擴張和/或修復椎間盤的材料和方法

2023-09-21 22:58:50

專利名稱：擴張和/或修復椎間盤的材料和方法
技術領域：
本發明一般涉及擴張和/或修復椎間盤的材料和方法，更具體涉及用幹細胞材料擴張和/或修復椎間盤的材料和方法。
背景技術：
健康的椎間盤促進成對椎骨之間的運動，同時吸收和分散衝擊。椎間盤由兩部分組成承擔大部分負載的柔軟中心核(髓核)和容納並穩定核心材料的韌外環(纖維環)。
隨著自然老化過程的進展，椎間盤會脫水、退化，對其充分墊襯和支撐椎體的能力造成負面影響。這種自然幹縮出於更晚期階段時通常稱作「黑椎間盤」，因為椎間盤的脫水在磁共振成像[MRI]上出現，椎骨會彼此更靠近，壓迫脊神經，引起疼痛，從而使患者感覺不適。
治療椎間盤退化疾病的技術在此前主要依賴於更換椎間盤的方法。在這種情況下，在更換椎間盤之前通常要對脫水和/或退化的椎間盤進行擴張，而擴張材料主要是合成器件，植入椎間盤後，它們可充氣或展開膨脹元件。
在最近研究中，提到多潛能和/或多能幹細胞可能可用於醫療應用。多能幹細胞是自我更新的細胞，它能夠分化成體內發現的200多種不同細胞類型中的任何一種。胚胎多能幹細胞和/或多能幹細胞可表現為胚胎癌性(「EC」)細胞、胚胎生殖(「EG」)細胞或胚胎幹(「ES」)細胞的特徵。非胚胎多能細胞和/或多能幹細胞可獲自成人的體細胞。非胚胎多能幹細胞包括，例如，神經幹細胞、間充質幹細胞、骨髓幹細胞以及通過吸脂獲得的幹細胞。出於揭示的目的，胚胎多能細胞或多能細胞以及非胚胎多能細胞或多能細胞都被稱為「幹細胞」。換句話說，出於本發明揭示的目的，任何未分化成成熟細胞類型的細胞都可被稱為「幹細胞」。
間充質幹細胞是衍生自包括骨髓基質、血液、真皮和骨膜在內的多種來源的成人多能細胞。這些細胞可在體外連續培養而不會自發分化。然而，在合適的條件下，間充質幹細胞可被誘導分化成間充質譜系的細胞，包括脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、腱細胞(tenocyte)、韌帶原性細胞(ligamentogenic cell)、肌原性細胞、骨髓基質細胞和真皮原性細胞(dermogenic cell)。
造血幹細胞是能夠自我更新並分化成包括紅細胞、巨核細胞、單核細胞/巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞、B細胞和T細胞在內的多種血細胞類型的多能細胞。造血幹細胞可獲自胎兒肝臟、成人骨髓或稱為衛星細胞的單核肌肉前體細胞。
近來，通過將核轉移到卵細胞來重新編程體細胞核的方法獲得了人多能幹細胞。那種稱為治療克隆的技術能將來自患者的多能幹細胞用於自體移植治療。類似地，多能幹細胞可通過成人(非胚胎、非胎兒)哺乳動物組織分化產生。然而，迄今為止，這種多能或多潛能細胞從未被用於擴張擴張或修復椎間盤。
因此仍需要使用多潛能和/或多能幹細胞來擴張或修復椎間盤的技術。本發明就是為了解決這種需求。
發明概述簡單說來，本發明一方面提供了通過將幹細胞材料施用到椎間盤來擴張和/或修復椎間盤的方法。所述幹細胞材料可以來自未分化的細胞，或者它可以來自已經分化但隨後有回到未分化狀態的細胞。無論將植入的細胞在選擇用於椎間盤間隙之前是否開始分化，在一些實施方案中，這種幹細胞材料包括在將材料植入椎間盤之前已經被誘導以表達至少一種人椎間盤細胞(如成纖維細胞、軟骨細胞或背索細胞)的特徵的細胞。或者，未分化的幹細胞材料和能夠誘導幹細胞分化的材料可在植入椎間盤間隙之前、之中或之後組合在一起，這樣，這種幹細胞材料便可在椎間盤間隙中分化以表達至少一種人椎間盤細胞的特徵。
在一些實施方案中，這種幹細胞材料是與一種膠原基材料組合提供的，所述膠原基材料可以是富含膠原的晶格。所述膠原基材料可以脫水形式提供，並在植入後再水化，或者也可以水化形式，如漿或凝膠提供。膠原基材料中可以包含交聯劑，如戊二醛，用以促進膠原的交聯。
此外，可以包含放射造影(radio-contrast)材料以增強成像。可以包含性能增強添加劑例如鎮痛藥和/或抗生素以提供另外的治療益處。
在一些優選的實施方案中，所述幹細胞材料是作為幹細胞分離物提供的，這種分離物可以基本上不含非幹細胞材料。
從以下描述中的本發明權利要求的目的和優點將顯而易見。
優選的實施方案的描述為了加深對本發明原理的理解，下面將結合特定的優選實施方案進行介紹，敘述時將使用具體的語言。但應當理解，這些實施方案不對本發明的範圍構成限制，本發明所涉領域的技術人員通常考慮到優選實施方案中的替代變更和進一步改進。
如上所述，本發明一方面涉及用幹細胞材料來擴張或修復椎間盤的材料和方法。在最優選的實施方案中，幹細胞材料被施加到在基本上完好的環中包含的椎間盤核。其它實施方案中，材料被施加到包含在受損或缺陷環中的椎間盤核。
在本發明的一個方面，幹細胞材料被施加到椎間盤並被誘導以分化成椎間盤細胞。所述幹細胞材料可包括從未分化的幹細胞，如胚胎幹細胞，或者它可以包括已經分化但隨後去分化以恢復其多能或多潛能能力的幹細胞。
無論施用何種類型的幹細胞，所述細胞可被誘導以表達人椎間盤細胞的一種或多種特徵。在一個實施方案中，所述細胞被誘導，在它們被施加到椎間盤之前(例如體外)顯示椎間盤細胞的特徵，而在其它實施方案中，所述細胞被誘導，在它們被施加到椎間盤之後(體內)顯示椎間盤細胞的特徵。
在一個優選的實施方案中，所述幹細胞材料是脂衍生的幹細胞材料。更具體地說，所述幹細胞材料基本上不含其它細胞類型(例如，脂肪細胞、紅細胞、其它間質細胞等)和胞外基質材料。最優選地，所述幹細胞材料完全不含這種其它的細胞類型和基質材料。所述脂衍生的幹細胞材料可以來自靈長類的脂肪組織，最優選的是來自接受脊髓移植的人。儘管所述幹細胞材料可以是任何類型的幹細胞，但中胚層來源的材料較佳。
當使用脂肪衍生的幹細胞材料時，所述材料可用任何合適的方法獲得。但通常，該方法開始於從來源動物中分離脂肪組織。當使用來自活供體的人脂肪間質細胞時，如外科手術或脂肪抽吸術等完全公認的方法是優選的。
獲得脂肪組織後，優選從剩餘的材料中分離幹細胞。在一個優選的實施方案中，脂肪組織用生理相容性鹽溶液(例如磷酸緩衝鹽水)洗滌，然後劇烈攪拌並靜置。這樣可從脂肪組織中除去鬆散的物質(例如，受損的組織、血液、紅細胞等)。洗滌和靜置步驟可重複進行直到上清液相對不含碎屑。
剩餘的細胞通常將以各種大小的塊存在，因此優選對該材料進行處理以降解大的結構而使對細胞本身的損傷最小。一種方法是用削弱或破壞細胞之間的鍵的酶(例如，膠原酶、分散酶、胰蛋白酶等)來處理經過洗滌的細胞塊。這種酶處理的量和時間是可變的，這取決於處理條件，但這種酶的用途通常是此領域已知的。可用其它處理方法，如機械振蕩、聲能、熱能等，來降解細胞塊，這些方法可交替使用或者和酶處理一起使用。
