活性羧甲基茯苓多糖及其生產工藝和應用的製作方法
2023-12-05 12:45:41 3
專利名稱：活性羧甲基茯苓多糖及其生產工藝和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於抗腫瘤高分子多糖領域，尤其涉及作為生物反應調節劑的中等羧甲基
取代度的羧甲基茯苓多糖及其低成本生產工藝方法和應用。
背景技術：
尋找通用、有效的抗癌藥物與方法是醫學及其相關領域研究的熱點。國內外大量 研究證明，中藥多糖具有很強的免疫調節和抗腫瘤作用。茯苓多糖(Pachyman)為多孔菌科 植物茯苓(Poria cocos)的乾燥菌核的主要組成和活性成分(含量高達93%以上)，其結 構為帶少量(1 — 6)支鏈的(1 —3)-l3-D-葡聚糖。具有很好的生物相容性，低毒性，生物 降解性及可食用性等天然多糖的天然優勢。我國茯苓歷史悠久，資源豐富。尤其是在湖北 省羅田縣被國家命名為"中國茯苓之鄉"，年產量居全國第一。茯苓被列為國家食品藥品監 督管理局規定的藥食兼用資源之一。目前對茯苓多糖的應用研究的熱點是其抗腫瘤活性方 面。但是，未經結構修飾的茯苓多糖不具備抗腫瘤活性，必須對其進行適當的降解，衍生化 才可發揮藥理活性。 羧甲基茯苓多糖為是茯苓最重要的深加工產物。中外學者對羧甲基茯苓多糖的理 化性質、生理活性、毒理及臨床進行了較深入的研究，結果發現羧甲基茯苓多糖具有明顯 抗腫瘤，調節機體免疫功能，保肝降酶，間接抗病毒，誘生和促誘生幹擾素和白細胞調節素， 抗免疫抑制劑，減輕放射副反應，健胃安神，降血糖，抗衰老等生理活性。將其開發成一種新 型的抗腫瘤、免疫增強藥物，前景將十分廣闊。Hamuro等的實驗表明，活性茯苓多糖對不同 種屬的小鼠體內S-180肉瘤抑制率達到了 90%以上，對小鼠艾氏腹水瘤(EAC)和匪-102癌 的抑制率也達到40%和79%。我國張莉娜等的實驗也證明其顯著的抗腫瘤活性。研究表明 CMP可廣泛用於惡性腫瘤放化療的輔助治療，顯著增強惡性腫瘤患者的免疫功能，減少和消 除放化療的副反應，增強患者體質，提高患者的生活質量與延長壽命。 目前茯苓多糖可行的提取工藝主要是沸水浸提法和鹼提醇沉法。沸水法提取率極 低，浸提時間長且後處理工作量大，經煎煮後茯苓有效活性物質的所得率不過1 % ，而且過 高的提取溫度也會破壞多糖的結構和活性；鹼提醇沉法需要低溫操作和較濃的鹼液，並且 後處理較困難、操作費時且需要消耗大量的乙醇、丙酮等有機溶劑；此外，多糖本身高分子 量、難溶性、粘度和長鏈結構等物理特性也會導致活性羧甲基茯苓多糖的製備工序複雜，反 應體系粘度大、多糖易結塊而難於處理，產物難以分離。上述缺點導致了羧甲基茯苓多糖的 生產成本高、汙染環境且不易精製，難以實現其大規模化生產。
發明內容
本發明的目的是提供一種具有明顯抗腫瘤藥理活性的羧甲基茯苓多糖及其低成 本工業化生產工藝和用途，該工藝適應大規模工業化生產。 本發明提供的技術方案是一種活性羧甲基茯苓多糖的工業化生產工藝，先將茯 苓菌核進行超微粉碎，得到茯苓超微粉，然後用食用酒精常溫浸提，過濾得濾餅；然後以醇水體積比為i5 10 : i的水和乙醇混合物為介質，濾餅與氯乙酸和過量的氫氧化鈉反應， 得到具有抗腫瘤活性羧甲基茯苓多糖。 所述的氫氧化鈉分兩次加入，在加入氯乙酸之前先加入濾餅質量的1% _5%的氫 氧化鈉；在加入氯乙酸之後，再加入濾餅質量的1% _5%的氫氧化鈉。 所述以醇水體積比例為15 10 : 1的水和乙醇混合物為介質，濾餅與氯乙酸和 過量的氫氧化鈉反應是指在濾餅中加入2-5倍濾餅質量的乙醇與水的混合物，攪拌均勻 後，加入濾餅質量的1% _5%的氫氧化鈉，室溫下攪拌、鹼化40-120分鐘，加入濾餅質量的 15% _20%的氯乙酸，室溫攪拌10-20分鐘後再加入濾餅質量的1% _5%的氫氧化鈉，在 40-55 °C下醚化反應6-10小時，然後中和、過濾、洗滌、烘乾。
上述茯苓超微粉的粒徑為0. 2-10 ii m。 所述浸提用食用酒精的量為茯苓超微粉重量的20-50倍；浸提時間為24-48小時。
