臍帶來源間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法

2023-12-05 20:14:21

專利名稱：臍帶來源間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種幹細胞差異膜蛋白的檢測方法，特別涉及臍帶與臍血間充質幹細 胞(Mesenchymal stem cells, MSCSs)表面差異膜蛋白的檢測方法。
背景技術：
幹細胞(stem cells, SC)是一類具有自我複製能力的多潛能細胞，在一定條件下， 它可以分化成多種功能細胞。間充質幹細胞(MSCSs)是幹細胞家族的重要成員，來源於胚 胎發育期中胚層，主要存在於全身結締組織和器官間質中，骨髓組織中的含量較為豐富。因 其具有強大的增殖能力和多向分化潛能、造血支持和促進幹細胞植入、免疫調控等特點，使 其在組織工程、細胞治療和基因治療等方面具有廣泛的臨床應用前景。近年來，隨著人們對 間充質幹細胞生物學特性及功能的深入研究，已成功地從骨髓、外周血、肌肉、脂肪、臍血、 臍帶及胎盤等組織中分離並鑑定出MSCSs。臍帶來源的間充質幹細胞，迄今的研究表明，它不但能夠成為骨髓間充質幹細胞 的理想替代物，而且具有更大的應用潛能，它表達多種胚胎幹細胞的特有分子標誌，具有分 化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易於工業化製備等 特徵，因此極具具臨床應用前景。臍血是指臍帶內及胎盤近胎兒一側血管內的血液含有豐 富的幹細胞和前體細胞，其主要包含造血幹細胞和MSCSs。人臍血MSCk也有極其一致的生 物學特性，且可能更原始，增殖分化能力更強，易保存，免疫反應性低，因此也吸引了越 來越多研究者的關注。一般認為，流式細胞儀檢測時，臍帶MSCS強表達⑶13、⑶29、⑶44、 〇0105，不表達0034、0011&、0014、0031、0045。臍血 MSCS 表達 CD 29、CD 44、CD54、CD58、 CD90、C D 95、C D166 等免疫表型，不表達 CD14、CD34、CD40、CD45、CD50、CD68、CD80、CD8 6、⑶117和⑶152等免疫表型。但這些標誌不同文獻報導也不盡相同。迄今為止，臍帶和 臍血來源的間充質幹細胞都沒有特定的表面標誌。作為臍血輸送的管道——臍帶，目前也 沒有資料標明，其分離出的MSCS和臍血MSCS表面表達蛋白有何不同。但這種差異在發育 生物學上有著重要意義，本專利就是採用一種新的技術手段，來揭示臍帶和臍血中分離出 的MSCS表面蛋白表達差異。

發明內容
本發明要解決的問題是，克服現有技術中的不足，提供一種間充質幹細胞表面差 異膜蛋白的檢測方法，該方法可用於檢測臍帶和臍血兩種不同來源的間充質幹細胞表面的 特殊的膜蛋白標誌。雙向凝膠電泳是蛋白質組研究中的主流技術，但該技術的重複性和敏感 性不佳，且缺乏對蛋白質點的精確定量，近年來出現的雙向螢光差異顯示凝膠技術 (two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D—DIGE)克月艮了傳統的雙向 疑膠 電泳技術的上述缺點。2D-DIGE在傳統雙向凝膠電泳技術的基礎上，結合多重螢光分析的方 法，在同一塊膠上分離多個由不同螢光標記的樣品，並第一次引入了內標的概念，軟體自動根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的，極 大地提高了結果的準確性，可靠性和重複性，避免了使用不同凝膠時在操作上的偶然性和 不平行性。因此我們我們通過雙向螢光差異凝膠電泳對不同來源的膜蛋白進行分析，來研究 臍帶和臍血MSCS表面差異蛋白，在此基礎上一方面可製備單抗，進行MSCS的鑑定，另一方 面，揭示兩者在發育生物學上的關係。為解決技術問題，本發明是通過如下的技術方案實現的