降解步驟通常產生聚集的細胞(通常是脂質體)的漿液或懸液以及含有通常無間質細胞(例如，紅細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞和幹細胞)的液體組分。因此，分離過程中的下一個步驟是從間質細胞分離聚集的細胞。這可通過離心完成，把間質細胞壓成被上清液覆蓋的片狀物。然後棄去上清並將片狀物懸浮於生理相容性液體。
懸浮的細胞通常包括含有紅細胞，在大多數方案中最好裂解紅細胞。選擇性裂解紅細胞的方法是此領域已知的，並可使用任何合適的方法(例如，在高滲或低滲介質中培養)。如果紅細胞被裂解，然後應從裂解物中分離剩餘的細胞，通常是通過過濾或離心。無論紅細胞是否裂解，懸浮的細胞可被洗滌、再離心和再懸浮一次或連續多次以得到較高純度。
可用細胞分選儀或根據細胞大小和粒度(幹細胞相對較小且無顆粒)來分離成人幹細胞。可通過免疫組織化學的方法，例如通過淘選或用磁珠將它們分離。如果需要，任何分離本發明細胞的步驟和過程可手工進行。或者，分離這種細胞的方法可通過合適的裝置來完成，許多裝置是此領域已知的。
如上所述，在一些實施方案中，所述幹細胞材料包含已經分化但隨後又去分化以恢復其多能能力的細胞。一種實現這一目的的方法包括建立細胞培養物並處理細胞以逆轉與分化有關的特定的染色體外遺改變。
細胞分化過程中發生的基因表達的可遺傳變化部分是由於染色體構象的外遺改變。此外，染色體的鬆散凝集區含有轉錄活性基因，且染色體的高度凝集區含有轉錄沉默基因。染色體凝集和轉錄活性的狀態部分是由DNA甲基化和組蛋白乙醯化控制的。CpG啟動子內胞嘧啶的甲基化和過度甲基化與基因沉默有關，而未甲基化的DNA通常是轉錄活性的。
分化的成人體細胞顯示出穩定且特定的甲基化模式，而多能細胞，如原始的生殖細胞和植入前胚胎，顯示出去甲基化的全基因組模式。一些研究證實，甲基化的這些可遺傳模式是可逆的。例如，已將鼠胸腺淋巴細胞與鼠胚胎生殖細胞融合，並證實了淋巴細胞細胞核的全基因組去甲基化。所得去甲基化的核隨後顯示出是多能的。
因此，在本發明的一個方面，用DNA去甲基化重新編程成人體細胞。去甲基化可抑制含有DNA的核苷酸甲基化。根據本發明，成人體細胞可以用一種試劑處理以促進或誘導DNA的去甲基化。在去甲基化步驟的一個實施方案中，成人體細胞用5-氮-2』-脫氧胞苷處理。將原始成人體細胞在含有0.1-100μM5-氮-2』-脫氧胞苷(SigmaChemical公司，St.Louis，Mo.)的正常生長培養基中培養1-10天，優選培養5天，以促進或誘導DNA的去甲基化。可用於去甲基化步驟的其它試劑包括，例如，甲基化酶特異性抗體或甲基化酶的其它抑制劑。
除了DNA甲基化和去甲基化的具體模式，通過染色質重塑酶，如組蛋白乙醯化酶和脫乙醯化酶，也可調節總的轉錄模式。乙醯化的組蛋白以低於脫乙醯化的組蛋白的親和力結合DNA，因此通常允許轉錄因子結合DNA。相反，脫乙醯化的組蛋白以較高親和力結合DNA，阻遏了轉錄激活劑接近DNA，因此通常抑制轉錄。在本發明的另一個實施方案中，通過抑制或逆轉組蛋白的脫乙醯化對原始成人體細胞重新編程。將原始成人體細胞培養在含有0.1-10000ng/ml制毛癬素A(Sigma Chemical公司，St.Louis，Mo.)的正常生長培養基中培養至少24小時。用制毛癬素A處理細胞顯示可誘導或允許以前沉默的基因的表達。或者，細胞可用丁酸鈉處理，這樣也可抑制組蛋白脫乙醯化。任何可誘導或有利於組蛋白乙醯化或DNA甲基化中變化的試劑都可用來實現這個目的。
在又一個實施方案中，原始成人體細胞用染色質重塑蛋白處理，所述蛋白質優選為核質蛋白，這是一種有助於組蛋白H1與組蛋白B4和HMG1交換，從而有助於轉錄的激活的核伴侶。在一個優選的實施方案中，一轉運肽(例如，Tat)融合到含有被施加到正常培養基中的細胞的核質蛋白的肽上。在核質蛋白處理停止之前組蛋白的交換得以進行。可以預見，可用任何此領域已知的有助於除去轉錄阻抑物並有助於核重塑的染色質重塑酶、試劑、嵌入劑或它們的組合來處理細胞。
在另一個實施方案，原始成人體細胞用去甲基化劑、脫乙醯化抑制劑或乙醯化啟動子和/或核伴侶的組合處理，以促進核的重新編程。術語「核伴侶」在本文中是指任何有助於組蛋白H1或HMG1的其它轉錄阻抑物、組蛋白B4或其它轉錄激活劑交換的試劑。可以預見，任何可誘導或有助於組蛋白乙醯化或DNA甲基化的試劑都可用於本發明的實踐。還可預見，可用任何此領域已知的有助於除去轉錄阻抑物並有助於核重塑的染色質重塑酶、試劑、嵌入劑或它們的組合來處理細胞。
此外，熟練技術人員可用此領域已知的阻斷DNA甲基化、促進DNA去甲基化、阻斷組蛋白脫乙醯化、促進組蛋白乙醯化和/或促進組蛋白H1與組蛋白B4或HMG1交換的其它試劑處理原始細胞，以便重新編程所述細胞的基因組。
成人體幹細胞培養物可用一種或多種下列試劑處理以誘導中期停頓G2-M細胞周期蛋白(例如細胞周期蛋白-A或細胞周期蛋白-B)、c-Mos、秋水仙素、秋水仙醯胺或任何其它可逆微管藥物。可通過膜轉位法將多肽試劑，如細胞周期蛋白-A，細胞周期蛋白-B或c-Mos，施加到細胞，該方法包括但不限於，微注射、脂質體介導的轉位、或融合到轉運肽的多肽的直接轉位。或者，例如，在對可調型啟動子如市售的Tet-on/Tet-off系統(Clontech，Palo Alto Calif.)的控制下，可通過陽離子脂質轉導、微注射或電穿孔將編碼細胞周期蛋白-A、細胞周期蛋白-B或c-Mos的多核苷酸構成的載體轉染入培養的細胞。在細胞的中期停頓持續至少1-6個小時之後，可通過更換培養基(如用肽或微管毒物處理)或通過啟動子阻抑(如多核苷酸載體轉染)使細胞從中期停頓釋放。
應該理解的是，易於獲得的成人體細胞，最優選毛髮外根鞘(ORS)細胞、表皮角質形成細胞或頰上皮細胞，可獲自受試者並在本文所述的培養基中擴展，其中，所述受試者優選是人。細胞用一定量的去甲基化劑，優選約10μM5-氮-2』-脫氧胞苷處理約5天，以誘導全基因組的去甲基化。這些細胞也可用脫乙醯化抑制劑或乙醯化啟動子，優選100ng/ml或1μM制毛癬素A處理24小時，以促進組蛋白乙醯化。這些細胞也可用一定量含有核伴侶或其它染色質重塑酶(Fry和Peterson，同上)，優選核質蛋白或tat-核質蛋白的多肽處理以便於從DNA中除去轉錄阻抑物。
上述一個或多個步驟之後，用一定量使細胞在中期停頓的試劑，優選含有細胞周期蛋白-A或細胞周期蛋白-B的多肽，處理細胞30小時以誘導持續的有絲分裂停頓。然後通過用至少一種更換的培養基洗滌細胞使細胞從有絲分裂停頓中釋放。
