一種改良試劑盒法從微量乾燥葉片中提取DNA的方法與流程
2023-12-04 19:21:06 1
本發明涉及植物dna製備技術領域，具體來說是一種改良試劑盒法從微量乾燥葉片中提取dna的方法。
背景技術：
核酸是構成生命體中基本遺傳物質的主要化合物，從核酸分子水平系統深入的研究是認識各種生命現象的基礎。植物dna的提取主要用於基因文庫構建、pcr分析及southern雜交等，因此高質量的dna的獲得對於功能基因組學以及遺傳學研究具有重要意義。目前，在植物提取dna的研究中，已經發展了多種方法，成功地從植物葉片、愈傷組織、組培苗、果實、初皮部等組織器官中提取出dna。這些方法多採用新鮮或冷凍的材料，但對於野外，尤其是遠距離採樣，攜帶冰壺或液氮非常不方便，這需要在提取dna前對樣本作一些特殊的處理，有研究發現通過矽膠乾燥後的片可用於植物基因組dna的提取，但是不論幼嫩的葉片或成熟的葉片，雖葉片迅速失水，但在植物葉片組織中還含有大量的多糖、多酚、蛋白和酯類等植物次生代謝產物及降解的dna，這使得提取dna的常出現產量低、質量差、易降解，影響了dna質量和純度，不能被限制性內切酶酶切，嚴重的甚至不能作為模板進行pcr擴增，用新鮮葉片材料提取有著很大的差異。
生態建設、環境保護日益受到大家的關注，植物是重要的自然資源環境要素，對於維持生態平衡和發展經濟有著重要作用，然而隨著科技的發展,我們的生活日益提高.可是,我們的地球卻受到了危害，森林資源遭受嚴重的破壞，許多珍貴的植物資源遭到毀滅性的打擊，因此，植物dna的提取研究對植物的就地保護、種質資源收集保存及種源培育工作尤為重要。
目前，關於植物dna提取方法的報導絕大部分都是在sds法和ctab法基礎上進行改良，但都無法擺脫用研磨棒或玻璃棒對樣品逐個研磨的操作步驟，且提取步驟繁瑣耗時,傳統的ctab法是目前應用最廣泛的dna提取方法，但是該方法在提取植物乾燥葉片時，殘留了大量的蛋白糖類物質，影響到後續的pcr擴增、遺傳多態性分析研究,迄今，還未見針對植物乾燥葉片中提取高質量dna的研究報導。
技術實現要素：
本發明的目的是為了解決現有技術中的提取複雜繁瑣、無法提取高質量dna的缺陷，提供一種改良試劑盒法從微量乾燥葉片中提取dna的方法來解決上述問題。
本發明公開了一種改良試劑盒法從微量乾燥葉片中提取dna的方法，具體步驟為：
(1)、取20mg乾燥海葉片組織加入到2.0ml冷凍研磨離心管中，並放入1個已滅菌鋼珠，液氮冷凍3-5min，將離心管放入研磨儀中研磨8-12min，得到乾粉；
(2)、將步驟(1)得到的乾粉加入500ullp1和6ulrnase，渦旋震蕩1min，室溫放置15min，期間上下顛倒5-10次；
(3)、向步驟(2)中產品加入130ul緩衝液lp2，渦旋震蕩1min；
(4)、將步驟(3)中的離心管置於離心機中，12000rpm(～13400*g)離心5min，將上清液轉移至新的1.5ml離心管中；
(5)、向步驟(4)得到的上清液中加入1.5倍的緩衝液lp3，充分震蕩混勻15-30sec；
(6)、將步驟(5)得到的溶液及沉澱全部加入同一個吸附柱cb3中，將吸附柱放入收集管中，12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重新將吸附柱cb3放回收集管中；
(7)、向吸附柱中加入600ul漂洗液pw,12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重複此步驟一次；
(8)、將吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400*g)離心3min，倒掉廢液，將吸附柱放入新的1.5ml離心管中，室溫放置5-10min，徹底晾乾吸附柱中的殘餘漂洗液，得到吸附膜；
(9)、向吸附膜中間部位懸空加入50ul無核酸酶水，室溫放置5min，12000rpm(～13400*g)離心5min，取出並丟棄吸附柱；
(10)、對dna濃度及純度檢測，-20℃保存樣本。
作為優選，所述的步驟(1)中，在將離心管放入研磨儀之前，需要對研磨儀先預冷；
作為優選，所述的步驟(1)中，在將乾燥海葉片組織加入冷凍研磨離心管之前，先使用無菌水配置的80％乙醇進行衝洗，晾乾後，將海葉片組織剪碎；
作為優選，所述的步驟(2)中，所述的rnase的濃度為10mg/ml；
作為優選，所述的步驟(4)中，在將上清液轉移至新的1.5ml離心管的過程中，不要碰到沉澱；
作為優選，所述的步驟(9)中，在將無核酸酶水加入吸附膜中間部位時，需要先將無核酸酶水預熱至65℃。
本發明相比現有技術具有以下優點：
根據本發明，在傳統試劑盒與研磨法的基礎上，靈活調整步驟，使乾燥葉片快速高效的研磨成粉末抽提dna，能夠從微量乾燥葉片中提取高質量的基因組dna，提取比較便捷。
附圖說明
圖1是本發明的實施例與ctab法抽提dna的瓊脂糖凝膠電泳圖；
圖2是改良試劑盒法抽提dna，2ul稀釋10倍稀釋後dnapcr電泳圖。
具體實施方式
下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
本發明公開了一種改良試劑盒法從微量乾燥葉片中提取dna的方法，具體步驟為：
