抗mcp-1抗體、組合物、方法和用途的製作方法

2023-09-19 09:34:20 3

專利名稱：：抗mcp-1抗體、組合物、方法和用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及對至少一種人單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)蛋白質或其片段特異的抗體，包括特定部分或變體，以及抗獨特型抗體，和編碼此類抗MCP-1抗體的核酸，互補核酸，載體，宿主細胞，以及製備和使用其的方法，包括治療製劑、施用和裝置。相關領域包含76個胺基酸殘基的8.6kDa蛋白質人單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)(也稱為CCL-2),是細胞因子的趨化因子-P(或C-C)家族成員。趨化因子是低分子量(8-10kDa)、誘導型、分泌的、促炎趨化細胞因子，其已顯示在組織損傷位點處特定白細胞亞群的血管周圍變移和累積中起重要作用。取決於4個保守半胱氨酸的定位已定義了2個主要家族。CXC或a-趨化因子主要吸引嗜中性粒細胞，而CC或j3-趨化因子主要吸引單核細胞和除嗜中性粒細胞以外的其他白細胞(Leonard和Yoshimura等人，1990)。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)家族成員形成了趨化因子C-C家族的主要組分，且視為單核細胞、巨噬細胞和活化的淋巴細胞募集中涉及的主要趨化因子。考慮來自不同物種的MCP-1的同源性，人和猴MCP-1隻有2個胺基酸不同，從而揭示了97%的序列同一性，而包含125個胺基酸殘基的13.8kDa蛋白質-鼠MCP-l在分子大小和糖基化程度方面與人MCP-1不同。趨化因子受體屬於G蛋白偶聯的、7跨膜(7TM)結構域受體(GPCRs，也稱為蛇形受體)大家族。基于于1996年趨化細胞因子戈登研討會(GordonResearchConference)確定的受體命名法，結合CXC5趨化因子的趨化因子受體被命名為CXCRs,且結合CC趨化因子的受體被命名為CCRs。MCP-1已知結合且通過趨化因子受體CCR2發信號。CCR2是在許多細胞上表達的7個跨膜跨越G蛋白偶聯受體，所述細胞包括單核細胞、T細胞、B細胞和嗜鹼性粒細胞。2種MCP-1特異性受體CCR2A和CCR2B已被克隆，所述受體響應納摩爾(nM)濃度的MCP-1發信號。CCR2A(CC-CKR2A)和CCR2B(CC-CKR2A)代表編碼具有可變剪接的羧基尾的2種MCP-1特異性受體的2種cDNAs。MCP-1以高親和力結合2種同工型。MCP-1在表達CCR2B的細胞但不在表達CCR2A的細胞中誘導《丐流動。與表達CCR2A的細胞比較，5倍小的MCP-1在表達CCR2B的細胞中誘導趨化性。與人MCP-1具有某些功能和序列同源性的其他蛋白質是已知的。與MCP-1(GenBankNP—002973)尤其相似的是MCP-2(GenBankNP—005614)和嗜酸性粒細胞趨化因子(eotaxin)(GenBankP—51671);MCP-2與MCP-1具有61.8%的序列同一性，且嗜酸性粒細胞趨化因子-l與MCP-1具有63.2%的序列同一性。這些蛋白質在人穩態機制和病理學中的活性和受累譜範圍不如對於MCP-1同源物那樣充分了解。例如MCP-2(重新命名為CCL8)與MCP-1和MCP-3(重新命名為CCL8,GenbankNP—006264)緊密相關，且使用CCR1以及CCR2B作為其功能受體。MCP-3與命名為D6的受體結合。MCP-3還與CCR10和CCR1結合。MCP-3蛋白質(97個胺基酸)序列顯示與MCP-174%的同一性，和與MCP-258%的同源性。分泌的MCP-3在N糖基化方面與MCP-1不同。MCP-4(重新命名為CCL13,GenbankNP—005399)與3種已知的單核細胞趨化蛋白共有56-61%的序列同一性，且與嗜酸性粒細胞趨化因子-160%相同。MCP-4的功能似乎與MCP-3和嗜酸性粒細胞趨化因子的那些功能高度相似。如同MCP-3,MCP-4是對於單核細胞和T淋巴細胞的有效化學引誘物。它對於嗜中性粒細胞是無活性的。在單核細胞上，MCP-4與識別MCP-1、MCP-3、RANTES(CCL5)和嗜酸性粒細胞趨化因子的受體(CCR1和CCR3受體)結合，且顯示與嗜酸性粒細胞趨化因子-1完全交叉脫敏。MCP-5是鼠CC-趨化因子且與人MCP-1最緊密相關(66%的胺基酸同一性)。關於MCP-5的基因符號是SCYA12(重新命名為CCL12)。用趨化因子受體CCR2轉染的細胞已顯示對MCP-5應答。