提供一種臍帶來源間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法，包括以下步驟
(1)間充質幹細胞的分離和培養
臍帶MSCSs 取新鮮臍帶組織剪碎，膠原酶消化，收集消化得到的細胞懸液，使用 Ficoll分離液進行密度梯度離心，收集白膜層，洗兩遍，收集細胞，常規培養；
臍血MSCSs 取新鮮臍血，使用Ficoll分離液進行密度梯度離心，收集白膜層，洗兩遍， 收集細胞，常規培養；
所有間充質幹細胞均培養至對數生長期，用於移植；
(2)間充質幹細胞膜蛋白的提取
反覆凍融法使得細胞破碎，然後通過梯度離心得到含有膜蛋白的組分；
(3)雙向螢光差異凝膠電泳法獲取膜蛋白凝膠圖譜
通過雙向螢光差異凝膠電泳法(2D-DIGE)，得到Cy2、Cy3及Cy5螢光素標記的不同種類 的膜蛋白凝膠圖譜，採用DeCyder 2D圖像分析軟體進行分析，識別兩組間差異表達的蛋白 質點；
(4)質譜分析及驗證
選取差異蛋白質點，膠內酶解後進行質譜分析，並對MareixScience公司的Mascot 網上資料庫查詢，鑑定差異蛋白質，尋找不同來源幹細胞的特殊表面標誌，然後採用 Western-Blot 驗證。本發明的有益效果在於
本發明首次將2D-DIGE用來對幹細胞膜表面特殊差異表面標誌的檢測，可以在同一塊 凝膠上對不同樣品中蛋白質進行定量比較分析，在每塊凝膠中加入了內標，DIA和BVA軟體 可以自動地根據每個蛋白質點的內標對其表達量進行校準，最大程度上降低了不同批次膠 與膠之間的誤差，反應了蛋白質的真實改變程度，降低了假陽性率及假陰性率。
具體實施例方式下面結合具體實施例子，對本發明的技術方案詳細描述。首先聲明，雖然本發明中涉及使用新鮮臍帶組織和新鮮臍血，但針對的只是已脫 離人體的新鮮臍帶組織和新鮮臍血，其具體獲取過程本身並不屬於本發明的內容。本發明 對其製備方法的詳細描述只是為了更清楚地介紹生物材料的準備過程，但該描述並不意味 著相關技術手段也屬本發明要求保護的內容。(一)間充質幹細胞細胞的分離培養 臍帶MSCSs的分離培養
無菌條件下將臍帶用預熱的PBS充分洗滌去血漬後，剝離臍動靜脈血管，剪成Icm3見方的小塊，置於0. 1%四型膠原酶中消化，37°C消化，lh，過濾，用PBS衝洗，收集消化液和衝 洗液，1200 rpm，離心10 min，棄上清，PBS洗滌細胞沉澱。MSCS專用培養基重懸，接種於6 孔培養板中，置於37°C、5% CO2CO2飽和溼度培養箱中，行常規培養及傳代。臍血MSC^s的分離培養
無菌條件下取正常足月剖腹產孕婦的臍帶血50ml左右，按1 :1用磷酸鹽緩衝液 (PBS)進行稀釋，將稀釋後的臍血沿管壁緩慢加入含有Ficoll-PaqueTM PLUS人淋巴細胞 分離液(其相對密度為1.077g/L)的離心管中，進行梯度離心(20°C，2000rpm，25min)。離心 後，吸取管中白膜層，PBS洗滌兩次，獲得臍血單個核細胞。MSCS專用培養基重懸，接種於6 孔培養板中，置於37°C、5%0)2飽和溼度培養箱中，行常規培養及傳代。(二)分離細胞膜蛋白的方法
