一種食品中氟喹諾酮類藥物的檢測試劑盒的製作方法

2023-12-10 06:03:12

本發明涉及食品檢測技術領域，具體是一種食品中氟喹諾酮類藥物的檢測試劑盒。

背景技術：

氟喹諾酮是一類抗菌藥，作用機制是：抑制細菌DNA螺旋酶，阻礙DNA複製。氟喹諾酮類對G-桿菌，包括綠膿桿菌均有良好抗菌作用，對G+球菌也具一定抗菌活性，尤其對耐藥G-桿菌，仍可呈現敏感。臨床用於治療尿路、腸道、呼吸道以及皮膚軟組織、腹腔、骨關節等感染。任何藥物都有副作用，氟喹諾酮也不例外，而且由於氟喹諾酮類藥物的廣泛應用，常常有不合理用藥和濫用藥情況發生，氟喹諾酮藥物的不良反應主要發生在人類，動物則反應不大，但動物用藥後的藥物殘留可以通過食物鏈傳播，同樣會引起人類不良反應現象的發生，影響人類健康，為此，對動物體內氟喹諾酮的殘留檢測已越來越引起人們的重視。

目前氟喹諾酮類藥物的檢測方法主要是高效液相色譜法，液質聯用法等紫外儀器方法，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較貴等缺點，不能實現大量樣品的快速檢測。因此建立一種快速簡便的氟喹諾酮類藥物檢測方法具有重要意義。酶聯免疫法是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用於大量樣本的現場快速檢測。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種靈敏度高、操作簡便的食品中氟喹諾酮類藥物的檢測試劑盒。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種食品中氟喹諾酮類藥物的檢測試劑盒，包括：包被有氟喹諾酮類藥物抗原的酶標板、氟喹諾酮類藥物單克隆抗體、甲狀腺過氧化物酶標記羊抗鼠抗抗體、標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液；所述的氟喹諾酮類藥物抗原為氟喹諾酮類藥物半抗原與鑰孔血藍蛋白的偶聯物；所述的氟喹諾酮類藥物半抗原的製備步驟如下：5g氟喹諾酮類藥物和40～45ml二甲基苯二胺的混合液，室溫下緩慢滴加入含2.8～3.2g對二甲氨基苯甲醛的60～70ml二甲基苯二胺溶液中，滴加完畢後，從室溫升溫至56～58℃反應1.0～1.4h，除去溶劑，柱層析純化，得到；所述的甲狀腺過氧化物酶標記羊抗鼠抗抗體是採用戊二醛交聯法將標記酶甲狀腺過氧化物酶與羊抗鼠抗抗體偶聯得到。

作為本發明進一步的方案：所述的標準品溶液的濃度分別為0μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L、6.4μg/L、12.8μg/L、25.6μg/L。

作為本發明進一步的方案：所述的底物顯色液由底物顯色A液和底物顯色B液組合而成；所述的底物顯色A液為含0.4～0.6mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩衝溶液，所述的底物顯色B液為四甲基聯苯胺溶液。

作為本發明進一步的方案：所述的終止液為1.4～1.6mol/L的氫氧化鈉溶液。

作為本發明進一步的方案：所述的濃縮洗滌液為20×濃縮洗滌液，具體是含0.55～0.62%的吐溫-20、0.008～0.01%的大慶黴素防腐劑、濃度為0.16～0.18mol/L的pH值為7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液。

作為本發明進一步的方案：所述的濃縮復溶液為20×濃縮復溶液，具體是濃度為0.22～0.26mol/L的pH值為7.6～7.8的磷酸鹽緩衝液。

利用所述的食品中氟喹諾酮類藥物的檢測試劑盒進行檢測的方法，包括以下步驟：

（1）將待測樣品進行前處理，得到待測樣品溶液；

（2）用所述的檢測試劑盒檢測待測樣品溶液；

（3）分析檢測結果。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明的試劑盒靈敏度高，穩定性強，該試劑盒可用於氟喹諾酮類藥物的快速檢測，適用於魚、蝦等水產品，雞肉、豬肉等畜禽產品；利用該試劑盒進行檢測時，靈敏度均可達0.2μg/L；本發明的試劑盒操作簡單，讀取結果時間短，按試劑盒說明在5～8min內即可判定檢測結果；可批量檢測，一步到位，成本低廉，投資少，見效快。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

實施例1

本發明實施例中，一種食品中氟喹諾酮類藥物的檢測試劑盒，包括：包被有氟喹諾酮類藥物抗原的酶標板、氟喹諾酮類藥物單克隆抗體、甲狀腺過氧化物酶標記羊抗鼠抗抗體、標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液。