有絲分裂停頓步驟之後，附著的細胞被胰蛋白酶化、重鋪並在設計用於支持幹細胞生長的培養基中培養。在一個優選的實施方案中，重建的細胞在80％KNOCKOUT.RTM.DMEM、20％ KNOCKOUT.RTM.SR(GIBCO/BRL，BethesdaMd.)、1mM穀氨醯胺、0.1mM β-巰基乙醇、1％非必需胺基酸貯液(GIBCO/BRL，Bethesda Md.)、4ng/ml鹼性成纖維細胞生長因子和1000U/ml白血病抑制因子(ES細胞培養基)中在小鼠胚胎成纖維細胞飼養細胞層上傳代。KNOCKOUT.RTM.DMEM和KNOCKOUT.RTM.SR是設計用於增強胚胎幹細胞生長並保持其多能性的特殊配方。熟練的技術人員還可使用此領域已知的其它細胞培養基配方以增殖多能細胞。
提供幹細胞之後，在本發明的一個方面，所述細胞被誘導以表達一種或多種人椎間盤細胞的特徵。該過程可在體外或體內進行，這將在下面更詳細討論。如上所述，這些已開始表達成熟的人椎間盤細胞特徵的細胞仍被稱為「幹細胞」。事實上，出於本發明敘述的目的，任何未分化成成熟細胞類型的細胞都可被稱為「幹細胞」。
在一個優選的實施方案中，重建的細胞直接在對維持幹細胞不是最優但仍可使重建的細胞分化的條件下培養。通常，這種培養條件可缺乏血清，缺乏飼養細胞，含有高密度細胞，或含有一種或多種各種形態發生生長因子或分化因子，如用於培養具有規定表型的成熟細胞的培養基，具有所需和/或規定表型的成熟細胞，或特定的分化因子，例如視黃酸或神經生長因子。
一種處理類型是將本發明的細胞在已接觸各自類型的待分化的成熟細胞(或其前體)的條件培養基中培養(例如，接觸肌細胞的條件培養基可誘導肌原性分化，接觸心瓣膜細胞的條件培養基可誘導分化成心瓣膜組織等)。
來自成人多能幹細胞的擴展的體外培養物可通過生長因子和/或形態發生素體外處理來分化。當然，也可使用誘導分化的確定成分培養基。可將細胞暴露於約1□M-10μM胰島素、約1□M-10μM運鐵蛋白、約1ng/ml-10ng/ml轉化生長因子(TGF)β1以及約10nM-50nM抗壞血酸-2-磷酸(50nM)來誘導軟骨形成的分化。對於軟骨形成的分化，優選以高密度(例如，每毫升約數百萬細胞或用微量(micromass)培養技術)培養細胞，且也存在少量血清(例如，約1％-5％)。可將細胞暴露於約10-7M-10-10M地塞米松(例如，約1μM)並混合約10μM-50μM抗壞血酸-2-磷酸以及約10nM-50nM β-甘油磷酸來誘導成骨發育表型，所述培養基中還可含有血清(例如，牛血清、馬血清等)。
細胞在分化誘導培養基中培養適當時間(例如，幾天至一周或數周)之後，可對細胞進行測定以確定它們實際上是否已分化得到所給細胞類型的物質品質。一種測量分化的方法本質上是測量端粒長度，未分化的幹細胞的端粒長於分化的細胞，因此可測定細胞端粒酶活性水平。或者，可提取細胞的RNA或蛋白質並測定(通過Northern雜交、rtPCR、Western印跡分析等)表示所需表型的標記的存在。當然，細胞可用免疫組織化學方法測定或用組織特異性染料染色。類似地，可用骨特異性染料(例如，鹼性磷酸酶、von Kossa等)染色細胞或探測骨特異性標記(例如，骨鈣素、骨粘連蛋白、骨橋蛋白、I型膠原、骨形態發生蛋白、cbfa等)的存在來測定成骨作用(ostogenesis)。可用軟骨特異性染料(例如，阿辛藍)染色細胞或探測細胞中軟骨特異性分子(例如，培養基中的硫化的糖胺聚糖和蛋白聚糖(例如，角蛋白、軟骨素等)、II型膠原等)的表達/生成來確定軟骨發生。其它確定發育表型的方法是此領域已知的，任何這些方法都是適用的。例如，可根據大小和粒度分選細胞。此外，細胞可被用來產生單克隆抗體，然後可用單克隆抗體來確定它們是否優選結合給定的細胞類型。抗原性的相關性可證實幹細胞已經沿著給定的發育途徑分化。
或者，可在體內誘導幹細胞表達一種或多種人椎間盤細胞的特徵。這可通過幾種方法實現，包括在椎間盤中提供外源幹細胞，優選以高密度提供。幹細胞可以與有或沒有選擇用來誘導人椎間盤細胞發育的試劑一起加入。
可誘導幹細胞分化成人椎間盤細胞的因子是用於體外分化幹細胞的因子。例如，轉化生長因子(TGF)-□、抗壞血酸-2-磷酸、骨形態發生蛋白、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、□-甘油磷酸、胰島素、胰島素樣生長因子、運鐵蛋白、氫化可的松以及其它精通此領域的技術人員已知的試劑可用於此目的。
無論細胞是否與上面提出的一種或多種誘導劑一起提供，應該理解，所述細胞可以培養或生長在已接觸各自類型待分化的成熟細胞(或其前體)的條件中(例如，接觸肌細胞的條件培養基可誘導肌原性分化，接觸心瓣膜細胞的條件培養基可誘導分化成心瓣膜組織等)。當以高密度提供細胞時，這種處理尤其有效。
在本發明的另一方面，為便於使用幹細胞材料來擴張脊椎盤，所述幹細胞材料是在生物相容的晶格材料中提供的。通常，所述晶格含有來自與提供幹細胞材料相同的脂肪組織的富含膠原的材料。理想的是，所述晶格隨著時間可生物降解，這樣它將隨著幹細胞材料的發育被吸收入體內。晶格還可包含激素，如生長因子、細胞因子和形態發生素(例如，視黃酸、aracadonic acid等)，所需的胞外基質分子(例如，纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原等)或所需的其它材料(例如，DNA、病毒、其它細胞類型等)。
為形成幹細胞/富含膠原的晶格材料，將幹細胞引入晶格使它們滲透進其中的間隙。例如，可將晶格浸入含有細胞的溶液或懸液，或將這種溶液或懸液灌注或注射到晶格中。一種特別優選的組合物是由包括富含膠原的晶格材料的懸液與分散在其中的幹細胞材料交聯形成的水凝膠。這種形成方法可使細胞分散在整個晶格中，更易於細胞滲透到晶格中。
適合包含入組合物的晶格可來自任何合適的來源(例如，基質膠)，並可通過一些商業來源獲得合適的晶格(例如，合適的聚乙醇酸可獲自以下來源，例如PuracBiochem.和Boehringer Ingelheim)。如上所述，富含膠原的晶格的較佳來源是提供幹細胞的脂肪組織的非細胞部分，即基本上沒有細胞的脂肪組織胞外基質材料。通常，這種脂衍生的晶格包括蛋白質，如蛋白聚糖、糖蛋白、類透明質酸(hyaluronan)、纖連蛋白、膠原(I型、II型、III型、IV型、V型、VI型等)，等等，它們作為細胞生長的優良基質。此外，脂衍生的晶格可包含激素，優選細胞因子和生長因子，以便於種入晶格的細胞生長。
所述脂衍生的晶格可分離自與上述類似的脂肪組織，除非它將出現在非細胞部分。例如，可對脂肪組織或其衍生物(例如，按上述方法離心後細胞部分)進行聲能或熱能處理和/或酶處理以回收晶格材料。同時，脂肪組織的細胞部分最好被破壞，例如通過用脂肪酶、去汙劑、蛋白酶處理，和/或通過機械破裂或超聲破裂處理(例如，用勻漿機或超聲儀)。雖然分離的材料一開始可以是粘性材料，但根據所需最終用途，它隨後可按照需要進行處理。例如，可對原始晶格材料進行處理(例如，滲析或用蛋白酶或酸等處理)以產生所需的晶格材料。因此，晶格可被製成水合形式，或者它可被乾燥或凍幹成基本上無水形式或粉末。之後，粉末可被再水合以用作細胞培養基質，例如通過將其懸浮在合適的細胞培養基中。在這方面，所述脂衍生的晶格可與上述其它合適的晶格材料混合。
