一種促水產動物生長和提高抗病力的功能水產肽及其製備方法

2023-12-05 11:12:56 1

專利名稱：一種促水產動物生長和提高抗病力的功能水產肽及其製備方法
技術領域：
本發明涉及新鮮魚、蝦等水產加工副產物的生物工 程利用領域，具體涉及應用生物酶解結合發酵法製備具有促水產動物生長 和提高抗病力的功能水產肽的方法。
(二)
背景技術：
隨著社會的發展，人們對無公害產品的需求日益增 加，因此為防止藥物殘留對人類產生危害，聯合國糧農組織、國際動物衛 生組織和世界衛生組織共同提出控制動物藥物的使用，未來將徹底禁止動 物使用抗生素及人工合成的促生長素等化學物質。因而，新型無汙染、無 殘留、無公害，能夠提高畜、禽、水產等動物免疫力、抗病力及生產性能 的安全綠色飼料添加劑將成為飼料行業創新和研究開發的重點。
肽是蛋白質不完全降解的產物，其在生物體內的營養價值及生理功能 非常重要，因此被稱為生物活性肽。活性肽包括生物體內自然存在的內源 性活性肽(如有鎮痛作用的腦啡肽、抗病毒改善肝功能作用的胸腺肽等)， 以及天然蛋白質經酶水解生成的外源性活性肽(如酪蛋白磷酸肽、大豆降 血壓肽、水產降血壓肽等)。由於酶解製得的寡肽具有多種生理功能作用， 因而被廣泛應用於醫藥、保健、畜禽等領域，顯示出良好的應用前景。
生物功能肽作為一種綠色詞料添加劑已逐漸被各國科學家和企業家 所關注。美國樂能公司中國分公司以大豆為原料，採用生物酶法製備了大 豆肽，產品名稱為樂能大豆肽，試驗證明產品具有調節豬、禽消化系統、 免疫系統、改善腸道內環境，提高飼料利用率和抗病力。華中農業大學生 命科學院、國家飼料工程技術研究中心、江西省農業科學院先後研究採用 混合固態發酵技術開發大豆蛋白肽，獲得的大豆蛋白肽體外消化率大於 95%,可用於配製早期斷奶的仔豬、犢牛等飼料的營養添加劑，成為易消化
4
吸收的蛋白詞料。近年一項專利"一種活性肽飼料添加劑及其製備方法和
用途"(ZL200410029787.0)提出以植物蛋白、動物蛋白為原料，採用芽 孢桿菌等微生物發酵法降解動植物蛋白質製備活性肽，該活性肽添加入斷 奶仔豬詞料，仔豬日增重率和飼料轉化率顯著高於空白對照組及抗生素 組。活性肽添加於蛋雞日糧，可提高產蛋率、增加蛋重、降低飼料消耗率， 同時有對雞外周血-T淋巴細胞增殖活力的影響。
然而，活性肽飼料添加劑目前均局限於家畜禽，也基本以大豆、動物 皮和內臟等陸地蛋白源為製備生產活性肽的原料。
水產動物由於生活環境與家畜禽截然不同，是一變溫動物，在進化史 上較畜禽低等，有著獨特的生理功能特性。生物活性肽的專一性決定了調 節水產動物生理功能的活性肽的結構與家畜禽不同。其特殊的水體養殖環 境也為試製功能活性肽帶來一定難度，因此具有調節水產動物生理功能特 性的功能肽產品還未曾見有。
水產魚類、蝦類深加工將產生50%左右的下腳料，資源量大。下腳料 中含蛋白質高達48%、必需胺基酸含量佔總胺基酸的50%以上，含有極 其豐富的Ca、 P、 Fe、 Se等常量和微量元素。蝦頭、魚體內臟含有大量 的生物酶及其未知的促生長因子，同時富含具有製備調節促水產動物生長 和提高抗病力等生理功能作用的必需胺基酸和芳香族胺基酸，是製備水產 活性肽的好原料。目前這些加工下腳料一部分用於生產粗詞料，由於加工 手段原始，飼料顆粒粗，魚蛋白質和魚骨不能充分被水產動物利用。有的 加工下腳料因得不到及時加工導致腐爛而被丟棄。目前蝦頭殼下腳料主要 用於生產甲殼素，由於甲殼素的強酸強鹼生產工藝嚴重破壞了蝦下腳料中 蛋白質、蝦紅素等營養物質結構，失去了蛋白質的營養價值。寶貴的生物 資源成為廢棄物，造成資源浪費和環境汙染。
水產動物的生活環境為水體，由於水溫低，又是變溫動物，因此消化 腺不發達，消化道簡單，消化酶因體溫低活性不高等因素，導致常規水產
伺料澱粉、蛋白質等原料利用率很低。本發明以水產加工副產物為原料，
採用先進的前處理技術，及複合生物酶和微生物多菌種有氧深層發酵相結
合的生物工程技術，製備的功能水產肽有提高水產動物體內的蛋白酶活力