(1)、取20mg乾燥海葉片組織加入到2.0ml冷凍研磨離心管中，並放入1個已滅菌鋼珠，液氮冷凍3-5min，將離心管放入研磨儀中研磨8-12min，得到乾粉；
(2)、將步驟(1)得到的乾粉加入500ullp1和6ulrnase，渦旋震蕩1min，室溫放置15min，期間上下顛倒5-10次；
(3)、向步驟(2)中產品加入130ul緩衝液lp2，渦旋震蕩1min；
(4)、將步驟(3)中的離心管置於離心機中，12000rpm(～13400*g)離心5min，將上清液轉移至新的1.5ml離心管中；
(5)、向步驟(4)得到的上清液中加入1.5倍的緩衝液lp3，充分震蕩混勻15-30sec；
(6)、將步驟(5)得到的溶液及沉澱全部加入同一個吸附柱cb3中，將吸附柱放入收集管中，12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重新將吸附柱cb3放回收集管中；
(7)、向吸附柱中加入600ul漂洗液pw,12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重複此步驟一次；
(8)、將吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400*g)離心3min，倒掉廢液，將吸附柱放入新的1.5ml離心管中，室溫放置5-10min，徹底晾乾吸附柱中的殘餘漂洗液，得到吸附膜；
(9)、向吸附膜中間部位懸空加入50ul無核酸酶水，室溫放置5min，12000rpm(～13400*g)離心5min，取出並丟棄吸附柱；
(10)、對dna濃度及純度檢測，-20℃保存樣本。
作為優選，所述的步驟(1)中，在將離心管放入研磨儀之前，需要對研磨儀先預冷；
作為優選，所述的步驟(1)中，在將乾燥海葉片組織加入冷凍研磨離心管之前，先使用無菌水配置的80％乙醇進行衝洗，晾乾後，將海葉片組織剪碎；
作為優選，所述的步驟(2)中，所述的rnase的濃度為10mg/ml；
作為優選，所述的步驟(4)中，在將上清液轉移至新的1.5ml離心管的過程中，不要碰到沉澱；
作為優選，所述的步驟(9)中，在將無核酸酶水加入吸附膜中間部位時，需要先將無核酸酶水預熱至65℃。
實施例1
本發明公開了一種改良試劑盒法從微量乾燥葉片中提取dna的方法，具體步驟為：
(1)、取同種植物的不同生長時期乾燥海葉片組織20mg，使用無菌水配置的80％乙醇進行衝洗，並將晾乾葉片剪碎並轉移至2.0ml冷凍研磨離心管中，並放入1個已滅菌鋼珠，液氮冷凍4min，並將離心管放入液氮預冷研磨儀中研磨10min，得到乾粉；
(2)、將步驟(1)得到的乾粉加入500ullp1和6ulrnase，渦旋震蕩1min，室溫放置15min，期間上下顛倒7次；
(3)、向步驟(2)中產品加入130ul緩衝液lp2，渦旋震蕩1min；
(4)、將步驟(3)中的離心管置於離心機中，12000rpm(～13400*g)離心5min，將上清液轉移至新的1.5ml離心管中；
(5)、向步驟(4)得到的上清液中加入1.5倍的緩衝液lp3，充分震蕩混勻20sec；
(6)、將步驟(5)得到的溶液及沉澱全部加入同一個吸附柱cb3中，將吸附柱放入收集管中，12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重新將吸附柱cb3放回收集管中；
(7)、向吸附柱中加入600ul漂洗液pw,12000rpm(～13400*g)離心30sec，倒掉廢液，重複此步驟一次；
(8)、將吸附柱放回收集管中，12000rpm(～13400*g)離心3min，倒掉廢液，將吸附柱放入新的1.5ml離心管中，室溫放置7min，徹底晾乾吸附柱中的殘餘漂洗液，得到吸附膜；
(9)、向吸附膜中間部位懸空加入50ul無核酸酶水，室溫放置5min，12000rpm(～13400*g)離心5min，取出並丟棄吸附柱；
(10)、對dna濃度及純度檢測，-20℃保存樣本。
作為優選，所述的步驟(1)中，在將離心管放入研磨儀之前，需要對研磨儀先預冷；
作為優選，所述的步驟(2)中，所述的rnase的濃度為10mg/ml；
作為優選，所述的步驟(4)中，在將上清液轉移至新的1.5ml離心管的過程中，不要碰到沉澱；
作為優選，所述的步驟(9)中，在將無核酸酶水加入吸附膜中間部位時，需要先將無核酸酶水預熱至65℃。
採用nanodrop測定提取dna的濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取dna的完整性，經測定樣本的a260/a280在1.8左右，從nanodrop和瓊脂糖電泳可以看出，對比採用傳統的ctab法提取乾燥葉片dna，儘管可獲得dna，但dna的純度和濃度均很低，質量很差，相對的，採用實施例的方法可在相同樣品量的前提下，提取獲得純度和濃度高，完整性好的基因組dna，在後續的pcr作為模板進行高效擴增，尤其適用於比較稀缺珍貴的樣本。
以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特徵和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明的範圍內。本發明要求的保護範圍由所附的權利要求書及其等同物界定。