非小細胞肺癌中miR-143基因的應用的製作方法

2023-12-10 03:45:51

非小細胞肺癌中miR-143基因的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種非小細胞肺癌中miR-143基因的應用。在H1299細胞系中miR-143阻滯細胞G1期到S期的轉換，抑制細胞的增殖。MiR-143通過與靶基因mRNA的3′-UTR的相互作用，抑制靶基因mRNA的翻譯或者降解靶基因的mRNA，下調靶基因的表達。本發明通過軟體預測與載體構建，在HEK293T細胞中使用雙螢光素酶報告系統，初步證實了ATG2B，是miR-143的靶基因。靶基因ATG2B是一個與癌症發生相關的基因，在非小細胞肺癌細胞株中顯著上調。在H1299細胞株中過表達miR-143，ATG2B的mRNA表達顯著下調。首次證實了在非小細胞肺癌細胞中ATG2B是miR-143的靶基因。該發明為利用miRNA在臨床診斷與治療非小細胞肺癌，及提供藥物靶點方面提供了一定的應用價值。
【專利說明】非小細胞肺癌中miR-143基因的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種非小細胞肺癌中miR-143基因的應用。
【背景技術】
[0002]miRNA是天然存在於體內的21_22nt的非編碼RNA分子，是一類通過轉錄後基因沉默對靶基因表達進行調節的RNA。據估計，生物體內約有1/3的基因受miRNA的調控。MiRNA與RISC的複合體通過鹼基配對可與靶基因mRNA 5' -UTR或者3' - UTR中的互補序列相結合，抑制蛋白質翻譯，或是引發mRNA降解，從而負調控靶基因的表達。
[0003]肺癌是死亡率最高的癌症，每年死於肺癌的人數超過100萬，並且每年新增病例120萬。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常見的癌症,其中約80%的肺癌是非小細胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC),其5年存活率僅為15%,缺乏有效的針對肺癌的早期診斷和治療手段是低5年存活率的主要原因。在癌症的發生中，經常出現miRNA群失調的現象。幾種癌症包括胃癌，乳腺癌，肺癌，結腸癌等已經報導多種表達異常的miRNA種類。檢測miRNA的表達水平可以為癌症的臨床診斷提供參考。而miRNA的異常表達直接導致一些與癌症發生相關基因的表達異常，誘發癌症的發生。已有報導證明miRNA可以通過調控靶基因mRNA的表達，在肺癌發生、發展及轉移中發揮重要作用。在未來臨床治療中，miRNA不僅可以成為新的肺癌早期診斷和癌症進程相關的標記物，而且也有望通過改變miRNA的表達或者其靶基因的表達治療肺癌等疾病。尋找和鑑定與肺癌發生相關的miRNA及其靶基因為miRNA的臨床治療提供基 礎。

【發明內容】

[0004]本發明的目的之一在於提供一種miR-143基因在製備抑制非小細胞肺癌細胞增殖藥物中的應用。
[0005]本發明的目的之二在於提供一種miR-143基因在製備阻滯非小細胞肺癌細胞細胞周期轉換中藥物的應用。
[0006]本發明的目的之三在於提供一種miR-143基因在製備下調JTi1 現表達水平藥物中的應用。
[0007]本發明據Solexa測序結果，在小鼠肺癌模型中miR-143顯著下調，及利用qRT-PCR技術檢測多種非小細胞肺癌系中miR-143的表達量變化，並從中選擇一種miR-143表達顯著下調的非小細胞肺癌系，在此細胞系中過表達miR-143以檢測其功能。
[0008]一採用生工生物公司的Trizol試劑提取的細胞總RNA，進行反轉錄，檢測miR-143在非小細胞肺癌細胞株中的表達。研究發現與正常的肺上皮細胞相比，miR-143在非小細胞肺癌中顯著降低。
[0009]二利用CCK8試劑盒檢測過表達miR-143後H1299細胞的增殖，結果在用miR-143的mimics轉染細胞後，與對照組相比，H1299細胞增殖減緩。
[0010]三過表達miR-143後的H1299細胞用PI染色後，用流式細胞儀進行細胞周期分析。發現與對照相比，miR-143過表達的H1299細胞明顯被阻滯在G1/G0期。
[0011]四將從Targetscan軟體預測miR-143的靶基因JTi?現的3 ^ -UTR連接至pGL_3載體，然後將miR-143 mimics與重組質粒共轉入HEK-293T細胞，48 h後進行雙螢光實驗。結果,轉入miR-143 mimics與重組載體的細胞中的螢火蟲螢光素酶的活性比對照組顯著下降，表明miR-143 mimic通過47；?現的3' -UTR抑制螢火蟲螢光素酶的活性。