和澱粉酶活力的功能，同時有促進水產動物鈣和磷的吸收，改善機體微環
境，提高免疫力和抗病力的作用。大大提高飼料中蛋白質和澱粉的利用率，
提高水產動物生長和成活率。

發明內容
本發明的任務是提供一種採用先進的前處理技術、 複合生物酶和微生物多菌種有氧深層發酵相結合的生物工程技術加工生 產功能水產肽的方法，該方法生產的功能水產肽可用作水產飼料添加劑， 具有促進水產動物生長和提高抗病能力，同時改善養殖水產品品質，提高 養殖水產的增重率和成活率。
將新鮮的魚、蝦等水產加工副產物經膠體磨研磨成80~100目的膠體
物，再將微細膠體漿調pH至5.0 8.5，用原料的0.2%~0.4%內切酶與原料 中原有的生物酶組合形成複合水解工具酶，複合水解1.5 2小時，水解溫 度控制在30 45"C，使蛋白質大分子大尺度的被水解成為大肽鏈分子；在 初步水解的液態原料中加入發酵介質碳水化合物、微量元素等，調pH至 6.0~7.5，滅菌後，接入真菌A.S 3.042、A.S 3.350，起始溫度控制在30~32°C ， 發酵10小時後，發酵熱使反應體系升溫，待發酵體系溫度接近35"C，開 始通入無菌氣體，控制反應體系溫度在32 35'C，此時微生物得到充足的 氧氣，快速生長，並大量分泌中性蛋白酶、酸性蛋白酶、膠原蛋白酶等形 成複合酶系，使原料、微生物、蛋白酶共為一體系，進行深層發酵。在該 體系中大分子肽被微生物分泌的蛋白酶進一步定向水解成為有促生長和 調節免疫功能的小分子肽。發酵後期，由於受到嗜酸性微生物的調控，及 蛋白質和糖等發酵物質的分解使發酵體系呈酸性，此時魚骨、魚鱗、甲殼
鈣質開始被分解，轉化為易為動物體吸收的離子鈣，使魚骨、魚鱗、甲殼
鈣質得到充分轉化利用。發酵30 48小時，經滅菌、濃縮、流化床乾燥， 製成粉劑產品，或將發酵滅菌後的產品經濃縮製成25%含固物的濃縮產
口
本發明的技術方案
本發明提供的促水產動物生長和提高抗病力的功能水產肽，是利用新 鮮的魚、奸水產加工副產物為原料，經如下加工步驟製得的功能水產肽。 其製備方法包括如下步驟
G)以新鮮的魚、蝦水產加工副產物為原料，經絞肉機絞碎成為粗糜漿，
糜漿加水，l份粗糜槳加2 4份水，再經膠體磨磨成為(50~100目)微細 膠體漿液，為下一步生物酶水解提供更多的作用底物；本發明直接以新鮮 的蝦頭殼、魚等水產加工副產物為原料，保留了蝦頭內臟及魚體內原有的 內源生物酶和微量元素、維生素、促生長因子等營養元素；
(2) 將上述微細膠體漿液調pH值至5.0~8.5，按漿液原料的重量比， 加入0.2% 0.4%的內切酶，該與原料中原有的內源生物酶組合形成複合水 解工具酶，進行酶水解1.5 2小時，水解溫度30 45'C，使蛋白質大分子 大尺度的被水解成為大肽鏈分子，得到酶解液；
(3) 將上述酶水解液進行發酵
a. 配製發酵培養基培養基為液體，各組分比例蛋白腖1.0 2.5g、 葡萄糖4 5g、可溶性澱粉10 20g、蔗糖10 15g、黃豆粉5 15g、麥芽糖 2~5g、生長因子3g，自來水1000ml，其中生長因子是Na2P042g、 Mg2S04 lg的混合物，調節pH至6.0~7.5，滅菌，得到液體培養基；
b. 製備種子液將真菌A.S 3.042和A.S 3.350同時接入滅菌後的上 述液體培養基中，於28 32。C培養48 72小時，得到種子液；
c. 發酵工藝將上述酶解液加入發酵罐中，然後加入碳源，使酶解
