豬浮腫病疫苗的製作方法

2023-12-04 19:12:56 1

專利名稱：豬浮腫病疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於生產豬浮腫病疫苗的DNA構建物、含有從該DNA構建物轉化的轉 化體的豬浮腫病疫苗、以及用該豬浮腫病疫苗防除豬浮腫病的方法。
背景技術：
已知豬浮腫病是具有Stx2e毒素的大腸桿菌(浮腫病菌)在上部腸管內急劇增 殖、毒素吸收到血中而發病的細菌病，高發生於斷乳後1 2周的仔豬。浮腫病菌的感染引 起的致死率極高，為50 90%。現在，浮腫病的防除使用多種抗生素，但又存在出現耐性菌 等的問題，其使用受限制。在這樣的背景中，為了提供有效預防豬浮腫病的方法，人們進行了關於豬浮腫病 疫苗的研究。例如，報告有如下例子，使用無毒化的浮腫毒素蛋白質使豬免疫，預防浮腫病 菌的感染引起的死亡(非專利文獻1)。這其中，使用重組大腸桿菌生產無毒化的浮腫毒素 蛋白質，將此物質接種於豬。然而，由重組大腸桿菌得到的無毒化的浮腫毒素蛋白質的生產 量並不充分，而且這樣的疫苗接種需要通過蛋白質的直接注射或經鼻噴霧等進行，會花費 人的勞動力等，從豬浮腫病疫苗的實用化的觀點來看，存在不能實現低成本化的問題。另一方面，近年來進行著使用轉基因技術使植物生產有用的物質的研究。如，報告 有使萵苣生產大腸桿菌易熱性毒素(LT)蛋白質的B亞基的例子(非專利文獻2)。該研究 中，使用植物高表達啟動子花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(CaMV35S)和增強子Kozak序 列，在萵苣內表達改變了密碼子的的LT蛋白質的B亞基的基因。結果，報告有LT蛋白質的 B亞基積蓄了萵苣的總可溶性蛋白質的約2.0質量％。但是，這種程度的蛋白質的積蓄量對 利用轉基因植物有效防除細菌病來說是不充分的。即，需要使目的蛋白質的基因高表達，在 植物細胞內有效生產、積蓄目的蛋白質。另一方面，已知來源於菸草的醇脫氫酶基因的5，-非翻譯區(NtADH5，UTR)的鹼 基序列是在擬南芥或水稻發揮作用的增強子(專利文獻1、非專利文獻3)。然而，尚未報告 使用該NtADH5，UTR的鹼基序列來表達編碼細菌毒素蛋白質的基因的例子。非專禾lj文獻 1 :Makino et al. , Microbial Pathogenesis, Volume 31, Number 1, July 2001，pp. 1-8(08)非專利文獻2 :Kim et al. , Protein Expression and Purification,Volume 51, Number 1, Jan2006, pp. 22-27(06)專利文獻1 日本專利特開2003-79372公報非專利文獻 3 :Satoh et al. , The 5，-untranslated region of the tobacco alcoholdehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004)98，1-8

發明內容
本發明的課題在於開發一種低成本地且高效率地生產豬浮腫病疫苗的技術。此外，具體地說課題在於，在植物細胞高效表達豬浮腫病的毒素蛋白質(Stx2e蛋白質)的基 因、以低成本生產豬浮腫病的植物疫苗。本發明人發現，通過使用來源於植物的醇脫氫酶基因的5』-非翻譯區(ADH5』UTR) 使在氨基末端附加有來源於植物的分泌信號肽的Stx2e蛋白質表達，使Stx2e蛋白質被萵 苣等的植物高效生產，在植物體內高濃度地積蓄，完成了本發明。即，本發明如下所述。第一發明是，一種DNA構建物(以下也稱作「本發明的DNA構建物」)，含有來源於 植物的醇脫氫酶基因的5』 -非翻譯區、以及在該區域以可表達地連接的編碼Stx2e蛋白質 的DNA，所述Stx2e蛋白質在氨基末端附加有來源於植物的分泌信號肽。所述醇脫氫酶基因的5』 -非翻譯區優選來源於菸草。此外，所述分泌信號肽優選 來源於菸草。此外，所述Stx2e蛋白質優選是Stx2e蛋白質的B亞基。此外，在所述Stx2e蛋白質的羧基末端優選附加有內質網滯留信號肽或液泡運輸 信號肽，內質網滯留信號肽優選在羧基末端含有KDEL序列或HDEL序列，液泡運輸信號肽優 選來源於菸草。此外，本發明的DNA構建物優選具有序列編號12、23、24、75、77、78、86的任意一個
表示的鹼基序列。第二發明是，一種含有本發明的DNA構建物的重組載體(以下也稱作「本發明的重 組載體」)。第三發明是，用本發明的重組載體轉化的轉化體(以下也稱作「本發明的轉化 體，，)。本發明的轉化體優選轉化植物細胞或轉化植物。此外，所述植物優選萵苣。第四發明是，從所述轉化植物細胞或轉化植物得到的種子(以下也稱作「本發明 的種子」)。第五發明是，含有本發明的轉化體的豬浮腫病疫苗(以下也稱作「本發明的豬浮 腫病疫苗」)。第六發明是，一種豬浮腫病的防除方法(以下也稱作「本發明的豬浮腫病的防除 方法」)，其特徵在於，將本發明的豬浮腫病疫苗向豬投與。


圖1是顯示GFP報告表達載體的構成的圖。圖中，一表示翻譯起始點，▽表示翻譯 後被切斷的部位。圖2是表示Stx2eB表達載體的構成的圖。圖中，一表示翻譯起始點，▽表示翻譯後 被切斷的部位。圖 3 是用 CLUSTALW(http://align, genome, jp/)比較已設計的 mStx2eB 1-4 的鹼 基序列的圖。圖4是顯示利用PCR的mStx2eB的合成的概念的圖。圖5是顯示將PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠中展開、用溴化乙錠染色後用UV照射 確認DNA條帶的結果的圖(照片)。圖6是顯示將直接PCR的溶液在1. 5%瓊脂糖凝膠中展開、用溴化乙錠染色後用 UV照射確認DNA條帶的結果的圖(照片)。
圖7是顯示Stx2eA表達載體的構成的圖。圖中，一表示翻譯起始點，▽表示翻譯後 被切斷的部位。圖8是顯示萵苣原生質體中的GFP報告的表達的狀態的圖(照片)。圖9是顯示在使用了附加有各信號肽的Stx2eB表達載體的轉化萵苣原生質體中 的Stx2e B的積蓄量的圖(照片)。圖10是顯示使用了附加有內質網滯留信號肽的改變密碼子的Stx2eB表達載體的 轉化萵苣原生質體中的Stx2eB的積蓄量的圖(照片)。圖11是顯示使用了附加有內質網滯留信號肽的改變密碼子的Stx2eB表達載體的 轉化萵苣原生質體中的Stx2eB的積蓄量的圖(照片)。圖12是顯示使用了附加有內質網滯留信號肽的Stx2eA表達載體的轉化萵苣原生 質體中的Stx2eA的積蓄量的圖(照片)。圖13是顯示Stx2eB_GST融合蛋白質的SDS-PAGE分析的結果的圖(照片)。M 標 準物、1 :Stx2eB 8M尿素溶液、2 重摺疊Stx2eB_GST溶液(注入樣品)、3 非結合成分(非 結合畫分)、4 清洗第1次溶出成分、5 清洗第2次溶出成分、6 溶出樣品(結合成分)圖14是顯示使用了抗VT2抗體的蛋白質印跡分析的結果的圖(照片)。圖15是顯示Stx2eB_GST融合蛋白質小鼠經鼻投與的抗體效價測定的結果的圖。圖16是顯示使用了附加有內質網滯留信號肽的Stx2eB表達載體的轉化菸草BY2 培養細胞中的Stx2eB的積蓄量的圖(照片)。圖 17 是用 CLUSTALff(http://align, genome, jp/)比較了已設計的 mStx2eB 5 的 鹼基序列的圖。圖18是顯示使用了附加有內質網滯留信號肽的改變密碼子的Stx2eB表達載體的 轉化菸草BY2培養細胞中的Stx2eB的積蓄量的圖(照片)。圖19是顯示使用了附加有內質網滯留信號肽的改變密碼子的Stx2eB表達載體的 轉化菸草BY2培養細胞中的Stx2eB的積蓄量的圖(照片)。圖20是顯示在強制投與浮腫病菌的第0天採取的糞便中的Stx特異性IgA的抗 體效價的圖。圖21是顯示在強制投與浮腫病菌的第0天採取的血液中的Stx特異性IgG的抗 體效價的圖。圖22是顯示在強制投與浮腫病菌的第3天日採取的糞便中的浮腫病菌數的圖。圖23是顯示整個期間的飼料需求率的圖。圖24是顯示飼料需求率的推移的圖。圖25是顯示每頭仔豬的平均臨床症狀評分的推移的圖。圖26是顯示每頭仔豬的整個期間的合計臨床症狀評分的平均的圖。圖27是未投與浮腫病疫苗組的仔豬和投與浮腫病疫苗組的仔豬的浮腫病菌投與 第11天的照片。