[0012]五在H1299細胞中過表達miR-143，檢測JTi?現mRNA水平變化。在H1299細胞中轉入真核表達載體PEGFP-Cl構建的miR-143表達載體pEGFP-miR-143，與轉入pEGFP-Cl空載的H1299細胞相比，JTi』現的mRNA表達水平下調約30%。
[0013]H1299細胞系中miR-143基因影響細胞的增殖，細胞周期，在非小細胞肺癌的發生起重要的作用。是一個細胞自吞噬相關的蛋白，與癌症的發生密切相關。miR-143通過與其靶基因JTG2B的mRNA的3' -UTR互補，抑制靶基因mRNA的翻譯或直接降解靶mRNA。本實驗通過軟體預測、構建載體，然後在HEK293T細胞中利用螢光素酶報告基因分析驗證了是miR-143的靶基因，並在H1299細胞中利用qRT-PCR技術，進一步驗證了該發現。所公開的為在H1299細胞系中是miR-143的靶基因的首次報導，該發明在臨床上為利用miRNA來診斷和治療非小細胞肺癌，以及提供藥物靶點方面提供了一定的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1非小細 胞肺癌細胞系中miR-143的相對表達含量；
圖2過表達miR-143後抑制H1299細胞的增殖；
圖3過表達miR-143後，H1299細胞被阻滯在G1/G0期。
[0015]圖4是miR-143的靶基因，其中A為miR-143在不同物種之間的保守結合位點；B為miR-143與靶基因JTiOW的結合位點；C為miR-143與靶基因JTiOW 3' UTG的雙螢光酶報告實驗分析柱狀圖。
[0016]圖5過表達miR-143後，ATG2B的mRNA水平顯著下調。
【具體實施方式】
[0017]下面將結合具體實例進一步闡述本發明。這些實例僅用於闡述本發明，而不用於限制本發明的範圍。以下實例中未註明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0018]實施例一:根據Solexa測序結果，確定miR-143在非小細胞肺癌細胞系中低表達 本發明所用到的小鼠良性肺腫瘤模型(L822T1)和k-ras基因突變小鼠肺癌模型
(L930T1)由中科院生化細胞所季宏斌教授課題組提供。
[0019]將小鼠良性肺腫瘤和k-ras基因突變小鼠肺癌的肺組織取樣，用TRIZOL法裂解組織，加入氯仿，待蛋白與核酸分層，離心之後吸取上清並加入等體積異丙醇沉澱，再次離心後以70%乙醇洗滌沉澱，晾乾，獲得總RNA。利用TaKaRa公司的反轉錄試劑盒構建兩種組織的cDNA文庫，根據試劑盒的說明進行反轉錄。
[0020]將反轉錄後的樣品利用Solexa方法測序(Solexa測序由華大基因公司完成)，其中miR-143下調24%。進一步研究發現在非小細胞肺癌細胞系中miR-143的表達顯著下調(參見圖1)。
[0021]反轉錄PCR 米用 Takara 公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA SynthesisKU。用來檢測的儀器為Bio-Rad公司的iQ5系統，試劑為TaKaRa公司的SYBR Green Mix。這種試劑裡面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix, SYBR Green dyet)U6用來作為內參基因。本實驗所用到的引物為:miR-143 引物 Forward:5' - TGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3' ,Reverse:為 Un1-miR qPCR primer ;U6 引物為 Forward:5' -CTCGCTTCGGCAGCACA- 3' , Reverse:5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
[0022]實施例二:miR_143對H1299細胞增殖的影響
將RPMI1640培養的H1299細胞均勻地鋪在96孔板中。鋪板24 h後將miR-143的mimics通過lipo2000轉染試劑轉染H1299細胞，轉染6 h後更換新鮮的培養液，並立即加入CCK8試劑，在培養箱裡培養2.5 h，再將溶液轉移至酶標板，檢測450 nm的吸光度值。之後，每隔24 h測量一次。
[0023]檢測發現,轉染miR-143的mimics組與對照組(轉入購自銳博公司的NC, negativecontrol)相比較，其吸光度有顯著的下降，也即轉染了 miR-143的細胞的增殖速度顯著低於對照組，說明miR-143具有抑制H1299細胞增殖的作用(參見圖2)。