氟喹諾酮類藥物抗原為氟喹諾酮類藥物半抗原與鑰孔血藍蛋白的偶聯物；氟喹諾酮類藥物半抗原的製備步驟如下：5g氟喹諾酮類藥物和40～45ml二甲基苯二胺的混合液，室溫下緩慢滴加入含2.8～3.2g對二甲氨基苯甲醛的60～70ml二甲基苯二胺溶液中，滴加完畢後，從室溫升溫至56～58℃反應1.0～1.4h，除去溶劑，柱層析純化，得到。甲狀腺過氧化物酶標記羊抗鼠抗抗體是採用戊二醛交聯法將標記酶甲狀腺過氧化物酶與羊抗鼠抗抗體偶聯得到。標準品溶液的濃度分別為0μg/L、0.1μg/L、0.4μg/L、0.8μg/L、1.6μg/L、3.2μg/L、6.4μg/L、12.8μg/L、25.6μg/L。底物顯色液由底物顯色A液和底物顯色B液組合而成；底物顯色A液為含0.4～0.6mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩衝溶液，底物顯色B液為四甲基聯苯胺溶液。終止液為1.4～1.6mol/L的氫氧化鈉溶液。濃縮洗滌液為20×濃縮洗滌液，具體是含0.55～0.62%的吐溫-20、0.008～0.01%的大慶黴素防腐劑、濃度為0.16～0.18mol/L的pH值為7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液。濃縮復溶液為20×濃縮復溶液，具體是濃度為0.22～0.26mol/L的pH值為7.6～7.8的磷酸鹽緩衝液。

1、氟喹諾酮類藥物半抗原的製備

5g氟喹諾酮類藥物和40～45ml二甲基苯二胺的混合液，室溫下緩慢滴加入含2.8～3.2g對二甲氨基苯甲醛的60～70ml二甲基苯二胺溶液中，滴加完畢後，從室溫升溫至56～58℃反應1.0～1.4h，除去溶劑，柱層析純化，得到氟喹諾酮類藥物半抗原。

2、氟喹諾酮類藥物抗原的合成

取氟喹諾酮類藥物半抗原15mg用1ml二甲基苯二胺溶解，得到溶液A；取鑰孔血藍蛋白39mg用6ml水溶解，得到溶液B；將溶液A滴加入溶液B中，得到溶液C，室溫反應20h；取NaBH412mg，用0.15ml的0.12mol/L的NaOH溶解後，倒入溶液C中，在4℃溫度下反應1h；用0.008mol/l磷酸鹽緩衝液在4℃條件下透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應的小分子物質；分裝，於-20℃保存備用。

3、包被有氟喹諾酮類藥物抗原的酶標板的製備

用包被緩衝液將氟喹諾酮類藥物抗原稀釋成0.25～0.28μg/ml，每孔加入150μL，37℃避光孵育2h或4℃過夜，傾去孔中液體，洗滌液洗滌3次，拍幹，每孔中加入150μL封閉緩衝液，37℃避光孵育2h或4℃過夜，傾去孔中液體拍幹，用鋁膜真空密閉保存。其中包被緩衝液為pH值9.0～9.2的0.05mol/L的碳酸鹽緩衝液，封閉緩衝液為pH值7.4的0.1～0.2%的雞卵清白蛋白的磷酸鹽緩衝液。

4、羊抗鼠抗抗體的製備

以羊為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體。

5、甲狀腺過氧化物酶標記羊抗鼠抗抗體的製備

將標記酶甲狀腺過氧化物酶與羊抗鼠抗抗體採用戊二醛交聯法進行偶聯得到甲狀腺過氧化物酶標記羊抗鼠抗抗體。

6、氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的製備

動物免疫：氟喹諾酮類藥物半抗原與載體蛋白偶聯物免疫8～10周齡Balb/c小鼠。

細胞融合與克隆化：取免疫後的鼠脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞在融合劑聚乙二醇4000的作用下融合，篩選獲得能穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

經篩選得到氟喹諾酮類藥物的單克隆雜交瘤細胞株。氟喹諾酮類藥物的單克隆雜交瘤細胞株可以無限量的產生氟喹諾酮類藥物特異性抗體，該抗體特異性是針對氟喹諾酮類藥物的，靈敏度達到0.1μg/L。

