α1,2-巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬及其生產方法與應用的製作方法
2023-12-05 18:25:46 4
專利名稱：α1,2-巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬及其生產方法與應用的製作方法
a 1,2-巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬及其生產方法與應用本發明涉及一種a 1，2-巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬及其生產方法與應用，屬於轉基因生物育種領域。在養豬業中，斷奶前後斷奶仔豬腹灣(post-weaning diarrehea, PffD)與水腫病(edema disease, ED)是一種重要的傳染病。此病從仔豬出生到斷奶這一階段的死亡率高達11. 5% 29. 5%，給養豬業造成了極大地經濟損失。當前一些對仔豬腹瀉與水腫病的預防性措施，如提高管理水平、改善衛生環境、注射藥物以及亞單位疫苗接種，·儘管在一定程度上減少了病況的發生與流行，但並沒有從根本上去尋求解決，找到一種全新的仔豬腹瀉與水腫病的預防與控制策略迫在眉睫。從長遠來看，採用遺傳學方法從遺傳本質上提高豬對病原的抗性，開展抗病育種具有治本的功效。產腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicE. coli, ETEC)是引起仔豬斷奶後水腫與腹瀉病、生長發育不良甚至死亡的主要病原菌，其致病因子主要是腸毒素和黏附素。黏附素(adhesion)又稱菌毛(fimbriae)或定居因子(colonization factor),是ETEC菌體表面的一種纖毛樣突出物,能與宿主小腸上皮細胞刷狀緣相應受體結合，細菌在仔豬小腸黏膜上黏附、定居、繁殖，並產生腸毒素，通過滲透，弓丨發組織胺的釋放，導致血管壁損傷，水分大量滲出而引起水腫與腹瀉病。因此，PWD和ED產生的前提條件是該細菌能否定植在宿主腸道黏膜表面，仔豬對該病原的易感性則在很大程度上取決於其小腸黏膜上皮細胞上是否存在F18菌毛的受體以及具有顯性遺傳特性。研究表明，a I, 2-巖藻糖轉移酶(a I, 2-fucosyltransferas,FUTl)基因是ECF18受體蛋白基因的最佳候選基因。RNA幹擾(RNA interference, RNAi)是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達，以其周期短、效率高和低成本的優點，是研究基因功能、防治病毒、治療疾病和改良品種製備轉基因動物的理想途徑之一。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA會發生降解而導致基因表達沉默。鑑於在基因沉默方面的高效性和簡單性，該技術已被廣泛作為探索基因功能和基因治療等領域的工具。慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-I (人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發展得很快，研究的也非常深入。目前慢病毒也被廣泛地應用於RNAi的研究中，但是在哺乳動物中的研究並不多。現階段將目的基因導入靶細胞和組織的方法主要包括真核表達質粒的轉染和病毒載體介導的基因轉移方法等。與真核表達質粒相t匕，利用高效的慢病毒系統，病毒載體介導的基因轉移可以整合入宿主的基因組中，具有更好的穩定性。質粒的轉染效率明顯低於慢病毒載體，因為質粒轉染不少屬於瞬時表達，目的基因常常隨時間的延長而發生丟失，會隨著有絲分裂而吸收或者導致核酸酶活性的升高，而且質粒不能轉染非分裂細胞。慢病毒載體介導的RNAi具有高效，穩定和特異性很強的特點，它能在哺乳動物的受體細胞實現長時間穩定的效應。為了進一步研究FUTl基因的功能以及探索一條利用RNAi技術培育抗仔豬腹瀉與水腫病的豬新品種，我們針對豬FUTl基因的編碼區選取了 4個不同位點的片段，在Invitrogen 公司商品化的載體 pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miR 和 pLenti6. 3/V5-DEST 的基礎上，構建了 4個關於FUTl基因的RNAi慢病毒表達載體。將構建好的真核表達載體利用脂質體共轉染293T細胞，通過Real-timePCR和Western Blot的方法綜合篩選出2條針對FUTl基因有效的RNAi靶位點，選取幹擾效應最顯著的第3個靶位點來構建慢病毒表達載體並包裝成慢病毒。