具體實施例方式本發明的DNA構建物的特徵在於，含有來源於植物的醇脫氫酶基因的5』 -非翻譯 區以及在該區域可表達地連接的編碼Stx2e蛋白質的DNA，所述Stx2e蛋白質在氨基末端附加有來源於植物的分泌信號肽。醇脫氫酶基因的5』 _非翻譯區是指，包含從編碼醇脫氫酶的基因的轉錄起始 點到翻譯起始點(ATG、蛋氨酸)之前為止的鹼基序列的區域。該區域具有翻譯量增大 功能。「翻譯量增大功能」是指被結構基因編碼的信息轉錄後，被翻譯而產生蛋白質時， 使通過翻譯產生的蛋白質量增大的功能。所述區域只要來源於植物即可，優選屬於茄科 (Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，進一步優選屬於煙 草屬(Nicotiana)、擬南芥屬(Arabidopsis)、萵苣屬(Lactuca)等的植物，更優選來源於煙 草(Nicotianatabacum)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、萵苣(Lactuca sativa)等。作為所述醇脫氫酶基因的5』 _非翻譯區，尤其優選例如由來源於菸草 (Nicotianatabacum)的醇脫氫酶基因的5』 -非翻譯區的鹼基序列的序列編號1表示的鹼 基序列構成的區域。來源於植物的醇脫氫酶基因的5』 _非翻譯區可以從高表達醇脫氫酶的植物培養 細胞的醇脫氫酶基因離析(參考日本專利特開2003-79372號公報)。此外，對菸草的醇脫 氫酶基因的5』 -非翻譯區等、其鹼基序列確定的物質，可以通過化學合成、或將該區域的 5』以及3』末端的鹼基序列作為引物、將基因組DNA作為模板通過PCR等合成。此外，也可 以通過鹼基序列確定的所述區域的一部分作為探針使用，探出其它植物的醇脫氫酶基因的 5』 -非翻譯區，將此離析。此外，以序列編號1的鹼基序列表示的所述醇脫氫酶基因的5』 -非翻譯區只要保 持著翻譯量增大功能，也可以取代、缺失、插入或附加一個或多個鹼基。所述「多個」優選 2 10個，更優選2 5個，特別優選2 3個。此外，也可以使用具有與所述醇脫氫酶基因的5』 -非翻譯區優選85%以上、特別 優選90%以上的同一性、並且保持翻譯量增大功能的DNA。對所述區域是否具有作為目的的翻譯量增大功能，可以通過如在菸草培養細 胞中將GUS(0-葡糖醛酸苷酶)基因或螢光素酶基因作為報告基因的瞬間表達分析 (transientassay)、重組染色體的轉化細胞的分析等來確認。在所述來源於植物的醇脫氫酶基因的5』-非翻譯區可表達地連接有編碼Stx2e蛋 白質的DNA，所述Stx2e蛋白質在氨基末端附加有來源於植物的分泌信號肽。這裡，「可表 達」指本發明的DNA被插入到含有適當的啟動子的載體中，將該載體導入到適當的宿主細胞 時，在宿主細胞內生產所述Stx2e蛋白質。此外，「連接」是既包括2個DNA直接結合的情 況、也包括通過其它鹼基序列結合的情況的概念。Stx2e蛋白質是浮腫病菌的毒素蛋白質，由毒素主體的1個A亞基和與侵入腸黏膜 有關的5個B亞基構成。A亞基用序列編號2的胺基酸序列表示，B亞基用序列編號3的氨 基酸序列表示。編碼本發明的DNA構建物中所包含的Stx2e蛋白質的DNA既可以是編碼含有A亞 基和B亞基兩者的Stx2e蛋白質的DNA，也可以是僅編碼A亞基或B亞基的DNA。但是，含 有編碼A亞基的DNA時，優選改變DNA的鹼基序列後使用，以便被生產的A亞基為無毒。本發明的DNA構建物中，編碼Stx2e蛋白質的DNA優選僅編碼B亞基的DNA。在本發明的DNA構建物中被編碼的Stx2e蛋白質只要能夠投與豬後引起免疫應 答，Stx2e蛋白質的胺基酸序列(序列編號2和/或序列編號3)中的一個或多個胺基酸也
6可以被取代、缺失、插入或附加。作為所述「多個」，例如在A亞基中優選2 30個，進一步 優選2 20個，更優選2 10個，在B亞基中優選2 10個，進一步優選2 5個，更優 選2 3個。此外，也可以是具有與Stx2e蛋白質的胺基酸序列(序列編號2和/或序列編號 3)優選85%以上、更優選90%以上、特別優選95%以上的同一性、並且投與豬後能引起免 疫應答的蛋白質。編碼Stx2e蛋白質的DNA可以根據例如序列編號4以及/或序列編號5的鹼基序 列通過一般的基因工程學的手法容易地得到。具體地說，可以通過從生產Stx2e蛋白質的 浮腫病菌按照常用方法調製cDNA文庫，使用根據上述鹼基序列製作的探針從該文庫選擇 期望的克隆，由此得到編碼Stx2e蛋白質的DNA。此外，也可以通過將上述鹼基序列作為基 礎進行化學合成、將上述鹼基序列的5』以及3』末端的鹼基序列作為引物、將基因組DNA作 為模板的PCR等來合成。此外，可以用於本發明的DNA構建物的製作的、編碼Stx2e蛋白質的DNA的鹼基序 列優選，根據生產該蛋白質的宿主細胞適當改變表示構成Stx2e蛋白質的胺基酸殘基的密 碼子，以使Stx2e蛋白質的翻譯量增大。作為改變密碼子的方法，可以參考例如Kang等(2004)的方法(實施例中詳述)。 此外，舉例有選擇在宿主細胞中使用頻率高的密碼子、或GC含量高的密碼子、或選擇在宿 主細胞的看家基因中使用頻率高的密碼子的方法。例如，作為對序列編號5所表示的鹼基序列改變密碼子的鹼基序列舉例有序列編 號6 9、79所表示的鹼基序列。在本發明的DNA構建物的製作中，優選使用具有序列編號 6、8、9、79所表示的鹼基序列的DNA。此外，也可以使用在嚴格的條件下與具有序列編號4及/或序列編號5 9的任 一個的鹼基序列的DNA雜交的DNA。「嚴格的條件」是指形成所謂特異性雜交體、未形成非 特異性雜交體的條件。例如，舉例有如下條件，即同一性高的兩個DNA、優選具有80%以上、 更優選具有90%以上、特別優選具有95%以上的同一性的兩個DNA雜交，但比這個同一性 低的2個DNA不雜交。例如，舉例有2XSSC(330mMNaCl、30mM檸檬酸)、42°C。編碼所述Stx2e蛋白質的DNA與來源於植物的編碼分泌信號肽的DNA連接，以使 Stx2e蛋白質的氨基末端附加有來源於植物的分泌信號肽。這裡，「附加」是既包括所述分 泌信號肽直接結合在Stx2e蛋白質的氨基末端的情況、也包括通過其它肽結合的情況的概 念。此外，在編碼Stx2e蛋白質的DNA編碼包含A亞基以及B亞基兩者的Stx2e蛋白質時， 在使A亞基以及B亞基作為融合蛋白表達時，編碼Stx2e蛋白質的DNA只要與編碼所述分 泌信號肽的DNA連接即可，以使在融合蛋白質的氨基末端附加所述分泌信號肽，在使A亞基 以及B亞基各自表達時，編碼Stx2e蛋白質的DNA只要與編碼所述分泌信號肽的DNA連接 即可，以使在A亞基以及B亞基兩者的氨基末端附加所述分泌信號肽。分泌信號肽優選來源於屬於茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、菊 科(Asteraceae)的植物，進一步優選屬於菸草屬(Nicotiana)、擬南芥屬(Arabidopsis)、 萵苣屬(Lactuca)等的植物，更優選來源於菸草(Nicotiana tabacum)、擬南芥 (Arabidopsisthaliana) >(Lactuca sativa)等。此外，優選來源於菸草的0 -D葡聚糖外水解酶(0 -D葡聚糖外水解酶)、菸草的