在一些實施方案中，幹細胞/富含膠原的晶格材料與額外的膠原基材料結合以用於擴張脊椎盤。額外的膠原基材料優選來源於天然、富含膠原的組織如椎間盤、筋膜、韌帶、腱、去礦化的骨基質等。該材料可以是同源的、異源的、或異種的、或可以是人重組來源。在可替換的實施方案中，膠原基材料可以是一種合成的、膠原基材料。優選的富含膠原的組織的例子包括椎間盤環、闊筋膜、平麵筋膜、前或後交叉韌帶、髕腱、膕腱、四頭肌腱、跟腱、皮膚和其它結締組織。
有或沒有額外的膠原基材料的幹細胞/富含膠原的晶格材料可以以適合導入椎間盤間隙的任何形式提供。例如，該材料可以是一種固體、多孔、編織、或非編織材料。該材料可作為顆粒或小塊或作為纖維材料提供。
在一些實施方案中，這種與幹細胞一起提供的膠原基材料以脫水狀態提供，並在椎間盤中植入後「再水合」。在其它實施方案中，該膠原基材料是「溼」植入的。當該材料是「溼的」時，它可能是因為從未被脫水或已被脫水並重建。當重建時，該材料可用鹽水或另一水介質重建，或者可用非水介質例如乙二醇或酒精重建。並且，當以「溼的」狀態提供時，該材料可以作為凝膠、溶液、混懸液、分散體、乳劑、糊等提供。在最優選的實施方案中，該材料是一種適合通過皮下注射針注射入椎間盤的微粒和/或纖維材料。
在最優選的實施方案中，富含膠原的晶格材料和/或額外的膠原基材料作為尺寸範圍在0.05mm和5mm之間的微粒提供。當使用例如闊筋膜或椎間盤環微粒的材料用作額外的膠原基材料時，微粒粒度優選從0.1mm到5mm。當使用例如去礦化的骨基質時，該微粒粒度優選從0.05mm到3mm。當使用材料的小塞時，該塞優選從0.5mm到5mm的尺寸範圍。在一些實施方案中，可以使用較大尺寸的塊例如尺寸達20mm的塊。
可以使用多於一種類型的組織加工或製備該材料。例如，在適當情況下可優選幹細胞/富含膠原的晶格材料與闊筋膜和/或去礦化的骨基質(DBM)的混合物，如可以是幹細胞/富含膠原的晶格材料與DBM和環纖維材料的混合物。
可以在配方中加入交聯劑以促進膠原材料的交聯。例如，可以在配方中包含戊二醛或其它蛋白交聯劑。交聯劑可促進膠原分子間共價或非共價的交聯。類似地，也可包含抑制蛋白變性的試劑。適合用於本權利要求的發明的交聯劑是本領域技術人員熟知的，可以不經過度的實驗而選擇。
當材料用作漿或凝膠時，也可包含促進漿或凝膠形成的添加劑。這些添加劑可以促進蛋白摺疊、水結合、蛋白-蛋白相互作用和水固定。
此外，可以包含一种放射照相造影劑，例如硫酸鋇，或一种放射造影染料，例如泛影葡胺+泛影酸鈉製劑(HYPAQUE)，以幫助外科醫生追蹤所注射材料的運動和/或位置。適合用於椎間盤造影術的放射造影材料是本領域技術人員已知的，可以不經過度的實驗而選擇用於本發明。
最後，還可以包含對所注射的幹細胞/膠原基材料提供好處的其它添加劑。這種添加劑包括鎮痛藥以減輕疼痛、抗生素以將潛在的細菌感染減至最低程度。
也可包含蛋白聚糖和/或其它多糖，以吸引和/或結合水來保持核水合。類似地，也可包含生長因子和/或其他細胞(例如椎間盤細胞、幹細胞等)，以促進癒合、修復、再生和/或恢復椎間盤，和/或促進正常的椎間盤功能。適合用於本權利要求的發明的添加劑是本領域技術人員已知的，可以不經過度的實驗而選擇。
在加入到椎間盤間隙之前，幹細胞/膠原材料可被製成各種形式(例如固體、多孔、編織、非編織、微粒、凝膠、溶液、懸液、糊劑等)。在一個優選的實施方案中，所述材料在注射入椎間盤間隙之前是脫水的，它通過從椎間盤間隙吸收液體而再水合。在其它實施方案中，膠原材料是作為凝膠、漿液或其它在植入前水合的形式提供的。
幹細胞材料/膠原基材料是「通過外科手術加入」到椎間盤間隙的。即該材料通過醫務人員的介入被加入，以區別於通過身體的自然生長或再生過程而「加入」。外科手術過程優選地包括通過皮下注射針注射，儘管可使用膠原基材料導入椎間盤的其他外科手術方法。例如，該材料可通過擴張的環開口擠壓、經導管灌注、經創傷或外科手術切口產生的開口插入，或通過其它侵入性或最小侵入性方法將該材料沉積入椎間盤間隙的方法被導入椎間盤。
就本發明材料和方法的優點而言，擴張椎間盤可恢復或改善椎間盤的自然狀況和/或性能。此外，擴張可抑制或逆轉脫水椎間盤的逐步退化。
下面介紹採用上述方法的具體實施例。應當理解，提供這些實施例是為了更完整地描述優選實施方案，而不是限制本發明的範圍。
實施例1從體組織獲得幹細胞材料可從經受選擇性外科手術的患者中獲得原始脂肪抽吸術的抽吸物。進行吸脂之前，可給予患者腎上腺素以使血液對抽吸物的汙染最小。然後對抽吸物進行粗濾使有關的脂肪組織塊與相關液體廢物分離。分離的組織用中性磷酸緩衝鹽水衝洗，然後在37℃用0.075％w/v膠原酶在間歇攪拌下酶解約20分鐘。
消化之後使膠原酶失效，然後將漿液在約260g下離心10分鐘。這樣產生了多層上清和一細胞團。然後除去上清並保存供將來使用。將細胞團重懸於裂解紅細胞的溶液並在約25℃下不攪拌培育約10分鐘。培育之後使培養基失效並將細胞在約250g再離心約10分鐘。
第二次離心後將細胞團中的細胞懸浮，並通過臺盼藍(tryan blue)排斥和細胞數目來測定存活力。以1×106細胞/100mm平皿塗布細胞並在37℃、5％CO2下補充有約10％胎牛血清的培養基中生長。大部分細胞是不含可見脂質液滴的粘著的小的單核成纖維細胞樣細胞。大部分細胞用油紅0和von Kossa染色呈陰性。
可測定細胞端粒酶的表達(用市售的TRAP測定試劑盒)，該測定中包括HeLa細胞和NH-12細胞作為陽性對照。測定人包皮成纖維細胞和加熱的HN-12細胞提取物中端粒酶陰性對照的活性。端粒酶活性通過用12.5％聚丙烯醯胺細胞分辨的磷成像端粒產物(phosphoimaging telomeric product)來測量。在來自脂肪組織的細胞和陽性對照中觀察到了表明端粒酶活性並與幹細胞的存在相一致的端粒梯(telometricladder)，但在陰性對照中未觀察到。這些結果證實，可用這種技術從脂肪組織分離幹細胞。
實施例2在體外使體細胞去分化成多能幹細胞成人角質形成細胞獲自Clonetics(San Diego，CA)，並根據「角質形成細胞系統說明」(BioWhittaker，目錄號AA-1000)中的說明在37℃、5-10％CO2下在角質形成細胞生長培養基中生長。當成人角質形成細胞有約40-80％鋪滿時，在培養物中加入10-25□M 5-氮-2』-脫氧胞苷(Sigma，St Louis，MO)。用5-氮-2』-脫氧胞苷培養4天後在培養物中加入100-250ng/ml制毛癬素(Sigma，St Louis，MO)。將培養物再培養1天，並取樣測定端粒酶活性。