液中的含氮量與加入碳源的含碳量的重量之比為2 10 : 1，調pH至 6.0-7.5，將待發酵液在0.12 0.15MPa、 121 125。C滅菌20~30分鐘，冷卻 到25 35。C;加入種子液，種子液和發酵液的體積比為0.3 1.5:10，發酵 起始溫度控制在30 32"C，前期發酵10 18小時後，發酵熱使反應體系升 溫，待發酵體系溫度接近35°C，開始通入無菌空氣，使發酵體系得到充 足的氧氣，然後進行有氧深層發酵20 30小時，控制反應體系溫度在 32~35°C;此時微生物得到充足的氧氣，快速生長，並大量分泌中性蛋白 酶、酸性蛋白酶、膠原蛋白酶等形成複合酶系，使原料大分子肽、微生物、 蛋白酶共為一體系，該體系中大分子肽被微生物分泌的蛋白酶進一步定向 水解成為有促生長和調節免疫功能的小分子肽；發酵後期，由於受到嗜酸 性微生物的調控，及蛋白質和糖等發酵物質的分解使發酵體系呈酸性，魚 骨、魚鱗、甲殼鈣質開始被分解，轉化為易為動物體吸收的離子鈣，使魚 骨、魚鱗、甲殼鈣質得到充分轉化利用；總體發酵時間控制在30 48小時， 將產生更多的功能性水產短肽、生物鈣離子等營養元素；
(4)上述發酵液經滅菌、濃縮、流化床乾燥，製成粉劑產品；或將發 酵液滅菌後經濃縮製成25%含固物的濃縮液。
所述的第(2)步外加的專一性內切酶為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋 白酶、枯草桿菌中性蛋白酶中的一種，加入量為酶解原料的0.2%~0.4%。
所述的第(3)中，真菌A.S 3.042和A.S 3.350的接種量為1.0xl05cfu/ml 培養基，接入的真菌A.S 3.042和A.S 3.350的比例10:2。
所述的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶購自杭州三葉生物酶製劑廠，活力 3000U/g，最適pH7.5 8.5，酶解最適溫度40。C;胃蛋白酶購自上海生化 試劑廠，活力4500U/g,最適pH4 5，酶解最適溫度38";枯草桿菌中性 蛋白酶，購自於無錫酶製劑廠，活力50000U/g,最適溫度42。C，最適 pH7.2。
所述的真菌A.S 3.042、 A.S3.350均為食品工業用菌，食用安全，均 購自中國科學院微生物所。A.S 3.042為好氣菌，生長速度快、分生孢子 大、數量多、對雜菌的抵抗力強，其最適生長溫度為30 33'C，最高不宜 超過38t:，最適pH7.5，培養20小時為產酶旺盛期，28小時為高峰期， 主要分泌中性蛋白酶、還有果膠酶、澱粉酶等。A.S 3.350最適生長溫度 28~30°C，最適pH6.5，培養24小時為產酶旺盛期，30小時為高峰期，主 要分泌酸性蛋白酶、糖化酶、果膠酶和少量端肽酶等。
本發明採用氫氧化鈉或鹽酸調膠體漿pH值、培養基pH值和發酵罐 中發酵液pH值。
本發明技術的先進性在於
1) 該方法將生物酶工程、微生物多菌種深層發酵結合使用於水產加 工副產物的深度轉化，使原本浪費的低值資源中的蛋白質轉化為有促水產 動物生長、提高免疫功能的小分子肽，實現魚骨、魚鱗轉化為生物鈣，使 資源充分的得到利用。
2) 初步酶解的液態原料(或機械破碎的糜漿)通過多種微生物協同 深層發酵，可被微生物分泌的多種蛋白酶分解，大大提高功能小分子肽比 例。
3) 發酵中後期，由於受到嗜酸性微生物的調控及蛋白質和糖等發酵 物質的分解使發酵體系呈酸性，有效地激活了酸性蛋白酶、膠原蛋白酶的 活性，使魚骨、魚鱗、甲殼鈣質在生物酶和酸性環境中開始被分解，轉化 為易為動物吸收的離子鈣；
4) 工藝和技術達到資源全部轉化和利用，無廢棄物排放，確保了生 態環境安全。
採用高效液相色譜[方法參考中國食品學報，2006， 6(3): 128 132， 題目高效液相色譜法測定奶粉中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量]分析測得
本發明產品中肽相對分子質量分布(表l)，其中相對分子質量5000以下 的短肽含量高達95%以上，具有活性功能的肽一般均為小分子短肽。
相對分子質量 Relative molecular mass 00比例 Ratio (%)肽鏈長度(胺基酸數) Length of peptide chain
138000.32108
86500.2568
78500.9261
65000.4851
54302.8642
48901.9838
43200.9534
386011.9930