本發明所得到具有抗腫瘤的活性羧甲基茯苓多糖產物的平均分子量為 20. 0X 104-80. 1X 104， -CH2C00H取代度為0. 162-0. 92。 本發明所述活性羧甲基茯苓多糖是通過上述生產工藝製備而成的。 本發明所述的活性羧甲基茯苓多糖可用於製備抗腫瘤藥物或保健食品。 本發明可採用氣流粉碎機首先對乾燥的茯苓菌核進行超細粉碎，得到粒徑為
0. 2-10ym且粒度分布均勻的茯苓超微粉。此步驟將大大提高後續茯苓多糖的浸出率。 本發明茯苓超微粉經食用酒精浸提。過濾得到的濾液可作為茯苓浸膏原料或茯苓
酒的原料。 本發明將經過上述純化後的茯苓多糖進一步衍生化製備一系列水溶性和活性更 好的茯苓多糖羧甲基化衍生物。最終產物的溶解性、抗腫瘤活性、生物降解性和生物相容性 將大大提高。 本發明反應原理和方程式如下
formula see original document page 4 此外，針對原有茯苓多糖衍生化工藝存在著製備工序複雜，反應體系粘度大、多糖 易結塊等難於處理，產物難以分離，需要消耗大量的有機溶劑，成本高且汙染環境的缺點， 本發明進行如下改進 ①在鹼化過程中茯苓多糖容易結塊，在實驗室靠加速攪拌防止結塊，而在工業化 生產中攪拌轉速是固定的，無法實現加速攪拌。我們發現，結塊與體系中含水量有關，含水 量越大，結塊現象越嚴重；但是，實驗研究發現，在反應體系中適量的水也是有必要的(本 發明權利要求醇水體積比為15 10 : l)，對於醚化效率起到催化作用。因此，控制體系中醇水的比例是關鍵。 ②溶劑的選擇傳統工藝用的溶劑是異丙醇。異丙醇毒性較高，價格高，不易回收， 致使衍生物成本過高。而用乙醇作溶劑從原料處理開始到產品合成都能完成，便於生產管理。 ③鹼化方式的改進傳統的茯苓多糖衍生物製備工藝多採用一次鹼化法。由於 NaOH —次性加入到體系內，反應初期體系內鹼性很強，副反應程度較大，原料氯乙酸的利用 率只有40%，加之異丙醇價格較貴，因此優化活性茯苓多糖的製備條件，以降低成本，提高 收率和純度成為實驗的關鍵技術。我們初步的實驗結果表明，以乙醇和少量的水作為溶劑， 採用兩次加鹼法可大幅度地降低成本，並可獲得取代度適中、水溶性好的茯苓多糖衍生物。
1)羧甲基茯苓多糖產物的表徵。 採用紅外和核磁對其進行結構確認；酸鹼滴定法和元素分析法結合測定羧甲基的 取代度；採用凝膠色譜和光散射法連用測定其重均分子量分布。 本發明所提供的羧甲基茯苓多糖的低成本工業化生產工藝，通過工藝條件的優 化，控制系統用水量，合理回收並循環利用溶劑，大大減少工藝過程，降低生產成本。每噸 CMP可節約酒精和丙酮20噸，能耗降低75%，實現工業化生產。 此外，重要的是，我們前期體、內外藥理實驗研究均證明，我們發明所製備的活性 茯苓多糖具有明顯的抗腫瘤活性，對人卵巢癌細胞A2780和0VCAR3都有明顯生長抑制活性 並誘導細胞發生凋亡。且其良好的水溶性可顯著改善產品的生物利用度。前期藥理毒理實 驗表明，產品安全、有效，無任何不良反應。
具體實施例方式
實施例一 1 ，羧甲基茯苓多糖的製備 在20g茯苓菌核過80目篩，氣流粉碎機粉碎至平均粒度為O. 2-10ym，得到茯苓超 微粉；將茯苓多糖超微粉中20-50倍體積的食用酒精，在常溫下浸提48小時，充分除去茯苓 原料中的三鵬類物質等主要雜質，濾液作為茯苳浸膏原料、茯苳酒原料。濾餅待用。
將濾餅充分搗碎，在濾餅中加入2倍茯苓多糖質量的蒸餾水和乙醇混合物(醇 水比例為IO : l)，攪拌均勻後，加入茯苓多糖質量的1%的氫氧化鈉，室溫下攪拌、鹼化 40分鐘，加入茯苓多糖質量的15%的氯乙酸，室溫攪拌IO分鐘後再加入茯苓多糖質量 的1%的氫氧化鈉，在451:下醚化反應6小時，然後用lmol/L的稀鹽酸，將反應產物中和 至pH值為5 6，過濾，用80X (質量分數)乙醇洗滌，在5(TC下乾燥得到平均分子量為 20. 2X1(^、-CH^00H取代度為0. 162的羧甲基茯苓多糖。所得白色的羧甲基茯苓多糖粉末 經檢驗後包裝出廠。 2，產物的結構確認和質量檢驗 產物羧甲基茯苓多糖白色，均勻粉末，無臭無味。 理化限量指標 多糖含量％ (W) > 6060. 55,81. 66