測定在10-25□M 5-氮-2』-脫氧胞苷中暴露5天並在100-250ng/ml制毛癬素中暴露1天的角質形成細胞以及未暴露於這些試劑的細胞端粒酶的表達(用市售的TRAP測定試劑盒)。和陽性對照(HeLa細胞和NH-12細胞)和陰性對照(人包皮成纖維細胞和加熱的HN-12細胞提取物)一起測定這些細胞。端粒酶活性通過用12.5％聚丙烯醯胺細胞分辨的磷成像端粒產物來測量。在陽性對照和在10-25□M 5-氮-2』-脫氧胞苷中暴露5天並在100-250ng/ml制毛癬素中暴露1天的角質形成細胞中觀察到了表明端粒酶活性並與幹細胞的存在相一致的端粒梯。這些結果證實，在10-25□M 5-氮-2』-脫氧胞苷中暴露5天並在100-250ng/ml制毛癬素中暴露1天的角質形成細胞具有增加的端粒酶活性，這與幹細胞樣表型相一致。
實施例3幹細胞在體外的生長幹細胞在37℃和5％CO2下，在補充有10％胎牛血清的DMEM構成的細胞培養基中培養。在這些條件下，細胞可傳代至少5次而不會分化，且不會喪失它們的發育表型。
實施例4多能幹細胞分化成特定細胞類型將高密度幹細胞(約7×106細胞/ml)在由以下物質構成的培養基中培養數周DMEM，補充有1％FBS、6.25□M胰島素、6.25□g/ml運鐵蛋白(transferring)、10ng/ml轉化生長因子□1(TGF-□-1)和50nM抗壞血酸2-磷酸1％ABAM。
數周后對組織培養物進行組織學分析並在第2、7和14天用HE、阿辛藍(alcainblue)、甲苯藍(toludene blue)和Goldner三色染色進行石蠟切片。還測試了樣品與培養的抗軟骨素-4-硫酸和硫酸角蛋白以及II型膠原的抗體的結合。將組織培養物樣品染色以定性評估組織培養物中存在的基質的量。未暴露於軟骨形成培養基的對照幹細胞未顯示分化成軟骨形成細胞的證據。暴露於軟骨形成培養基的幹細胞顯示了分化成軟骨形成細胞的證據，早在暴露於軟骨形成培養基48小時後就形成了具有軟骨周細胞的明顯邊界的軟骨球形小結(cartilaginous spheroid nodule)。
實施例5將幹細胞/富含膠原的晶格材料注射入椎間盤間隙通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。用小直徑皮下注射針將幹細胞/膠原組合物通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。幹細胞/膠原組合物在注射後包含在椎間盤間隙內。過量體液隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞-膠原晶格。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例6將幹細胞/富含膠原的晶格材料注射入椎間盤間隙通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。在組織處理期間分離之後將膠原和幹細胞合併。再將幹細胞/膠原組合物懸浮在鹽水或任何其它合適的介質中。用皮下注射針將懸液通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。懸液在注射後包含在椎間盤間隙內。介質隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞-膠原晶格。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例7將幹細胞/富含膠原的晶格材料注射入椎間盤間隙通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。幹細胞被懸浮在體外並隨後與膠原合併。再將幹細胞/膠原組合物懸浮在鹽水或任何其它合適的介質中。用皮下注射針將懸液通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。懸液在注射後包含在椎間盤間隙內。介質隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞-膠原晶格。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例8添加放射造影染料通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。在幹細胞/膠原組合物中加入放射照相造影染料，然後用小直徑皮下注射針使其通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。幹細胞/膠原/染料組合物在注射後包含在椎間盤間隙內。含有放射照相造影染料的過量體液隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞-膠原晶格。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例9添加鎮痛藥通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。在幹細胞/膠原組合物中加入利多卡因的鎮痛藥，然後用小直徑皮下注射針將其通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。幹細胞/膠原/鎮痛藥組合物在注射後包含在椎間盤間隙內。過量體液隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞-膠原晶格。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例10添加生長因子通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。在幹細胞/膠原組合物中加入一種或多種生長因子，然後用小直徑皮下注射針將其通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。優選的生長因子包括那些可誘導幹細胞分化成能促進椎間盤癒合和/或再生的表型的生長因子。生長因子的例子包括轉化生長因子β、骨形態發生蛋白、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子等。幹細胞/膠原/生長因子組合物在注射後包含在椎間盤間隙內。