[0024]本實驗採用D0J IND0公司的CCK8 (Cell Counting Kit_8)試劑盒。該試劑盒利用了水溶性四銼鹽-WST-8 (2- (2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)-5- (2，4_ 二磺基苯)-2H-四銼單鈉鹽)。
[0025]實施例三:miR-143對H1299細胞周期的影響
將H1299細胞均勻地鋪在6孔板中，24 h後將miR-143的mimics通過lipo2000與無血清培養液RPMI1640共孵育後轉入H1299細胞中，轉染6 h後將細胞培養液換為新鮮培養液。轉染48 h後，將收集到的細胞用70%乙醇固定，-20°C過夜。用核酸染料螢光染料碘化丙啶(PI)將固定好的細胞染色後採用流式細胞技術檢測H1299細胞的細胞周期。結果表明，轉染了 miR-143的H1299細胞G1/G0期的細胞數量顯著比對照組多(參見圖3)。
[0026]實施例四:雙螢光素酶報告基因分析
將現的 3' -UTR 用引物 5' CGG AAT TCTGGCTTGGAACTGACAGTGT3' (forward)與5' AAA CTG CAGCACATTCCTAACAAGCCTGC3' (reverse)擴增後，通過酶切位點 EcoRI 與 PstI連接入pGL-3質粒，在一個螢火蟲螢光素報告基因的3' -UTR區域，該質粒上含有SV40的啟動子，連接上的3' -UTR包含了 miR-143與ATG2B的結合位點。用lipo2000轉染試劑把miR-143的mimics與構建好的質粒共轉入HEK-293T細胞中，並同時轉入表達內參照報告基因海腎螢光素酶基因的PRL質粒，在轉染6 h後將培養液換為新鮮培養液。轉染48 h後，用PiOmega公司的雙螢光素酶報告基因分析試劑盒檢測pGL_3和pRL的螢光表達。轉染pGL_3質粒的終濃度為200nmol/L ；pRL的終濃度為10nmol/L ；mimics的終濃度為50 nmol/L。結果發現，轉染了 miR-143的HEK-293T細胞中螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性的值顯著低於對照組，說明J/^現是miR-143的靶基因(參見圖4)。
[0027]實施例五:qRT_PCR驗證miR-143對H1299細胞內源基因的抑制作用
該實驗通過構建miR-143的表達載體過表達miR-143。在pEGFP-Cl的EGFP基因序列後面接入表達miR-143前體的序列，為了 EGFP基因與miR-143表達的獨立性，在表達miR-143前體的DNA序列前加入一個終止密碼子TAA，實現在同一個啟動子的驅動下獨立表達。用引物 Forward pEGFP-miR-143:5' CCCTCGAGTCTAAGTTGGAGTCCCGCCACA3' ；ReversepEGFP-miR-143:5/ CGGAATTCACGCCTCATGCTAAGATGG3'擴增的片段用限制性內切酶 XhoI與EcoRI連接入pEGFP載體。
[0028] 將H1299細胞均勻地鋪在6孔板中，24 h後將pEGFP、pEGFP-miR-143通過lipo2000與無血清培養液1640共孵育後轉入H1299細胞中，轉染6 h後將細胞培養液換為新鮮培養液。轉染48 h後，收集細胞，提取RNA，利用Takara公司試劑盒反轉錄為cDNA，之後進行qRT-PCR檢測。轉染pEGFP-miR-143的細胞的miR-143的表達比對照高約50倍。用引物 5』 GGCAGTAGCTTTCTTTACTTGTATA3』 (forward)與 5』 GTACCTATAAATCTAAGGTGATCGT3』(reverse)檢測kTG2B的表達，結果表明，miR-143對ATG2B具有抑制作用(參見圖5)。
儘管本發明描述了具體的 例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。
【權利要求】
1.一種miR-143基因在製備抑制非小細胞肺癌細胞增殖藥物中的應用。
2.—種miR-143基因在製備阻滯非小細胞肺癌細胞細胞周期轉換中藥物的應用。
3.一種miR-143基因在製備下調471029表達水平藥物中的應用。
【文檔編號】A61K48/00GK103751801SQ201310407301
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】金由辛, 韋嘉勵, 馬中良, 李豔利, 趙波濤 申請人:上海大學