水分％ 《10 6.3 重金屬限量指標
石申(As)mg/kg《21.67GB/T 5009.11-2003鉛(Pb)mg/kg《10.79GB/T 5009.12-2003滎(Hg)mg/kg《0. 20.005 GB/T 5009.17-2003微生物限量指標菌落總數(fu/g)《1000< 10GB/T 4789. 2-2003大腸菌群《30< 3 GB/T 4789. 3-2003黴菌《500 GB/T 4789. 15-2003沙門氏菌不得檢出未檢出GB/T 4789. 4-2003志賀氏菌不得檢出未檢出GB/T 4789. 5-2003金黃葡萄球菌不得檢出未檢出GB/T 4789. 10-2003紅外核磁表徵紅外光譜數據CMP的IR譜圖中可看到除了具有3420， 1250， 1650cm—1多糖特徵吸收峰及890cm—1 P -吡喃糖特徵吸收峰外，1620， 1340cm—1表明-C00H和_CH2-基團的存在。
核磁數據如下在產物的"C NMR譜圖中，主信號峰分別歸屬為103. 7卯m(C-l)，85. 3ppm(C-3)、 76. 8卯m(C-5) 、74. 4卯m(C-2) 、69. 4ppm(C-4)和61. 9卯m(C-6)。其中部分C-6信號峰從61. 9 位移至71. 0ppm(C-6s)，及C-5信號峰從76. 8位移至75. 5ppm(C-5')，說明羧甲基衍生化 發生在C-6位輕基，其取代度相對較高。
產物的水溶性測試 精確稱取產物lg於20ml蒸餾水中，攪拌溶解，觀察其溶解性。5分鐘以內發現產 物全部溶解，且溶液顏色澄清。
3，產物的抗腫瘤活性測試 3. 1.流式細胞儀檢測羧甲基茯苓多糖作用A2780細胞後的細胞凋亡
細胞長至對數生長期，用0. 25%胰酶消化成單細胞懸液，按濃度2X 106/ml接種6 孔板中，置37°C ， 5% C02培養箱培養24h，吸除原培養液，分別加入IC3。、 IC6。、 IC9。濃度的羧 甲基茯苓多糖RPMI1640培養液培養48h，用0. 25%胰酶消化成單細胞懸液，離心，吸去上清 液，PBS液洗2次，用IX Binding Buffer將細胞調整至1 X 106/ml濃度，取100 轉至流 式專用試管，加入5ii1 FITC(異硫氰酸螢光素，Fluorescein Isothiocyanate)-Annexin V(濃度lmg/ml，lXBinding Buffer稀釋)，混勻細胞，避光孵育15min，加入10 PI (濃 度250ii g/ml)溶液，再加入400iil 1 XBinding Buffer, 1小時之內上機檢測。同時染對 照管和補償設置管，即未染色的裸細胞，單染FITC-A皿exin V的管和單染PI的管。
3.2.流式細胞儀檢測羧甲基茯苓多糖對各細胞的細胞周期的影響
細胞長至對數生長期，用0. 25%胰酶消化成單細胞懸液，按濃度2X 106/ml接種6 孔板中，置37°C，5% C02培養箱培養24h，吸除原培養液，分別加入ICe。濃度的羧甲基茯苓 多糖RPMI1640培養液和對照液分別培養24，4S，72h。用0. 25 %胰酶消化成單細胞懸液， 4t:離心1000rpm， 5min，吸去上清液，PBS液洗2次，將細胞懸液轉入EP管中，離心1000rpm， 5min，去上清，一滴一滴加入冷(-2(TC)乙醇(終濃度70%)固定細胞，並且一邊加入固定 劑一邊振蕩，防止形成細胞團，4t:固定過夜(固定的細胞可以保存一段時間)，離心除去乙
6醇，PBS洗1次，去上清。將細胞數調整到1 X 106/ml，加入250 y g/ml的RNA酶(含0. 1 %TritonX-100) ，50ii g/ml碘化丙啶(Propidium Iodide, PI，終濃度)，4。C暗處放置30min。將樣品放入FCM的樣品室，用激發波長488nm測定。 結論採用體外培養人卵巢癌細胞的方法，考察了羧甲基茯苓多糖對人卵巢癌細胞A2780生長抑制活性，用流式細胞儀檢測了經處理後細胞的細胞凋亡和細胞周期的分布。該腫瘤細胞的增生都明顯受到抑制，且呈時間和劑量依賴性；不同濃度的羧甲基茯苓多糖都能誘導A2780細胞發生凋亡，且都呈劑量依賴性。
