供評判標準中的應用。所述的血漿miRNA組合由miR-133a和miR-133b組成。本發明使用的檢測方法可以選自：RT-PCR方法、人類微小RNA技術(TaqManLowDensityArray)、Real-timePCR方法以及生物晶片方法中的一種或幾種。例如，血漿中miRNA分子的檢測方法包括以下步驟：(1)使用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取血漿總RNA；(2)通過RNA逆轉錄反應得到cDNA；(3)根據人全部成熟體miRNA設計引物進行PCR反應；(4)進行PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳；(5)EB染色後在紫外燈下觀察結果。在所述步驟(5)之後還可以包括下列步驟：用TaqMan探針法檢測並比較力量訓練前後血漿樣本中miRNA的量的變化。本發明所述的miRNA組合和單個miRNA及其對應的探針組合可應用於不同目的力量訓練方案效果的檢測中，例如為力量訓練後的機體運動適應過程的監測補充新的指標，以及用於力量訓練方案的效果評價之中。本發明所提供的上述miRNA組合具有以下幾個方面的有益效果：第一，已有血漿miRNA的檢測結果表明，miRNA分子廣泛存在於正常人的血漿中，並且隨著訓練狀況變化，miRNA分子在血漿中存在的種類和數量將發生顯著變化，血漿miRNA作為體能標誌物具有靈敏度高、特異性好的特點，顯著優於傳統生物標誌物如激素和肌肉損傷標誌物等；第二，血漿miRNA是一種新型生物標誌物，區別於傳統生物標誌物，不僅穩定、微創、易於檢測，而且定量精確，該類小分子RNA生物標誌物的成功開發是對以激素和肌肉損傷標誌物為主的傳統生物標誌物的改進，將為運動訓練評定與監控開創全新局面；第三，血漿miRNA監測系統是一種實時、全面的診斷方法，可全面的反映訓練生理狀態，避免既往繁雜檢測，節約了成本和時間，為快速準確的掌握訓練狀態、及時採取個性化的訓練方案提供支持；第四，血漿miRNA指紋圖譜的篩選採用嚴密、多階段的驗證和評價體系，初期採用TaqManlow-densityarray晶片技術對血漿miRNA進行高通量測量以獲取力量訓練相關的miRNA表達譜，其後應用實時螢光定量RT-PCR的方法對初篩的miRNA表達譜進行大樣本獨立驗證，之後再使用統計學分析軟體及數據分析程序對血漿miRNA標誌物進行效果評價及準確率評估，以上程序和策略的應用保證了血漿miRNA生物標誌物在運動效果評價和運動方式評判上應用的準確性。綜上所述，檢測血漿中的miRNA，簡單易行且效果優越，從血漿miRNA的特異性變化這一新角度出發，能發現力量訓練運動適應的新機制並且區分不同目的力量訓練方案的效果。該技術僅僅需要人的血漿而不需要任何其它組織，通過簡單的miRNA組合及單個miRNA來預測力量訓練方案的合理性及其可達到的效果。此外力量訓練過程中迅速發生變化的循環miRNA可能具有獨特性，其動態變化規律不同於常規生物標誌物，能夠彌補常規生物標誌物應用上的缺陷，實時反映出骨骼肌適應過程，可作為評定和監控力量訓練的一種新型的分子標誌物，具有極重要的應用潛力和價值。附圖說明圖1本發明的主要流程圖。圖2TaqMan探針Real-timePCR法測定miRNA(miR-208b和miR-532)在肌肉耐力訓練中的動態性變化。(A)相比於訓練前安靜狀態，訓練後miR-532的水平持續升高，在訓練後24小時達到最高水平；(B)miR-208b在訓練後即刻顯著降低，訓練後1小時表達水平略微升高，在訓練後24小時再次降低。圖3TaqMan探針Real-timePCR法測定miRNA(miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-181a、miR-21和miR-221)在肌肉肥大訓練中的動態性變化。