738kDa 過氧化物酶(GenBank Accession D42064)。作為所述分泌信號肽，例如舉例有來源於菸草的0 -D葡聚糖外水解酶的、具有序 列編號10所表示的胺基酸序列的分泌信號肽。此外，編碼該分泌信號肽的DNA的鹼基序列 例如以序列編號11表示。編碼所述分泌信號肽的DNA也可以從各種植物探索、離析，也可以根據所述序列 編號11的鹼基序列製作探針，從各種植物的cDNA得到，也可以根據同一鹼基序列通過化學 合成或PCR等的手法得到。作為本發明的DNA構建物，優選舉例有由序列編號1的鹼基序列構成的DNA、由序 列編號11的鹼基序列構成的DNA以及由序列編號5 9的任一個鹼基序列構成的DNA連 接而成的DNA構建物。作為這樣的本發明的DNA構建物，舉例有如具有序列編號12的鹼基 序列的DNA構建物。還有，編碼所述Stx2e蛋白質的DNA優選與編碼內質網滯留信號肽或液泡運輸信 號肽的DNA連接，以便在Stx2e蛋白質的羧基末端附加內質網滯留信號肽或液泡運輸信號 肽。這裡，「附加」是既包括所述內質網滯留信號肽或液泡運輸信號肽直接結合在Stx2e蛋 白質的羧基末端的情況、也包括通過其它肽結合的情況的概念。此外，在編碼Stx2e蛋白質 的DNA編碼包含A亞基以及B亞基兩者的Stx2e蛋白質時，在使A亞基以及B亞基作為融 合蛋白表達時，編碼Stx2e蛋白質的DNA只要與編碼所述內質網滯留信號肽或液泡運輸信 號肽的DNA連接即可，以使在融合蛋白質的羧基末端附加所述分泌信號肽，在使A亞基以及 B亞基各自表達時，編碼Stx2e蛋白質的DNA只要與編碼所述內質網滯留信號肽或液泡運輸 信號肽的DNA連接即可，以使在A亞基以及B亞基的至少一個羧基末端上附加所述內質網 滯留信號肽或液泡運輸信號肽。作為內質網滯留信號肽，舉例有含有KDEL序列(序列編號13)、HDEL序列(序列 編號14)、KDEF序列(序列編號15)或HDEF序列(序列編號16)的內質網滯留信號肽。例 如，作為含有HDEL序列的內質網滯留信號肽優選使用序列編號17的胺基酸序列所表示的 內質網滯留信號肽等。還有，編碼該內質網滯留信號肽的DNA的鹼基序列如用序列編號18表不。作為液泡運輸信號肽，優選來源於屬於茄科(Solanaceae)、十字花科 (Brassicaceae)、菊科(Asteraceae)的植物，進一步優選屬於菸草屬(Nicotiana)、擬 南芥屬(Arabidopsis)、辣根屬(Armoracia)等的植物，更優選來源於菸草(Nicotiana tabacum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、辣根(Armoracia rusticana)等。此夕卜，優選來 源於甲殼質酶。來源於菸草甲殼質酶的液泡運輸信號肽的胺基酸序列以序列編號19表示。 此外，編碼來源於菸草甲殼質酶的液泡運輸信號肽的DNA的鹼基序列例如用序列編號20表
7J\ o此外，優選來源於辣根過氧化物酶Cla同工酶。來源於辣根過氧化物酶Cla同工 酶的液泡運輸信號肽的胺基酸序列用序列編號21表示。此外，編碼來源於辣根過氧化物酶 Cla同工酶的液泡運輸信號肽的DNA的鹼基序列例如用序列編號22表示。作為本發明的DNA構建物，優選舉例有由來源於植物的醇脫氫酶基因的5』 -非翻 譯區、以及編碼Stx2e蛋白質的DNA構成的DNA構建物，所述5』-非翻譯區由序列編號1的 鹼基序列構成的DNA、由序列編號11的鹼基序列構成的DNA以及由序列編號5 9的任一個鹼基序列構成的DNA、以及由序列編號18或序列編號20的鹼基序列構成的DNA所連接， 所述編碼Stx2e蛋白質的DNA在其氨基末端附加有來源於植物的分泌信號肽、在羧基末端 附加有內質網滯留信號肽或液泡運輸信號肽。作為附加有內質網滯留信號肽的本發明的 DNA構建物，例如舉例有具有序列編號23、75、77、78、86的任一個鹼基序列的DNA構建物。 作為附加有液泡運輸信號肽的本發明的DNA構建物，例如舉例有序列編號24表示的DNA構 建物。本發明的DNA構建物可以通過一般的基因工程學手法製作，也可以將含有來源 於植物的醇脫氫酶基因的5』 -非翻譯區、編碼來源於植物的分泌信號肽的DNA、以及編碼 Stx2e蛋白質的DNA、含有任意編碼內質網滯留信號肽或液泡運輸信號肽的DNA的DNA分別 用適當的限制酶切斷，用適當的連接酶連接來進行。本發明的重組載體，其特徵在於含有本發明的DNA構建物。本發明的重組載體只 要插入到載體即可，以使編碼在N末端附加有來源於植物的分泌信號肽的Stx2e蛋白質 的DNA能夠在導入載體的宿主細胞中表達。載體只要是在宿主細胞中能夠複製的載體則 無特別限制，例如舉例有質粒DNA、病毒DNA等。此外，載體優選含有耐藥基因等的選擇標 記。質粒DNA可以從大腸桿菌或土壤桿菌通過鹼提取法(Birnboim，H. C. &Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7:1513)或其變法等來調製。此外，作為市售的質粒，也可以使用如 pBI221、pBI121、pBIlOl、pIG121Hm 等。作為病毒 DNA 可以使用如 pTB2 (Donson etal.， 1991)等(參照 Donson J. , Kerney CM. , Hilf ME. , Dawson W0. Systemic expression of abacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad.Sci. (1991)88:7204-7208。)載體內使用的啟動子可以根據載體被導入的宿主細胞適當選擇。如，優選使用花 椰菜花葉病毒35S啟動子(Odell et al. ,1985 Nature 313 :810)、水稻的肌動蛋白啟動子 (Zhang etal.，1991 Plant Cell 3 :1115)、玉米泛素啟動子(Cornejo et al.，1993 Plant Mol. Biol. 23567)等。此外，載體內使用的終止子也可以同樣根據載體被導入的宿主細胞 適當選擇。如，優選使用胭脂鹼合成酶基因轉錄終止子、花椰菜花葉病毒35S終止子等。
本發明的重組載體如可以如下述所述地製作。首先，用適當的限制酶切斷本發明的DNA構建物或通過PCR附加限制酶位點，插入 到載體的限制酶位點或多克隆位點中。本發明的轉化體，其特徵在於，用本發明的重組載體轉化。用於轉化的宿主細胞可 以是真核細胞以及原核細胞的任一個。作為真核細胞，優選使用植物細胞，尤其優選使用屬於菊科(Asteraceae)、茄科、 十字花科、藜科的植物的細胞。進一步，優選使用屬於萵苣(Lactuca)屬的植物的細胞、尤 其是萵苣(Lactuca sativa)細胞。作為宿主細胞使用萵苣細胞時，載體可以使用花椰菜花 葉病毒35S RNA啟動子等。作為原核細胞，使用大腸桿菌(Escherichia coli)、根癌土壤桿菌 (Agrobacteriumtumefaciens)等。本發明的轉化體可以通過使用一般的基因工程學手法，將本發明的載體導入到宿 主細胞來製作。例如，可以使用利用土壤桿菌的導入方法(Hood，et al. ,1993,Transgenic, Res. 2 218, Hiei, et al.，1994 Plant J. 6 271)、電擊轉化法(Tada, et al.，1990，Theor.Appl. Genet，80 :475)、聚乙二醇法(Lazzeri, et al. , 1991, Theor. Appl. Genet,81 :437)、 基因槍法(Sanford, et al.，1987，J. Part. Sci. tech. 5 :27)、聚陽離子法(Ohtsuki)等的方法。將本發明的載體導入宿主細胞之後，可以根據選擇標記的表現型來篩選本發明的 轉化體。此外，可通過培養篩選的轉化體來生產所述Stx2e蛋白質。培養使用的培養基以 及條件可以根據轉化體的種類適當選擇。此外，當宿主細胞為植物細胞時，可以根據常法培養已篩選的植物細胞，由此使植 物細胞再生，可以在植物細胞內或植物細胞的細胞膜外使所述Stx2e蛋白質積蓄。例如，根 據植物細胞的種類而不同，如果是馬鈴薯的話，舉例有Visser等(Theor. Appl. Genet，78 594(1989))的方法，如果是菸草的話，舉例有Nagata與Takebe(Planta 99:12(1971))的方法。萵苣的話，可以在含有0. lmg/1的NAA(萘乙酸)、0.05mg/l的BA(苯甲基腺嘌呤) 以及0. 5g/l的聚乙烯基吡咯烷酮的MS培養基中使新枝(shoot)再生，可以通過將再生的 新枝在含有0. 