1、 冰上刮下細胞後將細胞溶於有蛋白酶抑制劑的緩衝液A (ImMkcl, 5mMNacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, ImM DTT, 0. 5 μ g/ml Leup印tin, 20 μ M pmsf (PH=7. 4))中，於室溫與液 氮罐中反覆凍融2次。2、 5000轉4度離心，驅除核及未裂解的細胞。3、 取上清12000轉4度離心10分鐘取沉澱溶於有蛋白酶抑制劑的緩衝 液 B (ImMkcl, 5mMNacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, ImM DTT, 0. 5 μ g/ml Leup印tin,20 μ M PMSF (ΡΗ=7· 4))中。4、 12000轉4度離心10分鐘取沉澱溶於有蛋白酶抑制劑的緩衝液C(0. 5 μ g/ ml Leup印tin, 20 μ M PMSF, 50mMTris-cl (ΡΗ=7. 0))中提取後測蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳， 分裝後-20度保存備用。(三)膜蛋白濃度測定
採用GE公司專門針對蛋白質組學研究設計的蛋白質抽提2D Quant Kit定量試劑盒。 其基本原理是將蛋白質沉澱後，去除裂解液，再用含銅離子的溶液重溶蛋白質沉澱，未與蛋 白質結合的銅離子可與顯色工作液反應而顯色，顯色的深淺與蛋白質的濃度成反比。(四)2D_DIGE
1、內標樣品製備2個樣品(N1、N2)各取50 μ g，體積10μ 1，加入到同一個印pendorf 管裡，震蕩混勻，離心。然後50 μ g每管分裝成2管。2、儲存液的製備把染料從-20°C的冰箱中取出，輕旋，室溫靜置5min，吸5μ 1 DMF至染料管中，震蕩離心，配製成lnmol/μ 1儲存液。3、工作液的製備首先取1. 8μ 1 DMF到印pendorf管，然後吸取1. 2μ 1儲存液到 一個印pendorf管中，震蕩離心即配成400 pmol/μ 的工作液。避光保存。4、樣品標記將每1 μ 1工作液和50 μ g蛋白的比例進行螢光標記。整個操作中避 光進行。冰上避光放置30 min，每管蛋白中加入Ιμ 賴氨酸終止標記反應
5、樣品準備將分別用Cy2、Cy3和Cy5標記的樣品加入到同一印pendorf管中，震蕩混 勻，短暫離心。避光操作。每塊膠上加入等體積的2X上樣緩衝液(7mol/L尿素，2mmol/L 硫脲,4% CHAPS, 65mmol/L DTT)冰上靜止10 min，準備上樣。 表1標記成分
膠數目CY2CY3CY5150 Ug (兩種蛋白各25 Pg)胎盤來源幹細胞膜蛋白50 Pg臍血來源幹細胞膜蛋白50 Pg250 Ug (兩種蛋白各25 Pg)臍血來源幹細胞膜蛋白50 Pg胎盤來源幹細胞膜蛋白50 Pg6、等電聚焦
分別將膠1 2中Cy2、Cy3, Cy5三種螢光標記樣品混合在一起。加入適量水化液和 (0. 5%v/v)IPG buffer (pH 4_7)振蕩混勻使各膠上樣的總體積為450 μ 1，將蛋白溶液吸至 IPG膠條槽內，將IPG幹膠條(Ph4-7NL，放入含蛋白的膠條槽中，覆蓋一層Immobiline Drystrip覆蓋液約^il,置於IPGphor等電聚焦儀上，設置程序，使水化和聚焦均在20°C下 進行，其中於30V低電壓水化12h，然後經過IOOV OUOOV 0H000V lh、8000V lh，最 後穩定在8000V下進行等電聚焦他。7、平衡
用鑷子夾出膠條，超純水衝洗後，在濾紙上吸乾，再以超純水衝洗，濾紙吸乾，然後 用鑷子夾住膠條以正極端(即酸性端)向下，負極端(即鹼性端)向上，放入用來平衡的試 管中(鑷子所夾的是鹼性端，酸性端留有溴酚蘭作為標記)，用平衡液A (50mmolTriS-HCL, pH8. 8,6mmol/L Urea，30%甘油，1%SDS，0. 2%DTT，0· 1%溴酚藍)，平衡液B (50mmolTriS-HCL， ρΗ8·8，6匪ol / L此63，30%甘油，1%505，3%碘乙醯胺，0.1%溴酚藍)先後平衡15min. 8、第二向垂直SDS-PAGE電泳