(A)miR-133a在訓練後即刻降低，訓練後1小時恢復至正常水平；(B)相比於訓練後即刻，miR-133b在訓練後24小時顯著升高；(C)相比於運動後即刻，miR-206在訓練後1小時顯著升高，訓練後24小時恢復至正常水平；(D)miR-21在訓練後即刻降低，訓練後1小時回升且高於正常水平，訓練後24小時恢復至正常水平；(E)miR-181a在訓練後1小時達到最高水平；(F)miR-221在訓練後即刻升高，訓練後1小時降低至低於正常水平，訓練後24小時表達量回升且高於正常水平。圖4TaqMan探針Real-timePCR法測定miRNA(miR-133a和miR-133b)在肌肉最大力量訓練中的動態性變化。(A)miR-133a在訓練後即刻降低，訓練後1小時恢復至正常水平；(B)相比於訓練後即刻，miR-133b在訓練後1小時顯著升高，訓練後24小時恢復至正常水平。圖5肌肉耐力訓練後血漿中特異性變化的miR-532與IL-10、IGF-1緊密相關。(A)所有受試者訓練前後血漿中IL-10的動態性變化；(B)所有受試者訓練前後血漿中miR-532的動態性變化；(C)所有受試者訓練前後血漿中IGF-1的動態性變化；(D)訓練後miR-532的變化倍數與IL-10的變化倍數呈正相關，其中相關性分析包含訓練後即刻、訓練後1小時、訓練後24小時3個時間點的數據；(E)訓練後miR-532的變化倍數與IGF-1的變化倍數呈負相關，其中相關性分析包含訓練後即刻、訓練後1小時、訓練後24小時3個時間點的數據。圖6肌肉最大力量訓練後血漿中特異性變化的miR-133a與皮質醇、睪酮/皮質醇緊密相關。(A)所有受試者訓練前後血漿中皮質醇的動態性變化；(B)所有受試者訓練前後血漿中miR-133a的動態性變化；(C)所有受試者訓練前後血漿中睪酮/皮質醇的動態性變化；(D)訓練後即刻miR-133a的變化倍數與皮質醇的變化倍數呈負相關；(E)訓練後即刻miR-133a的變化倍數與睪酮/皮質醇的變化倍數呈正相關。具體實施方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。本發明通過研究不同目的力量訓練前後血漿miRNA的動態及特異性變化，篩選出在力量訓練前後表達差異顯著的一組血漿miRNA，將它們的探針應用於不同目的力量訓練效果的檢測，以此針對特定的目的設計出最優的力量訓練方案。實施例1：力量訓練方案的特異miRNA表達譜篩選(1)研究對象為無力量訓練經歷的身體健康的青年男性，所有受試者均無神經肌肉、代謝、激素相關和心血管方面的疾病。整個實驗期間所有受試者均無服用藥物且保持相似的生活飲食習慣。將45名受試者隨機分為3組，每組15人(志願者詳細信息見表1)，各自執行肌肉耐力訓練、肌肉肥大訓練、肌肉最大力量訓練方案中的一種。每組力量訓練皆包含5個動作，即臥推、半蹲、坐姿下拉、過頭舉和站姿啞鈴彎舉，以訓練前安靜狀態為對照。受試者禁止身體鍛鍊3天後執行相應的力量訓練，整個力量訓練持續約2小時且在每天的同一時間段進行。抽取受試者訓練前安靜狀態、訓練後即刻、訓練後1小時和訓練後24小時的血液，抽血針上殘留的血液用EKFdiagnosticGmbH乳酸分析儀進行乳酸分析。血液收集在EDTAK2處理的一次性真空採血管，1500g離心10分鐘，收集上清，再4℃、10000g離心5分鐘，收集上清(血漿)。表1.所有受試者的臨床信息肌肉耐力肌肉肥大肌肉最大力量年齡(歲)19.36±0.1419.72±0.2018.87±0.12BMI指數(千克/米-2)21.30±0.2522.12±0.3121.90±0.30心率(次/分鐘)74.64±0.8972.66±1.4172.10±1.76臥推(千克)50.71±1.2353.10±2.0150.83±1.57半蹲(千克)82.86±2.5179.83±1.5085.83±2.34坐姿下拉(千克)82.86±1.9884.66±1.9584.67±2.17過頭舉(千克)36.96±1.0736.55±1.2231.75±0.68站姿啞鈴彎舉(千克)14.20±0.3915.00±0.4814.82±0.41數據以mean±SE表示。