5g/l的聚乙烯基吡咯烷酮的1/2MS培養基中培養來髮根。此外，本發明的種子可以從如上所述地再生的植物體中採取種子來得到。本發明 的種子通過用適當的方法播種、栽培，可以作為生產Stx2e蛋白質的植物體，這樣的植物體 也包含在本發明的轉化體。 本發明的豬浮腫病疫苗，其特徵在於含有本發明的轉化體。本發明的豬浮腫病疫 苗可以包含含有Stx2e蛋白質的本發明的全部轉化體，也可以包含一部分。此外，可以將轉 化體直接使用，也可以乾燥、粉碎等來使用。此外，本發明的豬浮腫病疫苗中也可以混合提 高Stx2e蛋白質的免疫原性的佐劑。通常，考慮到安全性而使用氫氧化鋁作為佐劑。另一 方面，Stx2e蛋白質的B亞基本身顯示出佐劑活性，因此當本發明的DNA構建物含有編碼B 亞基的DNA時，即使進一步混合佐劑，也能得到較高的免疫原性。本發明的豬浮腫病的防除方法，其特徵在於，將本發明的豬浮腫病疫苗向豬投與。 用本發明的豬浮腫病疫苗進行的免疫優選對浮腫病的發生率較高的仔豬進行。作為免疫方 法，舉例有將本發明的豬浮腫病疫苗投與母豬，將母豬產生的抗體通過乳汁授給仔豬的方 法、將本發明的豬浮腫病疫苗投與仔豬，使仔豬直接免疫的方法等。作為投與本發明的豬浮腫病疫苗的方法，舉例有在豬飼料中混合本發明的豬浮腫 病疫苗而給豬的方法、給豬鼻腔投與的方法等。此時的投與量，以Stx2e蛋白質的質量，優 選每天4mg以上，進一步優選16mg以上。豬浮腫病疫苗優選以一定的間隔投與多次。例如， 舉例有每隔4 7天總計投與2 3次的方法。實施例(1) GFP表達載體的構建為了對萵苣細胞的蛋白質的定位控制進行研究，將含有編碼附加有各信號肽的綠 色螢光蛋白質(GFP)的DNA的表達載體如下地製作(圖1)。以ADH_221(Sato et. Al.，2004)為模板，通過使用了 ADH Xbal-F引物(序列編號 25)以及ADH Nsil-R引物(序列編號26)的PCR來擴增菸草醇脫氫酶基因的5』 -非翻譯 區(NtADH 5，UTR、序列編號1)。以菸草基因組DNA為模板，使用0D NsiI_F引物(序列編 號27)以及0D EcoRI-R引物(序列編號28)來擴增編碼0 _D葡聚糖外水解酶(GenBank
10ACCESSION AB017502)的信號肽(序列編號11)的DNA區域。用Nsil (T0Y0B0公司製造)處 理已得到的NtADH 5，UTR以及信號肽的各DNA片斷，使用高效連接試劑盒(ligation high) (T0Y0B0公司)連接之後，使末端平滑化，在pBluescrip II SK(Stratagene公司製造)的 EcoRV間隙中克隆(質粒1)。用Nsil處理質粒1，用T4DNA聚合酶(T0Y0B0公司製造)將末端平滑化之後進行自 身連接，融合為NtADH的起始密碼子(atg)與3-D葡聚糖外水解酶的起始密碼子一致(質 粒2)。通過EcoRI位點將編碼在C末端具有液泡輸送信號(序列編號19)的GFP(pSGFP5T， Di Sansebastiano et al.，1998)的 DNA 插入到質粒 2 中(液泡型 GFP)。以pSGFP5T為模板，使用GFP-F引物(序列編號29)以及GFP-R引物(序列編號 30)進行PCR。將得到的DNA片斷的末端平滑化之後，在pBluescript II SK的EcoRV間隙 克隆(質粒3)。使用EcoRI和Xhol從質粒3切出GFP片斷，插入到質粒2的EcoRI_XhoI 間隙中(質外體型GFP)。用Nsil和Xhol從質粒3切出GFP片斷，插入到質粒1的Nsil-EcoRI間隙中(細 胞質型GFP)。以pSGFP5為模板，使用GFP-F引物以及GFP HDEL-R引物(序列編號31)進行PCR。 將得到的DNA片斷的末端平滑化之後，在pBluescript II SK的EcoRV間隙克隆(質粒4)。 使用EcoRI和Xhol從質粒4切出GFP片斷，插入到質粒2的EcoRI-XhoI間隙(內質網型 GFP)。以萵苣葉cDNA為模板，使用TP Nsil-F引物(序列編號32)以及TP EcoRI-R 引物(序列編號33)通過PCR來擴增編碼來源於萵苣Rbcs(rubisco small subunit) (GenBankACCESSION D14001)的葉綠體運輸信號肽(轉運肽、T. P.序列編號45)的DNA片 斷。用Nsil和EcoRI處理已得到的片斷，連接到質粒1的Nsil-EcoRI間隙(質粒5)。用 Nsil處理質粒5，用T4DNA聚合酶(T0Y0B0公司製造)將末端平滑化之後進行自身連接，融 合為使NtADH的起始密碼子與Rbcs的起始密碼子一致(質粒6)。使用EcoRI和Xhol從質 粒3切出GFP片斷，插入到質粒6的EcoRI-XhoI間隙(葉綠體型GFP)。還有，在構建這些GFP表達載體時，可以參考下述文獻。Di Sansebastiano et al. , Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolarcompartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998)15,449-457Satoh et al. , The 5' -untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase genefunctions as an effective translational enhance in plant J. Biosci. Bioeng. (2004)98，1-8將上述各定位型GFP插入到如下進行的植物細胞中的瞬時表達用載體、 PBI221 (Clontech公司)的多克隆位點(MCS)。為了在MCS導入Sail、Kpnl以及Smal位點，將SalKpnSma-F(序列編號34)和 SalKpnSma-R(序列編號35)退火之後，使用T4多聚核苷酸激酶(T4PNK) (TaKaRa公司)磷 酸化，插入到PBI221的SacI間隙(質粒7)。使用Xbal和Kpnl將各定位型GFP插入到質 粒7中，配置在花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(35S pro.)和胭脂鹼合成酶基因轉錄終止 子(N0S-T)之間，製作GFP表達載體。
(2) Stx2eB表達載體的構建如下製作附加有各信號肽的、含有編碼Stx2e蛋白質的B亞基(Stx2eB)的DNA (序 列編號5)的本發明的DNA構建物。使用Kozak-Stx2eb-F引物(序列編號36)和stx2eb_R引物(序列編號37)進行 PCR，擴增編碼Stx2eB的成熟區域(除了往周質的分泌信號肽，Alal9 Asn87)的DNA片 斷。在pBluescript II SK的EcoRV間隙克隆所得到的DNA片斷。用Hindlll切斷已得到 的質粒，用T4DNA聚合酶處理之後進行自身連接，將Hindlll位點改換為Nhel位點(質粒 8)。用Xbal和Kpnl從質粒8切出Kozak_Stx2eB片斷，插入到質粒7的Xbal-Kpnl間 隙中，製作Kozak連接細胞質型Stx2eB表達載體(Kozak-Cytosol-Stx2eB)(質粒9)。使用ADH Xbal-F和ADH BamHI-R引物(序列編號38)擴增NtDH 5，UTR片斷。用 Xbal和BamHI處理得到的DNA片斷，插入到質粒9的XbaI_BamHI間隙，製作NtADH5，-UTR 連接細胞質型Stx2eB表達載體(ADH-Cytosol_Stx2eB)(質粒10)。為了擴增分泌信號肽，以質粒2為模板，使用PD-Kozak-F引物(序列編號39)和 3 DBamHI-R引物(序列編號40)進行PCR。用Xbal和BamHI處理得到的DNA片斷，插入到 質粒 9 的 Xbal-BamHI 間隙(質粒 11) (Kozak-Apoplast_Stx2eB)。