將該RNAi慢病毒顆粒感染梅山豬胎兒成纖維細胞，並添加一定濃度的滅稻瘟素(Blasticidin，BSD)篩選出穩定細胞系。通過體細胞核移植技術生產了基於該轉基因細胞系的克隆胚胎，並選擇同期發情的皖北黑豬作為待孕受體母豬，將經體外培養得到的早 期胚胎植入母豬體內妊娠後，獲得了 a 1，2-巖藻糖轉移酶基因沉默的克隆豬。本發明要解決的技術問題是提供一種a 1，2-巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬。本發明要解決的另外一個技術問題是提供通過轉基因生物育種，生產a 1，2_巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬的方法。對於a 1，2_巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬，本發明採用的技術方案是，將該豬的基因組整合了一段a 1，2-巖藻糖轉移酶基因的RNAi核苷酸序列，使得該基因在表達過程中發生轉錄後水平的沉默。對於生產a 1，2_巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬的方法，本發明採用的技術方案是，包括以下步驟(I)藉助基因工程方法構建豬a 1，2-巖藻糖轉移酶基因的RNAi慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP-FUTI ；(2)通過細胞轉染及細胞篩選技術篩選出a 1，2-巖藻糖轉移酶基因被高效沉默的豬胎兒成纖維細胞系；(3)利用體細胞核移植技術進行克隆豬的生產。作為優選，上述生產方法步驟(I)的基本過程為以豬a 1，2_巖藻糖轉移酶基因的編碼區作為靶位點，設計合成相應的互補的兩條miRNA寡核苷酸單鏈，經退火形成雙鏈後，連接到RNAi表達載體pCDNA 6. 2-GW/EmGFP-miR上，並在目的片段上下遊分別分別添加酶切位點Asc I和Pme I，然後PCR擴增EmGFP+FUTl片段，約930bp，連接至慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5-DEST ,命名為pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP_FUTl。本發明a 1，2-巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬可用於培育抗仔豬腹瀉與水腫病豬新品種。本發明的有益效果是RNAi技術以其在基因沉默方面周期短、效率高和低成本的優點，是探索基因功能和基因治療等領域的理想途徑之一。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA會發生降解而導致基因表達沉默。試驗首次將該技術應用於大動物體水平上探索FUTl基因的功能，以及培育抗仔豬腹瀉與水腫病豬新品種的研究。在構建慢病毒載體方面，與傳統shRNA載體相比，試驗通過miRNA RNAi載體系統運用micro RNA(miRNA)結合更多細胞內源機制元素，在細胞中更高效的表達RNA髮夾結構，實現更高效的基因沉默。質粒中含有pol II啟動子，這是一種人的巨細胞病毒早期即亥IJ啟動子，可高水平構成性表達miRNA，並且能在大多數哺乳動物細胞株中表達。此外，該質粒可同時表達報告基因EmGFP和目的miRNA，所以EmGFP與miRNA的表達具有100%的相關性，這使得miRNA的表達可在任何細胞類型中進行示蹤。
以該轉基因細胞系作為供體細胞進行核移植，所獲得的克隆胚胎經驗證可以在體外培養發育至囊胚，並與對照組相比無顯著差異。最後，選擇重構後經體外培養得到的早期胚胎植入待孕受體母豬妊娠，獲得了 8頭轉基因克隆豬，且轉基因的陽性率為100%，為進一步研究FUTl基因的功能以及培育抗仔豬腹瀉與水腫病豬新品種奠定了基礎。一 . FUTl基因RNAi片段的設計與表達載體構建登陸網址 http://rnaidesigner.invitrogen.com/rnai express/,使用Invitrogen公司的在線設計軟體Invitrogen' s RNAi Designer,將豬FUTl基因編碼區的核苷酸序列(GeneBank登錄號U70883. 2)輸入。軟體給出10個長度為21nt的片段序列，起始位點不同，以星級數提示對此靶點的作用潛力。