關於細胞因子和趨化因子的一般信息，參見http:〃www.copewithcytokines.de/cope.cgi,且關於目前的分類系統,參見ZlotnikA.,Yoshie0.2000.Chemokines:anewclassificationsystemandtheirroleinimmunity.Immunity12:121-127。125I-MCP-1與單核細胞結合，且斯卡查德圖分析表明單核細胞具有每個細胞1700個結合位點的最低限度，其Kd為~2nM(Yoshimura和Leonard,1990)。使用人單核細胞的隨後平衡結合實驗揭示每個細胞存在大約3000個結合位點，其Kd為~0.77nM(Ernst等人，1994)。125I-MCP-1還顯示與表達CCR2受體的dEoL-3細胞的高親和力結合，其Kd值為0.4nM(Sarau等人，1997),從而證實MCP-l與其受體的亞納摩爾親和力。為了鑑定MCP-l接觸其受體CCR2的區域，所有表面暴露的殘基用丙氨酸代替。某些殘基也突變成其他胺基酸，以鑑定特定位置處電荷、疏水性或芳香性的重要性。2個主要鹼性殘基的簇(R24、K35、K38、K49和Y13)由35A疏水溝分開，使結合水平減少15-100倍。數據暗示其中MCP-l的大表面積接觸受體，且許多弱相互作用的累積導致對於野生型(WT)蛋白質觀察到的35pM親和力的模型(Hemmerich等人，1999)。文獻中從2nM下降至35pM的親和力範圍可能是由於使用的測定和分別的測定限制。與人MCP-l具有某些功能和序列同源性的其他蛋白質是已知的。與MCP-l(GenBankNP—002973)尤其相似的是MCP-2(GenBankNP—005614)和嗜酸性粒細胞趨化因子(GenBankP—51671);MCP-2與MCP-l具有61.8%的序列同一性，且嗜酸性粒細胞趨化因子-1與MCP-l具有63.2%的序列同一性。這些蛋白質在人穩態機制和病理學中的活性和受累譜範圍不如對於MCP-1同源物那樣充分了解。例如MCP-2與MCP-l和MCP-3(GenbankNP—006264)緊密相關，且使用CCR1以及CCR2B作為其功能受體。MCP-3與命名為D6的受體結合。MCP-3還與CCR10結合。MCP-3蛋白質(97個胺基酸)序列顯示與MCP-l74%的同一性，和與MCP-258%的同源性。分泌的MCP-3在N糖基化方面與MCP-l不同。MCP-4(GenbankNP—005399)與3種已知的單核細胞趨化蛋白共有56-61%的序列同一性，且與嗜酸性粒細胞趨化因子-l60%相同。MCP-4的功能似乎與MCP-3和嗜酸性粒細胞趨化因子的那些功能高度相似。如同MCP-3,MCP-4是對於單核細胞和T淋巴細胞7的有效化學引誘物。它對於嗜中性粒細胞是無活性的。在單核細胞上，MCP-4與識別MCP-l、MCP-3、RANTES(CCR2)的受體結合。在嗜酸性粒細胞上，MCP-4具有與MCP-3、RANTES和嗜酸性粒細胞趨化因子相似的功效和效力。MCP-4與嗜酸性粒細胞趨化因子共有受體(CCR1和CCR3),且顯示與嗜酸性粒細胞趨化因子-1完全交叉脫敏。能夠結合MCP-1的其他抗體已一皮報導JP9067399公開了從分離的血細胞獲得的抗體，且JP05276986公開了分泌IgM抗人MCP-l的雜交瘤。最近能夠結合多個P-趨化因子包括MCP-1的抗體(WO03048083)以及也結合嗜酸性粒細胞趨化因子的MCP-1結合抗體(US20040047860)被公開。因此，需要提供對人MCP-1特異的人抗體，其用於在治療中使用，以減少或消除MCP-1依賴性疾病的症狀，以及超過已知抗體或其片段的改善。發明概述本發明提供了如本文描述和使得可行的，與本領域已知的那些組合的，分離的人、靈長類動物、嚙齒類動物、哺乳動物、嵌合、人源化和/或CDR嫁接抗MCP-1抗體及其他免疫球蛋白衍生蛋白質、片段、切割產物和其他特定部分及其變體，以及抗MCP-1抗體組合物、編碼或互補核酸、載體、宿主細胞、組合物、製劑、裝置、轉基因動物、轉基因植物，以及製備和使用其的方法。除了如本文描迷的本發明的抗體組合物之外，本發明的抗體由其對人MCP-1的親和力、對人MCP-1的特異性和阻斷人MCP-1的生物活性的能力限定。本發明還提供了至少一種分離的抗MCP-1抗體，例如但不限於，如本文描述的至少一種抗體、抗體融合蛋白或片段。根據本發明的抗體包括包含分子的任何蛋白質或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少部分，例如但不限於，至少一個配體結合結構域，例如但不限於，如表4A、B、D和E(SEQIDNO:6-26中提供的重鏈或輕鏈可變區、重鏈或輕鏈的互補性決定區(CDR)或其配體結合部分；和任選地與構架區(例如，表4C(SEQIDN0:2-5)中描述的FR1、FR2、FR3、FR4或其片段功能性結合，進一步任選包含人免疫球蛋白的至少CH1、鉸鏈、CH2或CH3。