為了附加內質網殘留信號，使HDEL-F引物(序列編號41)和HDEL-R引物(序列 編號42)退火，用T4 PNK磷酸化，插入到用鹼性磷酸酶(AP) (TaKaRa公司)脫磷酸化處理 的質粒11的Bglll間隙，製作Kozak連接內質網型Stx2eB表達載體(Kozak_ER-Stx2eB) (質粒12)。為了製作NtADH 5，UTR和分泌信號肽融合的DNA片斷，以質粒2為模板，使 用ADHXbal-F引物和3D BamHI-R引物進行PCR。用Xbal和BamHI處理得到的DNA片 斷，插入到質粒9的Xbal-BamHI間隙，製作NtADH 5，連接質外體型Stx2eB表達載體 (ADH-Apoplast-Stx2eB)(質粒 I3)。為了附加內質網殘留信號，使HDEL-F引物和HDEL-R引物退火，用T4PNK磷酸化， 插入到用AP脫磷酸化處理的質粒13的Bglll間隙，製作NtADH 5，_UTR連接內質網型 Stx2eB 表達載體(ADH-ER-Stx2eB)(質粒 14)。為了附加液泡輸送信號，使VSD-F引物(序列編號43)和VSD-R引物(序列編 號44)退火，用T4PNK磷酸化，插入到用AP脫磷酸化處理的質粒13的Bglll間隙，製作 NtADH5，-UTR 連接液泡型 Stx2eB 表達載體(ADH-Vacuole_Stx2eB)(質粒 15)。為了附加葉綠體運輸信號肽(序列編號45)，以質粒6為模板，使用ADH Xbal-F 引物和TP BamHI-R引物(序列編號46)進行PCR。用Xbal和BamHI處理得到的DNA片 斷，插入到質粒9的Xbal-BamHI間隙，製作NtADH 5，-UTR連接葉綠體型Stx2eB表達載體 (ADH-Chloroplast Stx2eB)(質粒 I6)。此外，作為用於檢測Stx2eB的肽標籤，融合了 HA標籤。為了附加HA標籤，使HA_F 引物(序列編號47)和HA-R引物(序列編號48)退火，用T4PNK磷酸化。將得到的磷酸化 HA片斷插入到質粒9、10、12、13、14、15 以及 16 的BamHI 間隙，製作Kozak-Cytosol_Stx2eB、 ADH-Cytosol-Stx2eB、Kozak_ER_Stx2eB、ADH_Apoplast_Stx2eB、ADH_ER_Stx2eB、 ADH-Vacuole-Stx2eB、ADH-Chloroplast_Stx2eB 的各 Stx2eB 表達載體，用於以下的表達試驗(圖2)。(3)密碼子改變Stx2eB表達載體的構建將編碼序列編號5所示的Stx2eB的DNA的鹼基序列的密碼子改變，通過以下方法 製作附加有NtADH 5，UTR的、內質網型密碼子改變Stx2eB。(a)密碼子改變Stx2eB的設計作為密碼子改變Stx2eB，設計了 4種，1)根據Kang et al. (2004)的方法的序列、 2)選擇了在萵苣中使用頻率高的密碼子的序列、3)在GC含量高的密碼子中，選擇了在萵苣 中使用頻率高的密碼子的序列、4)選擇了在看家基因(肌動蛋白基因、微管蛋白基因) 中使用頻率高的密碼子的序列。1)根據Kang et al. (2004)的方法的序列以在該文獻中顯示的改變前後的LTB基因序列和菸草的密碼子使用頻率表為 基礎，製作密碼子的改變流程圖，以該流程圖以及萵苣的密碼子使用頻率表為基礎，進行 Stx2eB的密碼子改變。將製作的密碼子改變Stx2eB作為mStX2eBl (序列編號6)。萵苣的 密碼子使用頻率表利用了 芒DNA研究所的資料庫(http://WWW. kazusa. or. jp/codon/ index, html)上的萵苣的密碼子使用(codon usage)(以下相同)。2)選擇了在萵苣中使用頻率高的密碼子的序列以萵苣的密碼子使用頻率表為基礎，僅使用使用頻率最高的密碼子，進行密碼子 改變。例如，Ala的密碼子中，使用頻率最高的密碼子是GCA，因此Stx2eB中的Ala的密碼 子全部統一為GCA。將製作的密碼子改變Stx2eB作為mStX2eB2 (序列編號7)。3)在GC含量高的密碼子中，選擇了在萵苣中使用頻率高的密碼子的序列以萵苣的密碼子使用頻率表為基礎，選擇GC含量多、且使用頻率高的密碼子，進 行密碼子改變。例如，Ala的密碼子中，GC含量最高的密碼子是GCC和GCG，而且使用頻率 高的密碼子是GCC，因此Stx2eB中的Ala全部改換為GCC。將製作的密碼子改變Stx2eB作 為mStx2eB3(序列編號8)。4)選擇了在看家基因(肌動蛋白基因、微管蛋白基因)中使用頻率高的密碼 子的序列選擇在萵苣的看家基因中高頻率使用的密碼子，進行密碼子改變。作為看家基因， 選擇了肌動蛋白基因、微管蛋白1，2，3。兩個基因的鹼基序列使用了 NCBI(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/)。在表1以及表2總結了在兩個基因中使用的密碼子以及密碼子使用 頻率。其中，選擇使用頻率最高的密碼子來進行密碼子改變。將製作的密碼子改變Stx2eB 作為mStx2eB4 (序列編號9)。[表1] 將設計好的mStx2eBl-4 的鹼基序列用 CLUSTALW(http://align, genome, jb/)比
較(圖3)。在表3顯示密碼子改變前後的Stx2eB的序列XXG/C(X為任意鹼基)比和GC比。
mStx2eB2以外的XXG/C比高於Stx2eB，在mStx2eB3中為100 %。GC比也同樣地，在mStx2eB2
以外高於Stx2eB，最高的mStx2eB3為61. 4% [表 3] (b)密碼子改變Stx2eB的製作以mStx2eBl-4的鹼基序列為基礎，分別製作了具有6種鹼基序列的引物。1)根據Kang et al. (2004)的方法的序列A 序列編號49B 序列編號50C:序列編號51
D 序列編號52E 序列編號53F:序列編號54 2)選擇了在萵苣中使用頻率高的密碼子的序列A 序列編號55B:序列編號56C:序列編號57D 序列編號58E 序列編號59F:序列編號603)在GC含量高的密碼子中，選擇了在萵苣中使用頻率高的密碼子的序列A 序列編號61B:序列編號62C:序列編號63D 序列編號64E 序列編號65F:序列編號664)選擇了在看家基因中使用頻率高的密碼子的序列A 序列編號67B:序列編號68C:序列編號69D 序列編號70E 序列編號71F:序列編號72使用上述合成的低聚物，根據Kang et al. (2004)的方法用以下的條件進行第1 次PCR，合成4種密碼子改變Stx2eB。S卩，以引物A與B、C與D、E與F的組合進行PCR，分 別合成87bp (A+B)、78bp (C+D)、69bp (E+F)的基因片斷。然後，以A+B與C+D的組合進行第 2次PCR，合成153bp (A+B+C+D)的基因片斷。最後，以A+B+C+D與E+F的組合進行第3次 PCR，最終合成210bp的基因(參考圖4)。反應條件是，添加IOpmol寡核苷酸、0. 2mM dNTP、 Pfu DNA聚合酶緩衝液、0. 3U DNA聚合酶，使最終容量為25 μ 1，在94°C、5分鐘加熱之後，將 94°C、1分鐘；56°C或60°C、1分鐘；72°C、1分鐘的加熱處理進行25個或30個循環，最後在 72°C下加熱5分鐘。在第2次PCR、第3次PCR中，使用第1次PCR、第2次PCR後的反應液 1 μ 1作為模板。在第1次PCR和第2次PCR擴增目的DNA，但在第3次PCR，目的大小的DNA 沒有擴增。但是，將第3次PCR產物作為模板進行利用Ex Taq的PCR時，在210bp附近確 認擴增產物(圖5)。將擴增產物TA克隆之後，用Direct PCR確認有無插入(圖6)，關於 確認插入，通過測序確認序列。結果，確認了得到作為目的的mStx2eBl-4。(c)密碼子改變Stx2eB表達載體的構建為了評價密碼子改變Stx2eBl_4的翻譯量，構建了瞬時表達載體。用限制酶切 斷附加了上述花椰菜花葉病毒35S啟動子、來源於菸草的醇脫氫酶基因的5』非翻譯區、信號肽、內質網殘留信號以及HA標籤的載體pBI221後，用DNA連接試劑盒(Mighty Mix) (TaKaRa)將目的DNA片斷連接，製作了附加有NtADH5，UTR的、內質網型密碼子改變Stx2eB 表達載體(ADH-ER-mStx2eBl-4)。