使用BLAST排除和其他編碼序列/EST同源的序列，使得設計的靶mRNA與豬細胞內已知的任何基因沒有同源性，從而儘量排除shRNA非特異性抑制其它基因片段的可能。從中選取4個最佳片段和並一段不針對任何基因的陰性對照片段，並依次命名為FUT1-1、FUT1-2、FUT1-3、FUT1_4以及NC。合成相應的互補的兩條miRNA寡核苷酸單鏈，互補的miRNA寡核苷酸單鏈經退火形成雙鏈，BsaI酶切Invitrogen公司商品化的pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miRRNAi表達載體，用T4DNA連接酶連接退火形成的雙鏈與酶切後的質粒載體，轉化、搖菌、提取質粒並測序，分別構建成 pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl-l, pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl_2，pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl_3，pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl-4 和 pcDNA6. 2-EmGFP-NC 載體。二 FUTl基因過表達載體的構建根據豬FUTl基因序列的編碼區設計引物，上遊引物FUTl-Fl 5/ GTCAgaattcGCCACCATGTGGGTCCCCAGCCG 3'，帶有EcoRI 酶切位點，下遊引物 FUTl-Rl :5' GAATgtcgacGAAGGCCCAGCCAACATCTG 3丨，帶有SalI酶切位點。以Trizol法提取新鮮的豬肺臟組織總RNA，並以此為模板進行 RT_PCR，PCR 反應條件94°0預變性31^11，941 30s, 60°C 30s, 68°C lmin，共30個循環，最後68°C延伸lOmin。將PCR擴增的FUTl基因片段與真核表達載體pEGFP-Nl分別用EcoRI和SalI進行雙酶切，純化後，T4DNA連接酶進行連接，轉化至大腸桿菌DH5 a，菌液PCR鑑定陽性克隆，抽提質粒進行酶切鑑定，將菌液PCR和酶切鑑定均呈陽性的樣品送至生物公司進行測序，保留測序正確的克隆。三.RNAi有效靶點的篩選轉染前一天，利用胰蛋白酶消化293T細胞，接入24孔板，分別使細胞置於500 yl的DMEM+10% FBS培養基，5% C02、95%溼潤空氣、37°C培養。轉染前細胞調整至80%的培養密度，轉染當天，從293T細胞中移除培養基，分別換上新鮮的400 ill DMEM+10%FBS培養基(不含抗生素)，37°C孵育。I) RNAi有效靶點mRNA水平的篩選a)0. Iu g過表達載體與0. 7 ii g的4個幹擾載體及陰性對照pcDNA6. 2-NC與50 ylopti MEM 混勻後，室溫放置 5min ;b)10iil Lipofec tamin 2000 加入到 250 不含抗生素和血清的opti MEM培養基，混勻後，室溫放置5min ；c) 二者混合後室溫放置20min ；37. 5°C, 5% C02培養箱培養4-6h，更換培養基為含10% FBS的DMEM培養基。轉染48h後，螢光顯微鏡觀察細胞的轉染效率。Trizol法裂解細胞，提取RNA，反轉錄成cDNA，使用SYBRGreen螢光定量PCR法檢測各個幹擾載體的幹擾效率。PCR條件為95°C 2min，95°C 20s,58°C 15s,72°C 20s，共30個循環。PCR結束後，進行熔解曲線實驗，升溫溫度從60°C到95°C。用2_a ACt法進行基因表達的相對定量，外源驗證各靶位點在mRNA水平的幹擾效率。2) RNAi有效靶點蛋白水平的驗證 將已成功構建好的RNAi載體和陰性對照載體pcDNA6. 2-EmGFP-NC用DraI單酶切，切除原有載體中的EmGFP，電泳回收大片段，並將該片段進行自連，轉化至大腸桿菌DH5 a，進行菌液PCR鑑定，抽提質粒進行測序鑑定，構建成了不含有EmGFP基因的四個RNAi載體和pcDNA6. 2-NC載體。轉染前一天，利用胰蛋白酶消化293T細胞，接入6孔板，分別使細胞置於2ml DMEM+10% FBS培養基，5% C02、95%溼潤空氣、37°C培養。轉染前保證細胞培養密度達到80%，轉染當天，從293T細胞中移除培養基，分別換上新鮮的I. 5ml DMEM，37°C孵育。a) 0. 5 y g過表達質粒與3. 5 y g的4個幹擾載體及陰性對照 pcDNA6. 