(2)對每一組力量訓練，取運動前安靜狀態，運動後即刻的血漿標本分別混合，3組力量訓練共收集混合血漿6組，總體積均為10毫升。分別提取6組混合血漿中的RNA，具體方案為：利用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總RNA。(3)對6組血漿中總miRNA進行TaqMan低密度晶片分析(Invitrogen)。具體方案為：將TaqManMicroRNAAssays的所有優勢集合併預裝成便利的微流體晶片形式，將384個定量PCR反應在一塊微流量板上進行。每個陣列的內容與各自的MagaplexPrimerPools匹配，用MegaplexRTPrimer反轉錄miRNA靶點及用MegaplexPreAmpPrimers預擴增之後，TaqManUniversalPCRMasterMix可與每個反應簡單混合，並移至TaqManArray的八個上樣口中之一，然後在7900HT定量PCR儀上運行分析，產生SangermiRBase的綜合數據集。(4)miRNA表達譜分析。TaqMan低密度晶片分析後得到了754個miRNA循環數(Ct值)，Ct值反應各個miRNA的表達量，Ct值越大，其相對的miRNA的含量越低,反之亦然。以Let-7d、Let-7g和Let-7i的Ct值的平均值[let-7d/g/i＝1/3(Let-7d(Ct)+Let-7g(Ct)+Let-7i(Ct))]為內參，矯正所得miRNA的Ct值。採用2^(-△△Ct)公式計算miRNA的變化倍數，其中△Ct＝Ct(miRNA)–Ct(let-7d/g/i),△△Ct＝△Ct(運動後)-△Ct(運動前)。若miRNA的Ct值小於35，且在運動前後的變化大於2.0倍，被認為變化明顯，否則視為不變化。結果發現，在所檢測的754個miRNA中，肌肉耐力訓練組1個miRNA升高、93個miRNA降低；肌肉肥大訓練組75個miRNA升高、7個miRNA降低；肌肉最大力量訓練組16個miRNA升高、60個miRNA降低。表2-4列出了根據晶片結果篩選出的變化倍數大於10的miRNA。表2.低密度晶片初篩的在肌肉耐力訓練前後變化倍數大於10的miRNA數據以mean±SE表示。Pre代表訓練前安靜狀態，0h代表訓練後即刻狀態。表3低密度晶片初篩的在肌肉肥大訓練前後變化倍數大於10的miRNA數據以mean±SE表示。Pre代表訓練前安靜狀態，0h代表訓練後即刻狀態。表4低密度晶片初篩的在肌肉最大力量訓練前後變化倍數大於10的miRNA數據以mean±SE表示。Pre代表訓練前安靜狀態，0h代表訓練後即刻狀態。實施例2：TaqMan探針Real-timePCR法測定血漿中miRNA並確定特異性變化的miRNA作為評測力量訓練效果的生物標誌物利用miRNA特異性反向引物進行逆轉錄，得到含共同莖環結構但屬於特定miRNA的cDNA(ABI公司產品)。miRNA的cDNA逆轉反應體系為：2μlRNA、2μl5×AMV緩衝液、1μl10mmol各種dNTP混合物(Takara公司)、0.5μlAMV(Takara公司)以及1μlmiRNA成熟體逆轉錄引物(美國ABI公司提供，專用於miRNA逆轉錄)，用3.5μlDEPC水補足體積至10μl。其後進行Real-timePCR反應，結果發現，2種miRNA(miR-208b和miR-532)在肌肉耐力訓練前後有顯著差異(圖2)，6種miRNA(miR-133a、miR-133b、miR-206、miR-21、miR-181a和miR-221)在肌肉肥大訓練前後有顯著差異(圖3)，2種miRNA(miR-133a和miR-133b)在肌肉最大力量訓練前後有顯著差異(圖4)。綜合來看，miR-133a和miR-133b在肌肉肥大訓練和肌肉最大力量訓練組中的動態性變化有顯著差異(見表5-7)。