過量體液隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞-膠原晶格。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例11添加額外的膠原基材料通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。在幹細胞/膠原組合物中加入一種或多種類型的膠原，然後用小直徑皮下注射針將其通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。優選的膠原包括那些來自椎間盤、筋膜、韌帶、腱、去礦化的骨基質等富含膠原的組織或結締組織的膠原。幹細胞/膠原組合物在注射後包含在椎間盤間隙內。過量體液隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞-膠原晶格。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例12添加多糖通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。在幹細胞/膠原組合物中加入一種或多種類型的多糖，然後用小直徑皮下注射針將其通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。優選的多糖包括那些來自動物或植物的多糖，如透明質酸、脫乙醯殼多糖、幾丁質、纖維素、瓊脂等。幹細胞/膠原/多糖組合物在注射後包含在椎間盤間隙內。過量體液隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞/膠原/多糖基質。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例13添加額外的生物材料通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。在幹細胞/膠原組合物中加入一種或多種生物材料，然後用小直徑皮下注射針將其通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。優選的生物材料包括白蛋白、血纖蛋白、絲、彈性蛋白、角蛋白，以及其它合成的親水性聚合物或水凝膠，如聚環氧乙烷、聚乙二醇、聚丙烯醯胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇等。幹細胞/膠原/生物材料組合物在注射後包含在椎間盤間隙內。過量體液隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞/膠原/生物材料基質。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例14添加多種額外的組分通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。在幹細胞/膠原組合物中加入放射照相造影染料、鎮痛藥、生長因子、填充劑和鹽水，然後用小直徑皮下注射針將其通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。填充劑可以是上述膠原、多糖或生物材料中的一種或多種。最終的組合物在注射後包含在椎間盤間隙內。含有放射照相造影染料和鹽水的過量體液隨後從椎間盤間隙滲出並留下最終的基質。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
實施例15添加交聯劑通過脂肪抽吸法從患者中取出足夠的脂肪組織，以這樣的方式處理組織即從其餘組織中分離基本上不含脂肪細胞和紅細胞的幹細胞和富含膠原的晶格。在幹細胞/膠原組合物中加入戊二醛之類的膠原交聯劑，然後用小直徑皮下注射針將其通過完整的環直接注射入核椎間盤間隙。注射後膠原在椎間盤間隙中進行交聯。過量體液隨後從椎間盤間隙滲出並留下幹細胞/交聯的膠原基質。單次注射較為理想，但也可進行額外的注射以實現合適的物理擴張和生物恢復水平。
儘管附圖
和說明書已經對本發明作了闡釋，但應當理解這些附圖和描述僅僅出於說明的目的，不對本發明特徵構成限制。應當理解，所顯示和描述的僅僅是優選實施方案，在本發明主旨範圍之內的所有變化形式和改進形式都在本發明保護範圍之內。本發明的材料和方法的其它實施例揭示在申請人的待批美國專利申請No.10/245,955中，該申請被全文納入本文作為參考。
權利要求
1.一種治療椎間盤的方法，其特徵在於，所述方法包括用外科手術在椎間盤中加入幹細胞材料。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料基本上由從未開始分化的幹細胞構成。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料基本上由已經開始分化但又已經返回未分化狀態的幹細胞構成。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料基本上由已經開始分化但又已經返回大體上未分化狀態的幹細胞構成。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料基本上由已經開始分化但又已經返回部分分化狀態的幹細胞構成。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料包含表達至少一種人椎間盤細胞特徵的幹細胞。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料包含已選擇性地誘導以表達至少一種人椎間盤細胞的特徵的幹細胞。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，已通過使所述幹細胞材料與選自轉化生長因子(TGF)-□、抗壞血酸-2-磷酸、骨形態發生蛋白、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、□-甘油磷酸、胰島素、胰島素樣生長因子、運鐵蛋白、氫化可的松的一個成員接觸來選擇性地誘導所述幹細胞材料以表達至少一種人椎間盤細胞的特徵。
9.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，已通過使所述幹細胞材料與所需表型的成熟細胞接觸來選擇性地誘導所述幹細胞材料以表達至少一種人椎間盤細胞的特徵。
10.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料包含表達至少一種成纖維細胞特徵的幹細胞。