2-NC % 250 u I DMEM 混勻後，室溫放置 5min ；b) 20 u I Lipof ectamin 2000加入到480 u I不含抗生素和血清的DMEM培養基，混勻後，室溫放置5min ；c) 二者混合後室溫放置20min ；37. 5°C,5% C02培養箱培養4_6h，更換培養基為含10% FBS的DMEM培養基。轉染72h後，螢光顯微鏡觀察細胞的轉染效率。裂解細胞中的總蛋白，對其進行Westernblot，外源驗證各靶位點在蛋白水平的幹擾效率。四.RNAi有效靶點慢病毒表達載體的構建設計引物，在目的片段上下遊分別分別添加酶切位點Ascl和Pmel，以幹擾效應最顯著的3號靶位點片段的pcDNA6. 2-EmGFP-FUTl-3載體為模板，PCR擴增EmGFP+FUTl_3片段，約 930bp。PCR 反應條件95°C 預變性 3min，94°C 30s, 56°C 30s, 68°C lmin，共 30 個循環，最後68°C延伸lOmin。回收PCR產物,連接至酶切後的Invitrogen公司商品化的慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5-DEST ，轉化、搖菌、提取質粒並測序驗證，構建成pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP-FUTl-3 載體。五 RNAi載體的慢病毒包裝復甦早代次的293T細胞(代數低於20代)於IOcm皿中，轉染前調整細胞融合度至80%,按I : 5的比例傳至15個poly-(D-lysine) (PDL)包被的IOcm皿中,10ml (DMEM+10% FBS+1 % P/S)培養液，37°C、5% CO2細胞培養箱中繼續培養約24h。轉染前的2-3h，將培養基換成5ml不含抗生素的DMEM+10% FBS0轉染時，無菌離心管內加入250 u I無血清與抗生素的opti MEM培養基，然後向其中加入所製備的各DNA溶液，即慢病毒表達質粒6 ii g、包裝質粒Lentiviral Packaging Mix 6iig,混合均勻。在另一無菌離心管中加入250 ill無血清的DMEM培養基，向其中加入Lipofectamine 2000轉染試劑24 yl，輕輕混勻，室溫下溫育5分鐘。把稀釋後的DNA與稀釋後的Lipofectamine 2000進行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。混勻後，在室溫下溫育20分鐘，37. 5°C, 5% C02培養箱培養4-6h，更換培養基為含10% FBS的DMEM培養基。轉染48h後，收集293T細胞上清液(第一次收液)。細胞更換新鮮的完全培養基，繼續培養至72-80h，收集病毒上清，與第一次收集的混合，4°C、3000rpm離心lOmin，除去細胞碎片以0. 45 u m醋酸纖維素膜的濾器過濾上清液，得到慢病毒液，Iml/管進行分裝，_80°C保存。六.豬胎兒成纖維細胞轉基因細胞系的建立將處於對數生長期的目的細胞進行胰蛋白酶消化，製成細胞懸液。將細胞懸液(細胞數約為5X IO4)接種於6-well中，371、5%0)2濃度的培養箱培養細胞至密度達到約80%。根據最佳MOI值測定的結果選擇合適的MOI值，加入適宜量的慢 病毒，同時加入濃度終為6 ii g/ml的Polybrene增強感染,24h後換成沒有病毒和Polybrene的完全培養基繼續培養，感染48-72h後觀察細胞中EmGFP的表達情況，並拍照記錄感染結果。選擇螢光率較高的細胞，加入終濃度為8 u g/ml的Blasticidin進行藥物篩選，持續觀察細胞的生長情況，篩選前期由於細胞大量死亡會釋放有害物質，因此需每1-2天換一次培養基。在加藥後的5天左右，細胞數量銳減，此後可2-3天換液一次，持續篩選2周後，把抗生素濃度降到篩選濃度的50%進行維持培養，約2-3周後將穩轉的細胞擴增，得到的細胞一部分進行凍存為後續的實驗做準備，一部分收樣進行檢測。七.目的片段整合鑑定與FUTl基因RNAi效率的檢測分別對建立的非轉基因細胞和慢病毒感染的細胞用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，PCR檢測目的基因在轉基因細胞中的整合情況。PCR反應條件為94°C 3min，94°C 30s,58°C 30s, 72°C 10s，共 35 個循環。Primer Express 3. O軟體以跨內含子的方式設計FUTl基因引物、內參基因HPRTl引物。分別對慢病毒感染的3組細胞即RNAi組、陰性對照組以及空白對照組用Trizol裂解提取總RNA，並經RNA-free DNaseI處理，以避免基因組DNA汙染，然後反轉錄為cDNA，RT-PCR驗證退火溫度，使用SYBR Green螢光定量PCR法檢測各個載體的幹擾效率。