(4) Stx2eA表達載體的構建按照以下方法製作編碼附加有內質網運輸信號肽的、Stx2e蛋白質的A亞基的成 熟區域(除了往周質的分泌信號肽區域，Gln23 Glu319) (Stx2eA)的DNA(序列編號4)。使用Stx2eA BamHI-F引物(序列編號73)和Stx2eA BglII-R引物(序列編號74) 進行PCR。將得到的DNA片斷用BamHI和Bglll處理後，分別插入到上述Kozak_ER-Stx2eB 以及 ADH-ER-Stx2eB 的表達載體 BamHI-Bglll 間隙中，製作了 Kozak_ER-Stx2eA 或 ADH-ER-Stx2eA (圖 7)。(5)使用萵苣原生質體的瞬時表達實驗用手術刀以0. 5cm四角形程度切碎約lg的種植的萵苣(Lactuca sativa) (green wave)的葉子，製作葉盤(leaf disc)。將葉盤浸漬在500mM甘露醇中，振蕩1小時。將葉盤浸 漬在50ml的原生質體化酶溶液(1.0%纖維素RS( ^ 」卜義本社)、0. 25%離析酶R-10( ^ 夕卜 >本社)、400mM甘露醇、8mM CaCl2和5mM Mes_K0H，pH5. 6)，室溫下振蕩2小時。將原 生質體懸濁液通過lOOiim以及40iim的網眼，除去了葉盤。將原生質體懸濁液用60g離 心5分鐘，使原生質體沉澱。將原生質體重懸濁在含有167mM甘露醇以及133mM CaCl2的 水溶液中，用40g離心5分鐘。將原生質體重懸濁在含有333mM甘露醇以及66. 7mM CaCl2 的水溶液中，用40g離心5分鐘。將原生質體懸濁在W5溶液(150mMNaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mM Mes-KOH、pH5. 6)，在冰上靜置1小時。將原生質體懸濁液用40g離心5分鐘，懸 濁在MaMg溶液(400mM甘露醇、15mM MgCl2和4mMMes_K0H，pH5. 6)，以使原生質體濃度成為 2X106 個/ml。將上述製作的GFP報告表達載體、Stx2eB表達載體、改變的Stx2eB表達載體以及 Stx2eA表達載體分別與120 ill的原生質體懸濁液之後，加入140 yl的PEG溶液(400mM甘 露醇、lOOmM Ca(N03)2和40% PEG)平穩地混合，培養7分鐘。耗時約20分鐘將lmlW5溶液 添加到原生質體懸濁液。將以4 1的比例混合了 400mM甘露醇和W5溶液的溶液1ml添 加到通過離心沉澱的原生質體中。將含有蔗糖、400mM甘露醇和0. 3mM羧苄青黴素的LS 培養基1ml添加到通過離心沉澱的原生質體中，在暗處25°C下培養24小時。(6) Western 分析通過離心回收的原生質體中加入30iU的SDS-樣品緩衝液(4% (w/v) SDS.20% (w/v)甘油、0.05% (w/v)溴酚藍、300mM 巰基乙醇、125mM Tris_HCl，pH6. 8)，95°C下熱 變性2分鐘，作為試樣。使用15%丙烯醯胺凝膠分離蛋白質之後，使用電子傳遞裝置在PVDF 膜(Hybond-P ；Amersham 公司)上轉印蛋白質。用抗 HA 抗體(No. 11867423001，Roche)，檢 測 Stx2eB 以及 Stx2eA。(a)GFP表達載體的表達將(1)中製作的各GFP表達載體導入到萵苣的原生質體中，瞬時表達報告基因。為 了分析GFP報告基因的表達量，使用共聚焦雷射顯微鏡進行GFP螢光觀察(圖8)。表達細胞質型GFP時，在被認為是葉綠體周邊的細胞質的區域和核內檢測出螢光 信號。還有，報告稱，即使沒有核運輸信號肽，GFP等低分子量的蛋白質也能夠通過核膜孔。
然後，對輸送信號到膜泡運輸路經進行研究。表達質外體型、內質網型、液泡型的 任意型的GFP時，在原生質體培養初期，在認為是內質網的區域確認了螢光。隨著原生質 體的培養時間，質外體型中變得看不到螢光信號(認為分泌到細胞外)，在液泡型，在佔據 大部分細胞體積的大液泡檢測出信號。另一方面，在內質網型中，內質網中螢光呈停留的狀 態。此外，還研究了葉綠體型運輸信號肽。表達葉綠體型GFP時，在發出紅色自體螢光 的葉綠體區域檢測出綠色信號。從以上結果可知，在萵苣細胞中，通過附加信號肽，可以控制重組蛋白質的定位。(b)在Stx2eB生產中的定位化信號以及翻譯增強子的效果將(2)中製作的Stx2eB表達載體導入到萵苣的原生質體中，瞬時表達Stx2eB，通 過使用了抗HA抗體的Western分析評價Stx2eB積蓄量。結果示於圖9。使用Kozak序列表達細胞質型Stx2eB時，完全沒有檢測出Stx2eB，但表達內質 網型Stx2eB時，檢測出S. P.沒有被切斷的Stx2eB前驅體(約12kDa、pre-mature)以及 Stx2eB(約 8kDa>mature)。使用NtADH5，UTR表達細胞質型Stx2eB時，完全沒有檢測出Stx2eB，但表達內質 網型Stx2eB以及液泡型Stx2eB時，檢測出S. P.沒有被切斷的Stx2eB前驅體以及Stx2eB。 此外，表達質外體型Stx2eB時，檢測出Stx2eB。此外，表達葉綠體型Stx2eB時，檢測出 Stx2eB。從觀察Kozak-ER(內質網型)和NtADH_ER(內質網型)的泳道的條帶，可判斷，通 過使用NtADH5，UTR, Stx2eB的表達量與使用了 Kozak序列時相比極大增高。此外，判斷，通過向膜泡運輸路經運輸Stx2eB，提高了在植物細胞中的Stx2eB的 積蓄量。還有，由膜泡輸送經路輸送的3個區域(內質網、質外體、液泡)不同引起的Stx2eB 的積蓄量之差較小。(c)Stx2eB的密碼子改變對影響表達的效果將各密碼子改變Stx2eB表達載體導入到萵苣的原生質體中，瞬時表達密碼子改 變Stx2eB，通過使用了抗HA抗體的Western分析評價Stx2eB積蓄量。結果示於圖10以及 11。在泳道0 (ADH-ER-Stx2eB)、泳道 1 (ADH_ER-mStx2eB 1)、泳道 2 (ADH-ER-mStx2eB2)、泳道 3 (ADH_ER-mStx2eB3)、泳道 4 (ADH_ER-mStx2eB4)，都檢測出 S. P.沒有被切斷的Stx2eB前驅體(約12kDa、預成熟(pre-mature))以及Stx2eB (約8kDa、 成熟(mature))，在泳道2檢測量極微。由此判斷，在使用了分別具有序列編號75、77、78的鹼基序列的 ADH-ER-mStx2eBl、ADH-ER-mStx2eB3、ADH-ER-mStx2eB4 時，Stx2eB 蛋白質的積蓄量特別增大。(d)在Stx2eA生產中的翻譯增強子的效果將各Stx2eA表達載體導入到萵苣的原生質體中，瞬時表達Stx2eA，通過使用了抗 HA抗體的Western分析評價Stx2eA積蓄量。結果示於圖12。表達NtADH-ER_Stx2eA(內質網型)時，分別在約34kDa、約38kDa的位置檢測出2 條帶。另一方面，表達KoZak-ER-StX2eA時，Stx2eA的表達量在檢測界限以下。