268012.0221
18905.9215
155010.1212
<100052.16<8
在水產養殖飼料中添加1%-3%的本發明功能肽粉劑，採用逐級擴大 混合的方法與飼料混合均勻，製成顆粒飼料飼餵；或將發酵後經濃縮製成 的25%含固物的濃縮液直接噴霧添加於常規詞料中詞餵；養殖45天(在 同等詞餵條件下，以不添加本發明產品為對照)，測得胰蛋白酶活力提高 45%-53%，澱粉酶活力提高50%-65%，增重率提高10%-15%，成活率提 高12%-15%，功能作用顯著。
(四)具體實施方案
實施例h
(1)將新鮮的蝦頭、殼100公斤，經絞肉機絞碎成為粗糜漿，粗糜 漿加水混合，水的加入量為1份粗糜漿加2 4份水，本實施例為4份水， 再經膠體磨成為50~100目的膠體漿液；(2) 將膠體漿液調pH至8.5，加入膠體漿液原料重量的0.2%的胰蛋
白酶(或胰凝乳蛋白酶)，並與蝦頭(殼)中大量的內源酶(原有的內源生 物酶有脂肪酶、肝胰臟蛋白酶、肝胰臟澱粉酶、腸澱粉酶、幾丁質酶等)
複合，共同水解2小時，水解溫度42'C，使蝦頭殼中的蛋白質大分子被 水解成為大肽鏈分子，製成水解液；
(3) 製備種子液
配製培養基蛋白腖L0 2.5g、葡萄糖4 5g、可溶性澱粉10~20g、 蔗糖10~15g、黃豆粉5 15g、麥芽糖2 5g、生長因子3g，自來水1000ml， 其中生長因子是Na2P042g、 Mg2S04lg的混合物，調節pH至6.0 7.5， 滅菌，得到液體培養基；
將真菌A.S 3.042和A.S 3.350同時接入滅菌後的液體培養基中，接種 量為1.0xl5cfU/ml培養基，接入的真菌A.S 3.042和A.S 3.350的比例 10:2，於28 32i:培養48 72小時，本實施例培養60小時，得到種子液；
(4) 發酵將步驟(2)得到的酶解液加入發酵罐中，測定酶解液的 含氮量，加入碳源麵粉(或玉米粉，或碎大米粉，或甘薯粉)和蔗糖，兩 者的重量比=4 : 1，碳源的加入量為使發酵液體的氮碳比為2~10 : 1，本實 施例為10:1，調pH至7.2，再將待發酵液在0.12 0.15MPa、 121~125°C 滅菌20 30分鐘，冷卻到25 35"C;加入種子液，種子液和發酵液的體積 比為0.3~1.5 : 10，發酵起始溫度控制在30~32°C，發酵10 18小時後，開 始通入無菌空氣，通氣速率為1.5L/min，使發酵體系得到充足的氧氣，微 生物進入有氧深層發酵20 30小時，控制反應體系溫度在32 35。C，產生 更多的功能性水產短肽。
(5) 發酵液經滅菌、濃縮、流化床乾燥，製成30公斤本發明產品(為 蝦紅色粉劑產品)。
(6) 本發明產品的應用 在對蝦養殖飼料中添加2%上述本發明產品(粉劑)，採用逐級擴大混 合的方法與飼料混合均勻，製成顆粒飼料飼喂。
實施例2:
(1) 新鮮的魚類加工副產物(碎魚肉、肉皮、魚骨、魚鱗、內臟等) 100公斤，經絞肉機絞碎成為粗糜漿，糜槳加水(l份粗糜漿+2份水)， 再經膠體磨成為80目微細膠體漿液；
(2) 將膠體漿液調pH至7.0，加入膠體漿液原料重量的0.4%枯草杆 菌中性蛋白酶(或胃蛋白酶，此時漿液調pH至5.0)，並與魚內臟的內 源酶(內源生物酶有脂肪酶、肝胰臟蛋白酶、肝胰臟澱粉酶、腸澱粉酶、 幾丁質酶等)複合，共同水解2小時，水解溫度45"C，使下腳料中蛋白 質大分子被水解成為大肽鏈分子，製成水解液；
(3) 製備種子液同實施例1;
(4) 發酵將步驟(2)中得到的酶解液加入發酵罐中，測定酶解液
的含氮量，然後加入碳源麵粉和蔗糖(麵粉和蔗糖的重量比=4: 1)，碳源 的加入量為使發酵液體的氮碳比為5 : 1，調pH至7.2，再將待發酵液在 0.12 0.15MPa、 121 125""C滅菌20~30分鐘，冷卻到25 35。C;加入種子 液，種子液和發酵液的體積比為1 : 10，發酵起始溫度控制在30 32'C， 發酵12小時後，開始通入無菌空氣，通氣速率為1.5L/min，使發酵體系 得到充足的氧氣，微生物進入有氧深層發酵30小時，控制反應體系溫度 在32 35"C，產生更多的功能性水產短肽；