PCR條件為95°C預變性10min，95°C 15s, 60°C lmin，共30個循環。PCR結束後，進行熔解曲線分析，升溫溫度從60°C到95°C。用I一法進行基因表達的相對定量。九.轉基因克隆胚胎的生產與移植體外成熟的豬卵母細胞脫除卵丘後，在體視鏡下挑選排出第一極體且卵周隙明顯的卵母細胞，同時用顯微操作液TCB(HEPES緩衝的含7. g/mlCB，2% FBS的TCM199)洗滌準備的體細胞，將卵母細胞和轉基因細胞一起放入顯微操作碟的核移植操作液TCB中，並將操作碟置於裝有38. 5°C恆溫熱臺的顯微操作臺。去核採用盲吸法，即用固定針吸持卵母細胞，用注射針撥動使卵母細胞使極體位於5點處，去核針從3點鐘位置進針，吸取第一極體及其周圍約1/5-1/4可能含有卵母細胞核的胞質，之後用去核針吸取轉基因細胞(直徑約15-20 u m,折光性強，圓形，光滑的)，從去核切口進入卵母細胞透明帶下注入，輕輕點壓透明帶，使體細胞與胞質膜緊密接觸。操作完後將重構卵轉移到石蠟油覆蓋好的T2液滴中,在38. 50C的恆溫箱中中恢復30min。融合和化學輔助激活將T2中已恢復好的重構卵在化學輔助激活液(PZM-3+10 ii g/mL CHX+10 u g/mL CB)激活lOmin，然後分批移入融合/激活液中洗滌3遍，每批10枚放入已經鋪滿融合液的融合槽內，用拉制的很細的實心玻璃針撥動重構胚胎，使供體細胞-受體卵細胞膜接觸面與與電場方向垂直，用CF-150B融合儀(BLS，匈牙利)施加單個156v/mm，100 u s的直流電脈衝誘導融合同時電激活，隨後用T2 (HEPES緩衝的含2% FBS的TCM199)培養液洗滌3遍，立即轉入蓋礦物油的T2中，30min後在體視鏡下判定融合。將融合的重構胚用胚胎培養液洗滌3遍後轉入預平衡4h以上的胚胎培養滴PZM3內，每個培養滴50 ill培養10-15枚胚胎。在38. 5°C、5% CO2UOO %
條件下培養，胚胎發育至二細胞、四細胞期時，選擇同期發情的皖北黑豬作為待孕受體母豬 進行胚胎移植。
權利要求
1.α 1，2-巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬，其特徵在於，該豬的基因組整合了一段α I，2-巖藻糖轉移酶基因的RNAi核苷酸序列，使得該基因在表達過程中發生轉錄後水平的沉默。
2.根據權利要求I所述豬的生產方法，包括以下步驟 (1)藉助基因工程方法構建豬α1，2_巖藻糖轉移酶基因的RNAi慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP-FUTI ； (2)通過細胞轉染及細胞篩選技術篩選出α1，2-巖藻糖轉移酶基因被高效沉默的豬胎兒成纖維細胞系； (3)利用體細胞核移植技術進行克隆豬的生產。
3.根據權利要求2所述的生產方法，所述步驟(I)的基本過程為 以豬α 1，2-巖藻糖轉移酶基因的編碼區作為靶位點，設計合成相應的互補的兩條miRNA寡核苷酸單鏈，經退火形成雙鏈後，連接到RNAi表達載體pcDNA 6. 2-Gff/EmGFP-miR上，並在目的片段上下遊分別分別添加酶切位點Ascl和Pmel，然後PCR擴增EmGFP+FUTl片段，約930bp，連接至慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5-DEST ,命名為pLenti6. 3/V5-DEST-EmGFP-FUTl0
4.α 1，2-巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬在培育抗仔豬腹瀉與水腫病豬新品種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種α1，2-巖藻糖轉移酶基因沉默的體細胞克隆豬及其生產方法與應用。本發明針對豬α1，2-巖藻糖轉移酶基因構建了RNAi慢病毒表達載體，包裝慢病毒顆粒後，感染豬胎兒成纖維細胞，以該轉基因細胞係為核供體，生產了基因組整合有一段α1，2-巖藻糖轉移酶基因的RNAi核苷酸序列的克隆豬，為進一步研究該基因的功能以及培育抗仔豬腹瀉與水腫病豬新品種奠定了基礎。
文檔編號C12N15/867GK102703506SQ20121003296
公開日2012年10月3日 申請日期2012年2月10日 優先權日2012年2月10日
發明者吳蓉花, 周娜汝, 張宇, 張運海, 張遠亮, 李運生, 章孝榮, 章美玲, 陳建文, 陶佳, 隨劉才, 韓春楊 申請人:安徽農業大學