至少一種抗體胺基酸序列可以進一步任選包含如本文描述或如本領域已知的至少一種特定置換、插入或缺失。在實施方案中，抗體的配體結合部分包含SEQIDNO:27和28。在一個方面，本發明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含包括SEQIDNOS:27或28的至少一個可變區。在另一方面，本發明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含(i)IDNOS:6、7和9的所有重鏈互補性決定區(CDR)胺基酸序列；或(ii)SEQIDNOS:13、14和16的所有輕鏈CDR胺基酸序列。在一個方面，本發明提供了包含編碼特異性抗MCP-1抗體的多核苷酸、與其互補或雜交的分離的核酸分子，其包含至少一種特定序列、結構域、部分或其變體。本發明進一步提供了包含所述抗MCP-1抗體核酸分子的重組載體，包含此類核酸和/或重組載體的宿主細胞，以及製備和/或使用此類抗體核酸、載體和/或宿主細胞的方法。本發明的至少一種抗體結合對至少一種MCP-1蛋白質或變體或衍生物例如SEQIDNO:1中提供的那些特異的至少一種特定表位。所述至少一種表位可以包含包括所述蛋白質的至少一個部分的至少一個抗體結合區域，所述表位優選包含其至少一個部分的至少l-5個胺基酸，例如但不限於，所述蛋白質的至少一個功能性、細胞外、可溶、親水、外部或細胞質結構域，或其任何部分。所述至少一種抗體可以任選包含如SEQIDNOS:6、7、9、13、14和16提供的至少一個互補性決定區(CDR)(例如分別如SEQIDNos:27和28提供的重或輕鏈可變區的CDR1、CDR2或CDR3)的至少一個特定部分；和任選進一步包含至少一個恆定或可變構架區或其任何部分，其中所述抗體阻斷、抑制或阻止至少一種活性，例如但不限於，MCP-1與細胞表面上的受體結合、CCR2受體內在化、MCP-1刺激的Ca2+動員或任何其他合適的已知MCP-1測定。抗MCP-1抗體因此可以根據已知方法篩選相應活性，例如但不限於，針對MCP-1蛋白質的至少一種生物活性。本發明進一步提供了針對本發明的至少一種MCP-1抗體的至少一種MCP-1抗獨特型抗體。抗獨特型抗體包括包含分子的任何蛋白質或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少部分，例如但不限於，至少一個配體結合部分(LBP)，例如但不限於，重或輕鏈的互補性決定區9(CDR),或其配體結合部分，重鏈或輕鏈可變區，重鏈或輕鏈恆定區，構架區，或其任何部分，它們可以摻入本發明的抗獨特型抗體內。本發小鼠、兔、大鼠、4齒類動:、^長類動物等。一、在一個方面，本發明提供了包含編碼至少一種MCP-1抗獨特型抗體的多核苷酸、與其互補或雜交的分離的核酸分子，其包含至少一種特定序列、結構域、部分或其變體。本發明進一步提供了包含所述MCP-1抗獨特型抗體編碼核酸分子的重組載體，包含此類核酸和/或重組載體的宿主細胞，以及製備和/或使用此類抗獨特型抗體核酸、載體和/或宿主細月包的方法。本發明還提供了用於在宿主細胞中表達至少一種抗MCP-1抗體或MCP-1抗獨特型抗體的至少一種方法，其包括如本文所述的在其中至少一種抗MCP-1抗體以可檢測和/或可回收的量表達的條件下培養宿主細胞。本發明還提供了至少一種組合物，其包含(a)如本文描述的分離的MCP-1抗獨特型抗體編碼核酸和/或抗體；和(b)合適的載體或稀釋劑。根據已知載體或稀釋劑，載體或稀釋劑可以任選是藥學可接受的。組合物可以任選進一步包含至少一種另外的化合物、蛋白質或組合物。本發明進一步提供了至少一種抗MCP-1抗體方法或組合物，如本領域已知的和/或如本文描述的，其用於施用治療有效量以調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關狀況和/或在相關狀況之前、之後或期間。本發明還提供了遞送治療或預防有效量的根據本發明的至少一種抗MCP-1抗體的至少一種組合物、裝置和/或方法。本發明進一步提供了至少一種抗MCP-1抗體方法或組合物，如本領域已知的和/或如本文描述的，其用於診斷細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關狀況和/或在相關狀況之前、之後或期間。本發明還提供了遞送根據本發明的至少一種抗MCP-1抗體用於診斷的至少一種組合物、裝置和/或方法。在一個方面，本發明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含包括SEQIDNOS:27或28的至少一個可變區。在另一方面，本發明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含(i)SEQIDNOS:6、7和8或9的所有重鏈互補性決定區(CDR)胺基酸序列；或(ii)SEQIDNOS:13、14和15或16的所有輕鏈CDR胺基酸序列。