由此判斷，通過使用NtADH5，UTR, Stx2eA的表達量與使用了 Kozak序列時相比極 大增高。(8)Stx2eB有效生產量的設定以及性能評價(a) Stx2eB-GST融合蛋白質的精製為了製作Stx2eB亞基和穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)的融合蛋白質，在大腸桿菌蛋 白質表達用載體PGEX-6P-1的GST3』側合併框架，亞克隆Stx2eB之後，轉化到大腸桿菌。通 過常用方法添加異丙基0-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，誘導重組(r) Stx2eB-GST融 合蛋白質的表達，使用穀胱甘肽瓊脂糖4B柱(column)如下進行精製。在大腸桿菌內表達Stx2eB_GST融合蛋白質之後，在水溶性的緩衝液懸濁菌體，進 行超聲波處理之後，由於在上清中該融合蛋白質存在較少，因此可知該融合蛋白質存在於 不溶性成分中。所以，用8M尿素使該融合蛋白質可溶化，用柱精製之後，進行重摺疊。(b)蛋白質的小鼠經鼻投與實驗(抗體效價的確認)對溶出的Stx2eB_GST融合蛋白質，使用對Stx2e的抗體(抗VT2抗體)進行蛋白 質印跡分析(Western blotting)。結果，檢測出與Stx2eB_GST融合蛋白質以及Stx2eB的 分子量一致的特異性的2個條帶，確認了該融合蛋白質保持著抗原性(圖14)。接著，每隔一周3次給小鼠經鼻接種已精製的Stx2eB_GST融合蛋白質10、20、 50ugo在第0、1、2、3周進行採血，以該融合蛋白質為抗原進行ELISA，測定IgG抗體效價。 結果，可知，該融合蛋白質50 y g投與區在投與後第1周可見到抗體效價的上升，但第2周 即使在10、20y g投與區，也確認了抗體效價的上升，經過第3周抗體效價經時地上升(圖 15)。(9)Stx2eB 的生產(a) Stx2eB表達雙元載體的構建為使用植物的穩定轉化體進行Stx2eB的生產，將ADH-ER-Stx2eB在轉化用載體進 行了亞克隆。即，使用Xbal以及SacI將ADH_ER_Stx2eB插入到pBI121 (Clontech公司)， 配置在花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(35S pro.)和胭脂鹼基因轉錄終止子(N0S-T)之 間，製作了 Stx2eB表達雙元載體。(b)轉化土壤桿菌的製作Agrobacterium tumefacience EHA105(Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS, HoekemaA(1993)New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res. 2 208-218)的單菌落接種到5ml的YEB培養基(細菌蛋白腖5g/l、牛肉 浸膏5g/l、酵母提取物lg/1、蔗糖5g/l、MaS04 7H20 0. 5g/l)，在28°C下振蕩培養1晚。 將該培養液接種到500ml的YEP培養基，在28°C下振蕩培養至600nm中的濁度成為0. 5為 止。通過離心分離(5000rpm、10分鐘、4°C;BECKMAN JLA-10，500轉頭)收集培養液，丟棄上 清，為清洗菌體加入500ml的滅菌水令其懸濁，再次通過離心分離(5000rpm、10分鐘、4°C ； BECKMAN JLA-10，500轉頭)集菌，丟棄上清。將該操作重複2次之後，在沉澱中加入20ml 的冷卻的滅菌10%甘油進行懸濁。移到NALGENE管，通過離心分離(5000rpm、10分鐘、4°C； BECKMAN JLA-10，500轉頭)集菌，丟棄上清。在沉澱中加入3ml的冷卻的滅菌10%甘油進 行懸濁，在每個1. 5ml微小離心管分注40 iU，用液氮凍結後，保存於-80°C。在冰中將感受態細胞解凍，加入1 2 ill的上述雙元載體溶液，移到冰冷卻過的2mm小試管。通過電轉化儀(BIO RAD、Gene Pulser)給予電脈衝(2. 5KV、25 ii F、400 Q )，導 入載體。加入1ml的S0C培養基，28°C下振蕩培養1晚後，短暫離心，除去大部分上清，得到 菌體，在剩餘的培養基中懸濁菌體，鋪在含有適當的抗生素的LB瓊脂培養基，30°C下培養2 晚。(c)轉化菸草的製作菸草BY2 培養細胞的轉化按照 An (An G (1985) High efficiency transformation of culturedtobacco cells. Plant Physiol. 79 :568_570)的方法進行。將按照上述(b) 的方法得到的轉化土壤桿菌的菌體在含有卡那黴素100mg/l的5ml的LB培養基中28V、 培養2晚的土壤桿菌培養液100 u 1和培養第4天的菸草BY2培養細胞懸濁液5 10ml 放入皮氏培養皿中充分混勻，25°C、2晚、暗處靜置，共存培養。為了除去土壤桿菌，將皮 氏培養皿中的培養液移到15ml離心管中離心(1000rpm、5分鐘、4°C ；BECKMAN GS-6KR centrifuge)，除去上清。加入新的改變LS培養基，離心分離(1000rpm、5分鐘、4°C ;BECKMAN GS-eKRcentrifuge)，清洗細胞。重複該操作4次後，除去土壤桿菌後，將菸草BY2培養細胞 鋪在加入了卡那黴素100mg/l的改變LS瓊脂培養基，25°C、暗黑下靜置培養。約2_3周後 將愈傷組織(callus)化的細胞移植到新的培養板中，篩選增殖的克隆。移到加入了卡那黴 素100mg/l的改變LS培養基30ml中，進行繼代培養。(d) Western 分析通過和上述一樣使用抗HA抗體的Western分析，評價上述製作的轉化菸草BY2培 養細胞中的Stx2eB的積蓄量。結果示於圖16。圖16的各泳道的數字各自表示獨立的系 統。「空載體」表示僅導入不含「ADH-ER-Stx2eB」的載體pBI121的試樣。(10)Stx2eB 的生產(a)密碼子改變Stx2eB的設計作為密碼子改變Stx2eB，設計了在GC含量高的密碼子中選擇在萵苣中使用頻率 低的密碼子的序列。將製作的密碼子改變Stx2eB作為mStX2eB5 (序列編號79)。用CLUSTALW(http://align, genome, jp/)比較已設計好的 mStx2eB5 的鹼基序列 (圖17)。密碼子改變前後的Stx2eB的序列XXG/C(X為任意鹼基)比為100%，GC比為 62. 4%。(b)密碼子改變Stx2eB的製作以設計好的mStx2eB5的鹼基序列為基礎，製作了具有6種鹼基序列的引物。使用 這些引物，用與上述(3)中的密碼子改變Stx2eB的製作相同的方法得到mStx2eB5。引物A 序列編號80B 序列編號81C 序列編號82D 序列編號83E 序列編號84F 序列編號85(c)密碼子改變Stx2eB表達載體的構建為使用植物的穩定轉化體進行密碼子改變Stx2eB的生產，使用上述(3)製作的
20mStx2eBl 4 以及(b)製作的 mStx2eB5,將 ADH-ER-mStx2eBl_5 (序列編號 75 78,86) 在轉化用載體進行了亞克隆。即，分別使用Xbal以及SacI將ADH-ER-mStX2eBl-5插入到 PBI121 (Clontech公司)，配置在花椰菜花葉病毒35S RNA啟動子(35S pro.)和胭脂鹼基 因轉錄終止子(N0S-T)之間，製作了 mStx2eBl-5表達雙元載體。(d)轉化土壤桿菌的製作將(c)中製作的mStx2eBl-5表達雙元載體，用上述(9) (b)所示的方法相同地導 入於根癌土壤桿菌EHA105，得到轉化土壤桿菌。(e)轉化菸草的製作使用(b)中得到的轉化土壤桿菌，用上述(9)(c)所示的方法相同地，將 mStx2eBl-5表達雙元載體分別導入菸草BY2培養細胞，製作轉化菸草。(d) Western 分析通過和上述一樣使用抗HA抗體的Western分析，評價上述製作的轉化菸草BY2培 養細胞中的Stx2eB蛋白質的積蓄量。結果示於圖18以及19。圖18中，一併顯示mRNA水 平的測定結果。如圖18 所示，在泳道 0 (ADH-ER_Stx2eB)、泳道 1 (ADH_ER-mStx2eBl)、泳 道 2 (ADH-ER-mStx2eB2)、泳道 3 (ADH_ER-mStx2eB3)、泳道 4 (ADH_ER-mStx2eB4)、泳道 5 (ADH-ER-mStx2eB5)，都檢測出 S. P.沒有被切斷的 Stx2eB 前驅體(約 12kDa、pre_mature) 以及Stx2eB (約8kDa、mature)，但在泳道2未檢測出。在圖19中，密碼子1 5分別表示mStx2eBl-5。此外，各泳道的數字分別表示獨 立的系統。在mStx2eBl、mStx2eB3、mStx2eB4、mStx2eB5，在幾個系統中檢測出蛋白質，但在 mStx2eB2的所有的系統中都未檢測出蛋白質。