(5) 發酵液經滅菌、濃縮、流化床乾燥，製成25公斤本發明產品。
(6) 本發明產品的應用
在對蝦養殖飼料中添加3%上述本發明產品(粉劑)，採用逐級擴大混 合的方法與飼料混合均勻，製成顆粒飼料詞喂。
權利要求
1.一種促水產動物生長和提高抗病力的功能水產肽，其特徵是利用新鮮的魚、蝦水產加工副產物為原料，經如下加工步驟製得功能水產肽，其製備方法包括如下步驟(1)以新鮮的魚、蝦水產加工副產物為原料，經絞肉機絞碎成為粗糜漿，糜漿加水，1份粗糜漿加2～4份水，再經膠體磨磨成為50～100目的微細膠體漿液；(2)將上述微細膠體漿液調pH值至5.0～8.5，按漿液原料的重量比，加入0.2％～0.4％的內切酶，與原料中原有的內源生物酶組合形成複合工具酶，進行酶水解2小時，水解溫度30～45℃，得到酶解液；(3)將上述酶水解液進行發酵，a.配製發酵培養基培養基為液體，各組分比例蛋白腖1.0～2.5g、葡萄糖4～5g、可溶性澱粉10～20g、蔗糖10～15g、黃豆粉5～15g、麥芽糖2～5g、生長因子3g，自來水1000ml，其中生長因子是Na2PO42g、Mg2SO41g的混合物，調節pH至6.0～7.5，滅菌，得到液體培養基；b.製備種子液將真菌A.S 3.042和A.S 3.350同時接入滅菌後的上述液體培養基中，於28～32℃培養48～72小時，得到種子液；c.發酵工藝將上述酶解液加入發酵罐中，然後加入碳源，使酶解液中的含氮量與加入碳源的含碳量的重量之比為2～10∶1，調pH至6.0～7.5，將待發酵液在0.12～0.15MPa、121～125℃滅菌20～30分鐘，冷卻到25～35℃；加入種子液，種子液和發酵液的體積比為0.3～1.5∶10，發酵起始溫度控制在30～32℃，發酵10～18小時後，發酵熱使反應體系升溫，待發酵體系溫度接近35℃，開始通入無菌空氣，使發酵體系得到充足的氧氣，控制反應體系溫度在32～35℃，微生物進入有氧深層發酵20～30小時，產生更多的功能性水產短肽；(4)上述發酵液經滅菌、濃縮、流化床乾燥，製成產品。
2. 根據權利要求1所述的功能水產肽的製備方法，其特徵是所述的 內切酶為胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、枯草桿菌中性蛋白酶中 的一種蛋白酶。
3. 根據權利要求1所述的功能水產肽的製備方法，其特徵是所述原料的魚、蝦水產加工副產物中原有的內源生物酶有脂肪酶、肝胰臟蛋白 酶、肝胰臟澱粉酶、腸澱粉酶、幾丁質酶。
4. 根據權利要求1所述的功能水產肽的製備方法，其特徵是發酵罐中加入的碳源為麵粉，或玉米粉，或碎大米粉，或甘薯粉。
5. 根據權利要求1所述的功能水產肽的製備方法，其特徵是將真菌 A.S 3.042和A.S 3.350接入液體培養基中的接種量為1.0xl05cfu / ml培養 基，真菌A.S 3.042和A.S 3.350的比例10:2。
全文摘要
本發明涉及一種促水產動物生長和提高抗病力的功能水產肽及其製備方法，以魚、蝦等水產加工副產物為原料，經絞肉機絞碎，再經膠體磨磨成50-100目微細膠體漿液，然後將外加的內切酶與水產原料的內源酶組合形成複合水解，再用真菌發酵製成功能水產肽。本發明方法解決了生物資源浪費和汙染環境等問題，利用本發明方法製得產品，採用逐級擴大混合的方法與飼料混合均勻，製成顆粒飼料飼喂，具有促進水產動物生長和提高抗病能力，同時改善養殖水產品品質，提高養殖水產的增重率和成活率。
文檔編號C12P21/02GK101182564SQ20071015704
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月20日 優先權日2007年11月20日
發明者朱碧英 申請人:國家海洋局第二海洋研究所;杭州國海海洋工程勘測設計研究院