細胞凍存和復甦：將雜交瘤細胞用凍存液製成1×109個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。

利用所述的食品中氟喹諾酮類藥物的檢測試劑盒進行檢測的方法，包括以下步驟：

1、樣本的前處理

取1～3g待測樣品於50ml離心管中，依次加入3～5ml去離子水，0.3～0.6ml的1mol/L鹽酸，0.1～0.3ml衍生化試劑，震蕩混勻3～5min，55～60℃水浴條件下孵育30min；取出後，依次加入3～6ml提取劑，0.3～0.5ml的1mol/L氫氧化鈉，震蕩混勻1～3min；4000r/min離心2～10min，取上層清液待測。

2、檢測

（1）準備：使用之前將所有試劑和需用板條從冷藏環境中取出，置於室溫放置60min，注意每種液體試劑使用前均須搖勻，取出所需的微孔條，將不用的微孔板放入自封袋，保存於2～8℃。

（2）編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，並記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

（3）加標準品/樣本：加標準品/樣本50μl到對應的微孔中。

（4）抗體工作液和酶標記抗抗體濃縮液的混合（需要使用前才混合，混合均勻後立即使用）：將抗體工作液和酶標記抗抗體濃縮液按10：1體積比混合併混勻。

（5）加抗體工作液和酶標記抗抗體濃縮液的混合液：加抗體工作液和酶標記抗抗體濃縮液的混合液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置25℃避光環境中反應30min。

（6）洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩幹，用洗滌工作液（用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋）250μl/孔，充分洗滌3次，每次間隔10s，用吸水紙拍幹。

（7）顯色：加入底物顯色A液50μl/孔，底物顯色B液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置25℃避光環境中反應15min。

（8）測定：加入終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀於450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據），測定每孔OD值。

3、檢測結果分析

標準品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的吸光度值的平均值除以第一個標準的吸光度值，再乘以100%，即得到百分吸光率。以標準品百分吸光率為縱坐標，以氟喹諾酮類藥物標準品濃度的對數為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中氟喹諾酮類藥物實際濃度。

上述檢測試劑盒的靈敏度、特異性、精密度和準確度實驗

1、試劑盒靈敏度測定

按照常規方法測定試劑盒靈敏度試驗，試劑盒標準曲線最低點為0.1μg/L，標準曲線的範圍為0.1～25.6μg/L，在雞肉、豬肉、雞肝、蝦、魚樣本中氟喹諾酮類藥物檢測限為0.2μg/kg、蜂蜜樣本中氟喹諾酮類藥物檢測限為1.6μg/kg。

2、試劑盒準確度和精密度

準確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒的準確度常用回收率表示；精密度是反應測定方法對某一特定樣品多次測定所得結果的重複程度，常用變異係數表示。分別向空白雞肉、豬肉、雞肝、蝦、魚、蜂蜜樣本中添加氟喹諾酮類藥物至終濃度為50μg/kg、100μg/kg，重複5次，分別取三個批次的試劑盒計算變異係數。結果表明，以50μg/kg氟喹諾酮類藥物添加空白雞肉、豬肉、雞肝、蝦、魚時，樣本添加回收率範圍為86.5～89.2%，以100μg/kg氟喹諾酮類藥物添加空白雞肉、豬肉、雞肝、蝦、魚時，樣本添加回收率範圍為93.4～95.8%；以50μg/kg氟喹諾酮類藥物添加空白蜂蜜時，樣本添加回收率範圍為83.7～89.5%，以100μg/kg氟喹諾酮類藥物添加空白蜂蜜時，樣本添加回收率範圍為80.6～86.9%；批內批間變異係數均小於20%，符合《農業部文件》農醫發[2005]17號附件2試劑盒備案參考評判標準中第四點精密度和準確度的規定。

3、交叉反應率試驗

選擇氟喹諾酮類藥物、諾氟沙星、雙氟沙星、氟甲喹、恩諾沙星、沙拉沙星、達氟沙星、培氟沙星、環丙沙星9種藥物按照常規方法分別測定交叉反應率，結果顯示各藥物的交叉反應率均高於80%。

本發明的試劑盒靈敏度高，穩定性強，該試劑盒可用於氟喹諾酮類藥物的快速檢測，適用於魚、蝦等水產品，雞肉、豬肉等畜禽產品；利用該試劑盒進行檢測時，靈敏度均可達0.2μg/L；本發明的試劑盒操作簡單，讀取結果時間短，按試劑盒說明在5～8min內即可判定檢測結果；可批量檢測，一步到位，成本低廉，投資少，見效快。

對於本領域技術人員而言，顯然本發明不限於上述示範性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特徵的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示範性的，而且是非限制性的，本發明的範圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和範圍內的所有變化囊括在本發明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。