在另一方面，本發明提供了至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體，其包含(i)SEQIDNOS:6、7和8或9的所有重鏈互補性決定區(CDR)胺基酸序列；或(ii)SEQIDNOS:13、14和15或16的所有輕鏈CDR的胺基酸序列中的至少一個。所述至少一種抗體可以任選進一步具有下列至少一種以選自至少10—9M、至少10-1QM、至少10—"M或至少1(T12M的至少一種的親和力結合MCP-1;基本上中和至少一種MCP-1蛋白質的至少一種活性。還提供的是編碼至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體的分離的核酸；包含分離的核酸的分離的核酸載體，和/或包含分離的核酸的原核或真核宿主細胞。宿主細胞可以任選是選自NOS、COS-l、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、YB2/0、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、或淋巴瘤細胞、或其任何衍生、無限增殖化或轉化細胞中的至少一種。還提供的是生產至少一種抗MCP-1抗體的方法，其包括在體外、體內或原位條件下翻譯抗體編碼核酸，從而使得MCP-1抗體以可4企測或可回收的量表達。還提供的是包含至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體和至少一種藥學可接受的載體或稀釋劑的組合物。還提供的是用於診斷或治療細胞、組織、器官或動物中的MCP-1相關狀況的方法，其包括(a)使組合物與細胞、組織、器官或動物接觸，或給細胞、組織、器官或動物施用組合物，所述組合物包含有效量的本發明的至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體。還提供的是包含本發明的至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體的醫學裝置，其中所述裝置適合於經由選自下列的至少一種形式接觸或施用至少一種MCP-1抗體腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、關節內(intrarticular)、支氣管內、腹內、嚢內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內(intracelebellar)、腦室內、結腸內、頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、一見網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、病灶內、快速灌注(bolus)、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內或經皮。還提供的是用於人藥物或診斷用途的製品，其包含包裝材料和容器，後者包含溶液、顆粒或冷凍乾燥形式的本發明的至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體。還提供的是用於生產本發明的至少一種分離的哺乳動物抗MCP-1抗體的方法，其包括提供能夠表達可回收量的抗體的宿主細胞或轉基因動物或轉基因植物或植物細胞。本發明中進一步提供的是通過上述方法生產的至少一種抗MCP-1抗體。本發明進一步提供了本文描述的任何發明。序列表簡述SEOIDNO:描述1用於選擇抗MCP-1結合劑的人MCP-1(CCL2)和變體2VH1A重鏈可變序列FR1、CDR1、FR2、CDR2變體、FR3、CDR3、FR43VH3重鏈可變序列FR1、CDR1、FR2、CDR2變體、FR3、CDR3、FR44k3輕鏈可變序列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3變體、FR45輕鏈可變序列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3變體、FR46VH1ACDR1所有MOR034717VH1ACDR23781、3790、CNTO8888VH1ACDR238999VH1ACDR3所有MOR0347110VH3CDR1所有MOR0354811VH3CDR23744、374712VH3CDR3所有MOR0354813k3CDR1所有MOR0347114k3CDR2所有MOR0347115k3CDR3378116k3CDR33790、CNT088812tableseeoriginaldocumentpage13發明詳述本發明提供了至少一種純化的、分離的、重組和/或合成的抗MCP-l人、靈長類動物、嚙齒類動物、哺乳動物、嵌合、人源化、工程改造或CDR嫁接抗體和對於其的MCP-1抗獨特型抗體，以及包含至少一種多核芬酸的組合物和編碼核酸分子，所述多核香酸編碼至少一種抗MCP-1抗體或抗獨特型抗體。