11.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料包含已誘導以表達至少一種成纖維細胞特徵的幹細胞。
12.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料包含表達至少一種軟骨細胞特徵的幹細胞。
13.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料包含已誘導以表達至少一種軟骨細胞特徵的幹細胞。
14.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料包含表達至少一種背索細胞特徵的幹細胞。
15.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料包含已誘導以表達至少一種背索細胞特徵的幹細胞。
16.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料衍生自分化的細胞。
17.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料衍生自未分化的細胞。
18.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料收穫自用外科手術加入所述組合物的人。
19.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在將材料加入椎間盤之前將所述幹細胞材料和非幹細胞材料分離。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料大體上不含非幹細胞材料。
21.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞放置在富含膠原的晶格中。
22.如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述富含膠原的晶格材料收穫自用外科手術加入所述組合物的人。
23.如權利要求1所述的方法，還包括在椎間盤間隙中加入含有膠原基材料的成熟細胞的步驟。
24.如權利要求1所述的方法，還包括在椎間盤間隙中加入有效誘導幹細胞分化成椎間盤細胞的材料的步驟。
25.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述有效誘導幹細胞分化成椎間盤細胞的材料包括選自下組的一個成員轉化生長因子(TGF)-□、抗壞血酸-2-磷酸、骨形態發生蛋白、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、□-甘油磷酸、胰島素、胰島素樣生長因子、運鐵蛋白、氫化可的松。
26.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述有效誘導幹細胞分化成椎間盤細胞的材料包括所需表型的成熟細胞。
27.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述用外科手術加入的步驟包括將所述幹細胞材料注射入椎間盤。
28.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述方法包括用外科手術在椎間盤中加入主要由幹細胞材料構成的組合物。
29.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料作為凝膠加入椎間盤。
30.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料作為溶液或懸液加入椎間盤。
31.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料是作為還含有交聯劑的製劑提供的。
32.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料是作為還含有放射造影劑的製劑提供的。
33.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料是作為還含有鎮痛藥的製劑提供的。
34.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料是作為還含有抗生素的製劑提供的。
35.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料是作為還含有至少一種多糖的製劑提供的。
36.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料是作為還含有蛋白聚糖的製劑提供的。
37.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料是作為還含有生長因子的製劑提供的。
38.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述幹細胞材料是作為還含有有效促進椎間盤癒合、修復、再生和/或恢復，和/或有助於適當的椎間盤功能的一種或多種其它細胞類型的製劑提供的。
39.一種已用外科手術在椎間盤中加入幹細胞材料處理的椎間盤。
40.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤已通過加入從未開始分化的幹細胞處理。
41.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤已通過加入已經開始分化但又已經返回未分化狀態的幹細胞處理。
42.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤已通過加入已經開始分化但又已經返回大體上未分化狀態的幹細胞處理。
43.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤已通過加入已經開始分化但又已經返回部分分化狀態的幹細胞處理。
44.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤已通過加入表達至少一種人椎間盤細胞的特徵的幹細胞處理。
45.如權利要求44所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤已通過加入選擇性地誘導以表達至少一種人椎間盤細胞的特徵的幹細胞處理。