將IPG膠條從平衡緩衝液中移出，用鑷子夾住膠條的一端使膠面完全浸末在IX電泳 緩衝液中。然後將膠條膠面朝上放在凝膠的長玻璃板上，輕輕將膠條推至PAGE膠面上，膠 面和膠條要緊密結合，再將SDS-PAGE凝膠轉移到灌膠架上，在凝膠的上方加入0. 5%低熔點 瓊脂糖封膠液。5W/膠電泳30min，然後以20W/膠恆功率電泳，直至溴酚蘭指示線到達凝膠 底邊處停止電泳。9、掃描分析圖像
Typhoon多功能雷射掃描儀掃描SDS-PAGE凝膠，掃描後的圖像用DeCyderTM2D6. 5分析 圖像，找出差異蛋白點。10、加大上樣量建立製備膠並用考馬斯亮藍染色
將各組蛋白混合到ΙΟΟΟμ g，進行雙向電泳，再用考馬斯亮藍染色，用ddH20洗滌兩次， 每次15min，倒入考馬斯亮藍染藍染液(0. 25%考馬斯亮藍R-250，溶解於50%甲醇和10% 乙酸中)。搖染過夜(約13h)，棄掉考染液，用蒸餾水洗滌3次，再加入10%的乙醇脫色液 250ml，搖床上脫色至背景清晰為止，掃描保存圖像。(五)質譜樣品製備
1、根據DeCyder2D圖像分析軟體的分析結果在製備膠上尋找相應的蛋白點，用修剪 後的Iml移液器的Tip吸頭從凝膠上切取蛋白質點，裝入Eppendorf管中；
2、用50% ACN (乙腈)/IOOmM NH4HC03 (200ml，ρΗ8· 0)將小膠塊浸洗 IOmin,反覆 3 次；最後吸去洗液；
3、用SpeedVac將膠塊抽乾；
4、將膠塊浸入IOmMDTT/50mM NH4HC03 (pH8. 0)(通常50ml)中，並溫育Ih (溫度逐 漸升高到65°C)；之後吸去浸液；
5、將膠塊浸入55mM iodoacetamide/50mM NH4HC03 (pH8. 0)(比 5Oml 稍多)中，於室 溫下在暗室中溫育30min ；之後吸去浸液；
6、將膠塊用100mlIOmM NH4HC03浸洗IOmin ；吸去NH4HC03溶液後，再用100ml ACN浸 洗 IOmin ；7、重複第6步的操作一遍；
8、吸去上清液，用SpeedVac將膠塊抽乾5min ；
9、向裝有膠塊的Eppendorf管中加入5ml稀釋後的!Iomegatrypsin酶液，讓酶液被 膠塊吸收；
10、加入足量的IOmMNH4HC03以覆蓋吸脹的膠塊(約35ml)；
11、於37°C溫育3h或過夜；
12、加入等體積的60%ACN / 5% formic acid(約40ml)，超聲波振蕩lOmin，從而達到 抽提的效果。離心anin，收集並保存上清液。向剩下的膠塊再加入約40ml 60% ACN / 5% formic acid，重複剛才的操作，並保存上清；
13、將收集保存的上清液抽乾約Ih；
14、用ZipTipC18 脫鹽；
15、做MALDI分析前，將抽乾的樣品溶解在50%ACN/0.1%TFA中，-20°C保存。(六)質譜分析
將製備好的點樣板放入 Applied Biosystems Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS 質譜儀中進行分析，採用反射模式，正離子模式下測定，離子源加速電壓為20000 V，反射 電壓比為1. 12，N2雷射波長337nm，脈衝寬度為3 ns，離子延遲抽提100 nsec，真空度 4xlO-7Torr,採集質量範圍m/z800-3000道爾頓，質譜信號單次掃描累加100次，使用ACTH 作為外部標準，胰蛋白質酶自切降解峰(842. 510,2211. 105)作為內部標準校正，獲得肽質 量指紋圖(PMF)。(七)數據檢索