本發明進一步包括但不限於，製備和使用此類核酸和抗體和抗獨特型抗體的方法，包括診斷和治療組合物、方法和裝置。引用本文引用的所有出版物或專利都整體引入本文作為參考，因為它們顯示本發明時的技術發展水平，和/或提供了本發明的描述和實現。出版物指任何科學或專利出版物，或以任何介質形式可獲得的任何其他信息，包括所有記錄的、電子的或印刷的形式。下列參考文獻整體引入本文4乍為參考Ausubel等人,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY(1987-2004);Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，ColdSpringHarbor,NY(1989);Harlow禾口Lane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY(1989);Colligan等人，eds.,CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY(1994-2004);Colligan等人,CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY，(1997-2004)。縮寫aa:胺基酸；BSA:牛血清清蛋白；CDR:互補性決定區；ECL:電化學發光；HuCAL:人組合抗體文庫；HSA:人血清清蛋白；MCP-1:單核細胞趨化蛋白-l;Ig:免疫球蛋白；IPTG:異丙基(3-D-硫代半乳糖香；mAb:單克隆抗體；PBS:磷酸緩沖鹽水，pH7.4;SET:溶液平衡滴定；VH:免疫球蛋白重鏈可變區；VL:免疫球蛋白輕鏈可變區；定義如本文4吏用的，"抗CCL2抗體"、"抗MCP-1抗體"、"抗MCP-1抗體部分"、或"抗MCP-1抗體片段"和/或"抗MCP-l抗體變體"等包括包含分子的任何蛋白質或肽，所述分子包含免疫球蛋白分子的至少部分，例如但不限於，重鏈或輕鏈的至少一個互補性決定區(CDR)或其配體結合部分，重鏈或輕鏈可變區，重鏈或輕鏈恆定區，構架區，或其任何部分，或MCP-1受體或結合蛋白的至少一個部分，它們可以摻入本發明的抗體內。此類抗體任選進一步影響特定配體，例如但不限於其中此類抗體體外、原位和/或體內調節、減少、增加、拮抗、激動(angonize)、緩和、減輕(deviates)、阻斷、抑制、消除和/或幹擾至少一種MCP-1活性或結合，或MCP-1受體活性或結合。作為非限制性例子，本發明的合適的抗MCP-1抗體、特定部分或變體可以結合至少一種MCP-1、或其特定部分、變體或結構域。如本文使用的，"表位"指能夠與抗體特異性結合的蛋白質片段或特徵。表位通常由分子的化學活性表面基團例如胺基酸或糖側鏈組成，且通常具有特定的三維結構特徵，以及比電荷特徵。構象和非構象表位的區別在於與前者而不是後者的結合在變性溶劑的存在下喪失。包括由MCP-1分子的構象摺疊產生的蛋白質表位，所述蛋白質表位在來自MCP-1分子線性序列的不同部分的胺基酸在3維空間中以緊密接近性集合時出現。"MCP-1"意指在NCBI記錄登記號NP一002973中參考的76個胺基酸的序列，且名稱不一地稱為MCP(單核細胞趨化蛋白)、SMC-CF(平滑肌細胞趨化因子)、LDCF(淋巴細胞衍生趨化因子)、GDCF(神經膠質瘤衍生單核細胞趨化因子)、TDCF(肺瘤衍生趨化因子)、HC11(人細胞因子11)、MCAF(單核細胞趨化及活化因子)。基因符號是14SCYA2，在人染色體17上的JE基因，且新名稱是CCL2(Zlotnik,Yoshie2000.Immunity12:121-127)。JE是人MCP-1/CCL2的小鼠同源物。如本文使用的，術語"人抗體，，指其中基本上蛋白質的每個部分(例如CDR、構架、CL、Ch結枸域(例如Ch1、Ch2、CH3)、鉸鏈、(VL、VH))都來源於人種系免疫球蛋白基因序列的重組事件或來自成熟人抗體序列的抗體。除了從人中分離的抗體以外，此類人抗體可以通過用人免疫球蛋白種系基因免疫能夠發動免疫應答的轉基因小鼠來獲得(Lonberg等人,尺ev/m應wo/13(1):65-93(1995)和Fishwald等人，A^B,o&c/wo/14(7):845-851(1996)),或可以如本文所述選自人抗體譜文庫。