表5.肌肉耐力訓練訓練後所選的16種血漿miRNA的相對濃度表6.肌肉肥大訓練訓練後所選的16種血漿miRNA的相對濃度表7肌肉最大力量訓練後所選的16種血漿miRNA的相對濃度數據以mean±SE表示。Pre代表訓練前安靜狀態，0h代表訓練後即刻狀態，1h代表訓練後一個小時，24h代表訓練後24小時，ND表示miRNA值低於檢測水平。*表示和運動前安靜狀態的值相比，p<0.05，表示和訓練後即刻的值相比，p<0.05，表示和訓練後一個小時的值相比，p<0.05。在檢測3種力量訓練的效果和/或為3種力量訓練方案的設計提供評判標準時，必須要用這種力量訓練對應的miRNA組合中的全部miRNA。比如在檢測肌肉最大力量訓練的效果和/或為肌肉最大力量訓練方案的設計提供判斷標準時，需檢測miR-133a和miR-133b。通過檢測miR-133a在訓練後即刻是否顯著降低及降低的幅度，miR-133b在訓練後1小時相對訓練後即刻是否顯著升高及升高的幅度來判斷肌肉最大力量訓練的效果和/或為肌肉最大力量訓練方案的設計提供判斷標準。實施例3：統計學分析肌肉耐力訓練後血漿中特異性變化的miRNA與傳統標誌物激素和肌肉損傷標誌物的關係為了進一步驗證上述三種力量訓練後特異性變化的miRNA作為評價力量訓練效果生物標誌物的可行性，將miRNA與8種傳統的力量訓練生物標誌物做相關性分析。相關性分析發現肌肉耐力訓練後即刻、訓練後1小時和24小時的miR-532水平和IL-10、IGF-1具有顯著的相關性(圖5)。肌肉最大力量訓練後即刻，miR-133a的水平和皮質醇、睪酮/皮質醇的值具有顯著的相關性(圖6)。參考文獻1.ScottBR,DuthieGM,ThorntonHR,DascombeBJ.TrainingMonitoringforResistanceExercise:TheoryandApplications.SportsMed2016.2.A,WeigertC,StaigerH,HU.Exerciseanddiabetes:relevanceandcausesforresponsevariability.Endocrine2016；51:390-401.3.IshiguroH,KodamaS,HorikawaC,FujiharaK,HiroseAS,HirasawaR,etal.InSearchoftheIdealResistanceTrainingProgramtoImproveGlycemicControlanditsIndicationforPatientswithType2DiabetesMellitus:ASystematicReviewandMeta-Analysis.SportsMed2016；46:67-77.4.SicilianoG,SimonciniC,GiannottiS,ZampaV,AngeliniC,RicciG.Muscleexerciseinlimbgirdlemusculardystrophies:pitfallandadvantages.ActaMyol2015；34:3-8.5.KraemerWJ,RatamessNA.HormonalResponsesandAdaptationstoResistanceExerciseandTraining.SportsMed2005；35:339-61.6.SchoenfeldBJ.Doesexercise-inducedmuscledamageplayaroleinskeletalmusclehypertrophyJStrengthCondRes2012；6:1441-53.7.StarkA,BushatiN,JanCH,KheradpourP,HodgesE,BrenneckeJ,etal.AsingleHoxlocusinDrosophilap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