MALDI-TOF-MS質譜圖解譜採用Matrixkience公司的Mascot Distiller軟體進行， 先調用Data ExploreTM軟體處理AB公司MALDI-T0F-MS質譜產生的原始文件。資料庫查 ill^M MareixScience 白勺 Mascot, 其查詢網址為 http//www. matrixscience. com/ cgi/search_form. pl F0RMVER=2&SEARCH=PMF。資料庫檢索參數為Your name 和 E-Mail 內輸入相應的名字和E-mail地址，資料庫為NCBhr，物種分類(Taxonomy)為人類(Homo sapiens)，酶為Trypsin，允許的未酶切位點為1，固定修飾(Fixed modifications)為碘乙 醯胺Carbamidomethyl (C)修飾，可變修飾不選，肽片段容差為W0ppm，Mass values為MH+， 選擇Monoisotopic，選擇直接輸入Mascot Distiller產生的臨時文件或單同位素峰的列 表(Peak Lists)即可進行資料庫檢索。(A) western-blot 蛋白驗證 配製凝膠，分離膠為10%，濃縮膠為5%，
1、上樣，每孔蛋白量為40yg；
2、電泳，電壓為150V,時間為90min；
3、轉膜，電流為400mA,時間為IOOmin；
4、封閉池，封閉液為含5%脫脂奶粉的IXTBS溶液；
5、一抗(RON1:8000 ；Actin 1 800) 4°C冰箱過夜；
6、含0.05%吐溫的IXTBST洗膜4次，IOmin/次；
7、二抗(1:5000)室溫反應2h；
8、含0.05%吐溫的IXTBST洗膜5次，IOmin/次；9、ECL AB液顯色，X光片曝光30秒。
權利要求
1.臍帶來源間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法，包括以下步驟(1)間充質幹細胞的分離和培養取新鮮臍帶組織，剝離血管，剪碎，膠原酶消化；收集消化得到的細胞懸液，離心，收集 細胞，常規培養；取新鮮臍血，使用Ficoll分離液進行密度梯度離心；收集白膜層，洗兩遍，收集細胞， 常規培養；所有間充質幹細胞均培養至對數生長期，用於移植；(2)間充質幹細胞膜蛋白的提取反覆凍融法使得細胞破碎，然後通過梯度離心得到含有膜蛋白的組分；(3)雙向螢光差異凝膠電泳法獲取膜蛋白凝膠圖譜通過雙向螢光差異凝膠電泳法，得到Cy2、Cy3及Cy5螢光素標記的不同種類的膜蛋白 凝膠圖譜，採用DeCyder 2D圖像分析軟體進行分析，識別兩組間差異表達的蛋白質點；(4)質譜分析及驗證選取差異蛋白質點，膠內酶解後進行質譜分析，並對MareixScience公司的Mascot 網上資料庫查詢，鑑定差異蛋白質，尋找不同來源幹細胞的特殊表面標誌，然後採用 Western-Blot 驗證。
全文摘要
本發明涉及幹細胞差異膜蛋白的檢測方法，旨在提供一種臍帶來源間充質幹細胞表面差異膜蛋白的檢測方法。該方法包括間充質幹細胞的分離和培養、間充質幹細胞膜蛋白的提取、雙向螢光差異凝膠電泳法獲取膜蛋白凝膠圖譜、質譜分析及驗證。本發明首次將2D-DIGE用來對幹細胞膜表面特殊差異表面標誌的檢測，可以在同一塊凝膠上對不同樣品中蛋白質進行定量比較分析，在每塊凝膠中加入了內標，DIA和BVA軟體可以自動地根據每個蛋白質點的內標對其表達量進行校準，最大程度上降低了不同批次膠與膠之間的誤差，反應了蛋白質的真實改變程度，降低了假陽性率及假陰性率。
文檔編號G01N27/64GK102095776SQ20111000189
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月6日 優先權日2011年1月6日
發明者俞炯, 曹紅翠, 李蘭娟 申請人:浙江大學