4，產物的藥理毒理學初步評價 用HUH7細胞考察不同濃度的羧甲基茯苓多糖的細胞毒性。細胞復甦傳代後，細胞計數，用DMEM培養液調整細胞濃度lX104cells/ml，以1000cells/well置於96孔培養板中，每個試樣複種6孔，在5% (1)2，371:標準環境下，用含10X小牛血清的DMEM培養液孵育，24h後進行實驗。用DMEM培養液調整ECH-CMP的濃度梯度並加入每孔，置細胞恆溫培養箱中繼續培養。72h後，取出培養板，觀察細胞形態。每孔加入20iU的MTT液，4h後，倒出原液，用PBS清洗兩遍後加入匿SO(IOO y1/孔)，室溫15 20min，振蕩培養板均勻染色，570mm波長檢測光吸收值(OD)，取6孔平均，按下列公式計算細胞相對增殖百分率(Relative cell viability)。
(OD570, - OD570, blank)Relative cell viability (%) =- x 100
(OD570,咖加j - OD570, blank) 結論製備的產物羧甲基茯苓多糖無明顯的細胞毒性。經過我們合成出的產物處理過的HUH7細胞生長狀態正常，細胞形態沒有發生任何改變。本實驗確證了產物的安全無毒。
權利要求
一種活性羧甲基茯苓多糖的工業化生產工藝，其特徵在於先將茯苓菌核進行超微粉碎，得到茯苓超微粉，然後用食用酒精常溫浸提，過濾得濾餅；然後以醇水體積比為15～10∶1的水和乙醇混合物為介質，濾餅與氯乙酸和過量的氫氧化鈉反應，得到具有抗腫瘤活性羧甲基茯苓多糖。
2. 根據權利要求l所述的生產工藝，其特徵在於所述的氫氧化鈉分兩次加入，在加入 氯乙酸之前先加入濾餅質量的1% _5%的氫氧化鈉；在加入氯乙酸之後，再加入濾餅質量 的1% _5%的氫氧化鈉。
3. 根據權利要求1或2所述的生產工藝，其特徵在於所述以醇水體積比例為15 10 : 1的水和乙醇混合物為介質，濾餅與氯乙酸和過量的氫氧化鈉反應是指在濾餅中加入2-5倍濾餅質量的乙醇與水的混合物，攪拌均勻後，加入濾餅質量的1% _5%的氫氧化 鈉，室溫下攪拌、鹼化40-120分鐘，加入濾餅質量的15% _20%的氯乙酸，室溫攪拌10-20 分鐘後再加入濾餅質量的1% _5%的氫氧化鈉，在40-551:下醚化反應6-10小時，然後中 和、過濾、洗滌、烘乾。
4. 根據權利要求1或2所述的生產工藝，其特徵在於茯苓超微粉的粒徑為 0. 2-IO踐。
5. 根據權利要求1或2所述的生產工藝，其特徵在於所述浸提用食用酒精的量為茯 苓超微粉重量的20-50倍；浸提時間為24-48小時。
6. 根據權利要求1或2所述生產工藝，其特徵在於所得到的具有抗腫瘤活性羧甲基 茯苓多糖產物的平均分子量為20. OX 104-80. IX 104， -CH2C00H取代度為0. 162-0. 92。
7. —種通過權利要求1或2所述生產工藝製備而成的活性羧甲基茯苓多糖。
8. 權利要求7所述的活性羧甲基茯苓多糖用於製備抗腫瘤藥物或保健食品。
全文摘要
本發明涉及活性羧甲基茯苓多糖的工業化生產工藝，先將茯苓菌核進行超微粉碎，得到茯苓超微粉，然後用食用酒精常溫浸提，過濾得濾餅；然後以醇水體積比為15～10∶1的水和乙醇混合物為介質，濾餅與氯乙酸和過量的氫氧化鈉反應，得到具有抗腫瘤活性羧甲基茯苓多糖。本發明所得的產物羧甲基茯苓多糖純度高、水溶性良好、分子量和羧甲基取代度適中且具有明顯抗腫瘤活性。所述的活性羧甲基茯苓多糖可用於製備抗腫瘤藥物或保健食品。本發明製備路線經濟環保，適於工業化大生產。
文檔編號A61K31/715GK101724091SQ20091027326
公開日2010年6月9日 申請日期2009年12月15日 優先權日2009年12月15日
發明者劉華華, 周小菊, 段小六, 熊虎, 肖玉玲, 胡先明 申請人:湖北省宏源藥業有限公司;武漢大學