46.如權利要求45所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料與選自轉化生長因子(TGF)-□、抗壞血酸-2-磷酸、骨形態發生蛋白、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、□-甘油磷酸、胰島素、胰島素樣生長因子、運鐵蛋白、氫化可的松的一個成員接觸來選擇性地誘導所述幹細胞材料以表達至少一種人椎間盤細胞的特徵。
47.如權利要求45所述的椎間盤，其特徵在於，已通過所述幹細胞材料與所需表型的成熟細胞接觸來選擇性地誘導所述幹細胞材料以表達至少一種人椎間盤細胞的特徵。
48.如權利要求44所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料包含表達至少一種成纖維細胞特徵的幹細胞。
49.如權利要求45所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料包含已誘導以表達至少一種成纖維細胞特徵的幹細胞。
50.如權利要求44所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料包含表達至少一種軟骨細胞特徵的幹細胞。
51.如權利要求45所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料包含已誘導以表達至少一種軟骨細胞特徵的幹細胞。
52.如權利要求44所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料包含表達至少一種背索細胞特徵的幹細胞。
53.如權利要求45所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料包含已誘導以表達至少一種背索細胞特徵的幹細胞。
54.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料衍生自分化的細胞。
55.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料衍生自未分化的細胞。
56.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料收穫自用外科手術加入所述組合物的人。
57.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，在將材料加入椎間盤之前將所述幹細胞材料和非幹細胞材料分離。
58.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞材料大體上不含非幹細胞材料。
59.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述幹細胞放置在富含膠原的晶格中。
60.如權利要求59所述的椎間盤，其特徵在於，所述富含膠原的晶格材料收穫自用外科手術加入所述組合物的人。
61.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤還包含用外科手術植入的膠原基材料。
62.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤還包含有效誘導幹細胞分化成椎間盤細胞的材料。
63.如權利要求62所述的椎間盤，其特徵在於，所述有效誘導幹細胞分化成椎間盤細胞的材料包括選自下組的一個成員轉化生長因子(TGF)-□、抗壞血酸-2-磷酸、骨形態發生蛋白、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子、□-甘油磷酸、胰島素、胰島素樣生長因子、運鐵蛋白、氫化可的松。
64.如權利要求62所述的椎間盤，其特徵在於，所述有效誘導幹細胞分化成椎間盤細胞的材料包括具有所需表型的成熟細胞。
65.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤用外科手術在椎間盤中加入基本上由幹細胞材料構成的材料處理。
66.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤用外科手術加入幹細胞材料和交聯劑處理。
67.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤用外科手術加入幹細胞材料和放射造影劑處理。
68.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤用外科手術加入幹細胞材料和鎮痛藥處理。
69.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤用外科手術加入幹細胞材料和抗生素處理。
70.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤用外科手術加入幹細胞材料和至少一種多糖處理。
71.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤用外科手術加入幹細胞材料和蛋白聚糖處理。
72.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤用外科手術加入幹細胞材料和生長因子處理。
73.如權利要求39所述的椎間盤，其特徵在於，所述椎間盤用外科手術加入幹細胞材料和有效促進椎間盤癒合、修復、再生和/或恢復，和/或有助於合適的椎間盤功能的一種或多種其它細胞類型處理。
74.一種誘導幹細胞材料表達至少一種人椎間盤細胞特徵的方法，所述方法包括將幹細胞材料引入椎間盤間隙並使所述幹細胞材料與形態發生生長因子或分化因子接觸。
75.一種誘導幹細胞材料表達至少一種人椎間盤細胞特徵的方法，所述方法包括將幹細胞材料引入椎間盤間隙並使所述幹細胞材料與所需表型的成熟細胞接觸。
全文摘要
一種通過在椎間盤中施加幹細胞材料來擴張和/或修復椎間盤的方法。幹細胞可以是未分化的細胞，或者它們可以是已經分化但隨後去分化的細胞。可通過幹細胞暴露於誘導所需分化的試劑和/或環境來誘導它們表達至少一種人椎間盤細胞，如成纖維細胞、軟骨細胞或背索細胞的特徵。在一些實施方案中，幹細胞材料可連同膠原基材料一起提供，這種材料可以是富含膠原的晶格。幹細胞材料可以作為幹細胞分離物提供，這種分離物可以大體上不含非幹細胞材料。其它治療劑可以與幹細胞材料一起施用。
文檔編號A61F2/30GK1780648SQ200480011765
公開日2006年5月31日 申請日期2004年3月12日 優先權日2003年3月28日
發明者H·H·特裡優 申請人:Sdgi控股股份有限公司