在檢測出蛋白質的系統中比較其檢測量的 話，尤其在mStx2eB3以及mStx2eB5較多。即，可知，不管在萵苣中的使用頻率如何，通過設 計GC含量高的密碼子，翻譯量增大。(11)豬浮腫病疫苗投與試驗(a)豬浮腫病疫苗的製造將在上述(8) (a)中精製的Stx2eB_GST融合蛋白質以8mg/ml的濃度在PBS懸濁， 作為豬浮腫病疫苗，(b)浮腫病菌膠囊的製作[菌種]來源於豬的產vero細胞毒素大腸桿菌(VTEC)No. 1362-1 (來源於40天死亡的豬)血液型0139、fedA,+毒素:Stx2e, + ；ST, + ；LT,-[製作]將上述No. 1362-1菌株在TS肉湯中37°C培養4小時。培養後，進行離心分離，將 沉澱裝入脂溶性膠囊中。(c)疫苗及浮腫病菌的投與將養豬場中飼養的健康的哺乳期仔豬從每3頭母豬處各選6頭，合計選擇18頭， 如表4所示地分為5組。此時，分組時令來自不同母豬的仔豬包含在各組內，且雌雄都包含 在各組內。2 4組的仔豬中，以6、12、18天齡，將表4所示的規定量(每次)的豬浮腫病疫苗用吸液管鼻腔投與，在21天大為止在養豬場中和母豬一起進行飼養。1、5組的仔豬中 用同樣的方法鼻腔投與PBSO. 5ml。仔豬成為21天大時，將仔豬從母豬分離，每組收容在用 保溫燈進行溫度管理的水泥地板制、鋪設木屑的仔豬房中飼養。飼料使用SDSNo. 1(日本配 合飼養株式會社製造)，使豬自由攝取飼料及水。還有，在飼養期間中，記錄了飼料攝取量 (質量)以及體重。從收容經過4天後，向1 4組的仔豬1天1次、3天(25 27天大之 間)強制經口投與浮腫腫病菌膠囊。將生理鹽水放入腸溶性膠囊中向5組強制投與。[表 4] 從強制投與浮腫病菌的第0天開始到第11天為止每天進行臨床觀察。對作為浮 腫病的臨床症狀已知的、眼周圍浮腫、神經症狀、運動機能、姿勢、糞便性狀、食慾、呼吸狀態 的項目進行觀察，根據以下基準，臨床症狀評分。眼周圍浮腫(0 無，1 輕度，2 中度，3 重度)神經症狀(0 無，1 輕度，2 中度，3 重度)運動機能(0 正常，1 減退，2 消失)姿勢(0 正常，1 (犬坐姿)，2 俯臥 橫臥)糞便性狀(0 正常，1 軟便，2 泥狀便，3 水樣 粘血便)食慾(0 正常，1 稍不振，2 不振，3 不食)呼吸狀態(0 正常，1 稍快，2 快)此外，在強制投與浮腫病菌的第0、3、7以及第11天採取糞便，在強制投與浮腫病 菌的第0及第11天採取血液。(d)試驗結果(i)抗體效價的測定用ELISA測定在強制投與浮腫病菌的第0天採取的糞便中的Stx特異性IgA的抗 體效價。還有，糞便用9倍量的PBS稀釋後，懸濁、離心分離，回收上清，作為測定試樣。結 果示於圖20。此外，用ELISA測定在強制投與浮腫病菌的第0天採取的血液中的Stx特異 性IgG的抗體效價。結果示於圖21。抗體效價的個體差大，在組之間沒有顯著差異，但在投 與了浮腫病疫苗的組中可見到顯示高值的個體。(ii)浮腫病菌的檢測對在強制投與浮腫病菌的第3天採取的糞便中的浮腫病菌基因進行定量，求出浮腫病菌數。即，用QUICK GENE(富士 7 O ^ )提取糞便中的DNA，使用實時定量PCR(根據 Tsukahara et al. (2007))對浮腫病菌基因定量，求出浮腫病菌數。結果示於圖22。對投 與了浮腫病菌的1 4組的個體，確認感染了浮腫病菌。(iii)飼料需求率的算出從飼料攝取量以及體重的測定結果求出強制投與浮腫病菌前4 1天 (d-4 -1)、強制投與浮腫病菌的第0 3天(d0 3)、4 7天(d4 7)、8 11天(d8 11)的飼料需求率。此外，求出上述整個期間(d-4 11)的飼料需求率。還有，飼料需求率 用一定期間中增加1kg所需的飼料攝取量表示。飼料需求率=飼料攝取量/所增體重將整個期間的飼料需求率示於圖23、將飼料需求率的推移示於圖24。整個期間的 飼料需求率是，沒有投與浮腫病疫苗而感染了浮腫病菌的1組最大，以4mg/頭投與了浮腫 病疫苗的3組最小。此外，1組在投與浮腫病菌第0 3天顯示出極大的飼料需求率。這是 由於浮腫病菌感染而引起腹瀉，未見到體重隨飼料攝取量而增加，飼料需求率變高。(iv)臨床觀察對各項目，從得到的臨床症狀評分，算出每天各組的每頭豬的平均臨床症狀評分。 將平均臨床症狀評分的推移示於圖25。此外，還算出了每頭仔豬在整個期間(投與浮腫病 菌第0 11天)的平均合計臨床症狀評分。將此示於圖26。在無投與浮腫病疫苗的1組 仔豬中，在投與浮腫病菌第1 3天出現浮腫病的臨床症狀，惡化，到第11天為止可觀察到 同樣的臨床症狀。在投與了 lmg浮腫病疫苗的2組仔豬中，在投與浮腫病菌第1 4天出 現浮腫病的臨床症狀，惡化，到第11天為止可觀察到同樣的臨床症狀。另一方面，在投與了 4mg浮腫病疫苗的3組仔豬及投與了 16mg浮腫病疫苗的4組仔豬、非感染浮腫病菌的5組 仔豬中，整個期間幾乎沒有觀察到浮腫病的臨床症狀。尤其，在這些組中，完全未觀察到浮 腫病特徵性的眼周圍浮腫。將未投與浮腫病疫苗的1組仔豬、及投與了 16mg浮腫病疫苗的 4組仔豬的第11天的照片示於圖27。未投浮腫病疫苗的1組仔豬可見到眼周圍有重度浮 腫，引起水樣腹瀉。另一方面，投與了 16mg浮腫病疫苗的4組仔豬眼周圍未見到浮腫，也沒 有引起腹瀉。此外，從整個期間的合計臨床症狀評分知道了通過投與浮腫病疫苗，可以緩和或 抑制浮腫病的臨床症狀。尤其，在3次投與中，通過每次投與4mg以上浮腫病疫苗，可以有 效地抑制浮腫病的臨床症狀。產業上的利用可能性通過使用本發明的DNA構建物，通過轉化植物等，可以有效地得到生產Stx2e蛋白 質的轉化體。若使用本發明的DNA構建物，可以使用萵苣等的栽培成本低的植物有效製造 豬浮腫病疫苗。此外，若使用本發明的豬浮腫病疫苗，可以簡便且有效防除豬浮腫病。
權利要求
一種DNA構建物，含有來源於植物的醇脫氫酶基因的5』-非翻譯區以及在該區域可表達地連接的編碼Stx2e蛋白質的DNA，所述Stx2e蛋白質在氨基末端附加有來源於植物的分泌信號肽。
2.如權利要求1記載的DNA構建物，所述醇脫氫酶基因的5』-非翻譯區來源於菸草。
3.如權利要求1或2記載的DNA構建物，所述分泌信號肽來源於菸草。
4.如權利要求1 3的任一項記載的DNA構建物，所述Stx2e蛋白質是Stx2e蛋白質 的B亞基。
5.如權利要求1 4的任一項記載的DNA構建物，所述Stx2e蛋白質在羧基末端附加 有內質網滯留信號肽或液泡運輸信號肽。
6.如權利要求5記載的DNA構建物，內質網滯留信號肽在羧基末端含有KDEL序列或 HDEL序列。
7.如權利要求5記載的DNA構建物，液泡運輸信號肽來源於菸草。
8.如權利要求1 7的任一項記載的DNA構建物，具有序列編號12所表示的鹼基序列。
9.如權利要求5記載的DNA構建物，具有序列編號23、24、75、77、78、86的任意一個表示的鹼基序列。
10.一種重組載體，含有如權利要求1 9的任一項記載的DNA構建物。
11.一種轉化體，用權利要求10記載的重組載體轉化。
12.如權利要求11記載的轉化體，轉化體是轉化植物細胞或轉化植物。
13.如權利要求12記載的轉化體，所述植物是萵苣(Lactucasativa)。
14.一種種子，從權利要求12或13記載的轉化體得到。
15.一種豬浮腫病疫苗，含有權利要求11 13的任一項記載的轉化體。
16.一種豬浮腫病的防除方法，其特徵在於，將權利要求15記載的豬浮腫病疫苗向豬 投與。
全文摘要
開發低成本且高效率生產豬浮腫病疫苗的技術。具體地，在植物細胞效率良好地表達豬浮腫病的毒素蛋白質(Stx2e蛋白質)的基因，低成本地生產豬浮腫病的植物疫苗。使用來源於植物的醇脫氫酶基因的5』-非翻譯區(ADH5』UTR)，在萵苣等的植物細胞表達在氨基末端附加有來源於植物的分泌信號肽的Stx2e蛋白質。
文檔編號A61P39/02GK101868540SQ200880023029
公開日2010年10月20日 申請日期2008年3月25日 優先權日2007年7月3日
發明者吉田和哉, 川本惠子, 松井健史, 澤田和敏, 牧野壯一 申請人:出光興產株式會社;國立大學法人奈良先端科學技術大學院大學;國立大學法人帶廣畜產大學