此類人基因序列的來源可以在任何合適的文庫中找到,例如VBASE,人抗體基因(http:〃www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc)或其翻i,產物資料庫，或在http:〃people.crvst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/上,它給出了基於其胺基酸相似性分類成分組的人抗體。在這個定義的範圍內的是複合抗體或人複合抗體的功能片段，後者包括來自一種或多種人抗體序列的構架區和來自2種不同的人或非人來源的CDR區。在"人抗體"定義內的是複合抗體或人複合抗體的功能片段，後者包含來自種系和重排人抗體序列的構架區和來自2種不同來源抗體的CDR區。依照本公開內容的人複合抗體或人複合抗體的功能片段包括來自一種或多種人抗體序列的構架區，和來源於人或非人抗體序列的CDR區，或可以是完全合成的。因此，人抗體不同於嵌合或人源化抗體。應當指出人抗體可以由能夠表達功能性重排的人免疫球蛋白(例如重鏈和/或輕鏈)基因的非人動物或原核或真核細胞產生。此外，當人抗體是單鏈抗體時，它可以包含在天然人抗體中沒有發現的接頭肽。例如，Fv可以包含連接重鏈可變區和輕鏈可變區的接頭肽，例如2到約8個甘氨酸或其他胺基酸殘基。此類接頭肽視為具有人起源。"人源化"形式的非人(例如鼠)抗體是具有來源於非人免疫球蛋白的基本上置換的序列部分的嵌合抗體。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體的CDR(互補性決定區，其也稱為高變區)殘基由具有所需特異性、親和力和能力的來自非人物種(供體抗體)例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的CDR殘基置換。在某些情況下，人免疫球蛋白的構架區(FR)殘基由相應的非人殘基置換。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中沒有發現的殘基。15進行這些修飾以進一步精製抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含基本上所有至少一個，且一般是2個可變結構域，其中所有或基本上所有高變區對應非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有FRS是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恆定區(Fc),—般是人IgG免疫球蛋白的那種。關於更多的細節，參見Jones等人，Nature321:522-525(1986);Reichmann等人，Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.StructBiol.2:593-596(1992)。如本文使用的，抗體的Kd指抗體對預定抗原的解離常數KD，且是抗體對特定把的親和力的測量。高親和力抗體對於預定抗原具有10—8M或更少的Kd,更優選10^M或更少，且再更優選10"Gm或更少。如本文使用的，術語"K化"或"KD"、或"Kd"意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。"Kd"是解禹速率(k2)也稱為"解離率(off-rate)(k。ff)"與結合速率(kl)或"結合率(on-rate)(k。n)"的比率。因此，KD等於k2/k!或k。ff/k。n，且表示為摩爾濃度(M)。它遵循下列原則，Kd越小，結合越強。因此與1(T9M(或InM)比較，1(T6M(或1微摩爾)的KD表明弱結合。如本文使用的，術語"對......特異"和"特異性結合"和"特異地結合"指抗體以比對於其他抗原或蛋白質更大的親和力與預定抗原結合。一般地，抗體以10^M或更少的解離常數(KD)結合，且與預定抗原結合的KD為其與除預定抗原以外的非特異性抗原(例如BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)結合的Kd的至少1/2。短語"識別抗原的抗體"和"對抗原特異的抗體"在本文中可與術語"與抗原特異性結合的抗體"或"抗原特異性抗體"例如MCP-1特異性抗體互換使用。1.本發明的抗體的製備對人MCP-1蛋白質或其片段，例如分離的和/或MCP-1蛋白質或其部分(包括合成分子，例如合成肽)，特異的人抗體的製備可以使用本領域已知的任何合適技術來進行。人抗體可以使用本領域已知的各種技術來產生。在一個實施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，其中那種噬菌體文庫表達人抗體(Vaughanetloal.NatureBiotechnology14:309-314(1996):Sheets等人PITAS(USA)95:6157-6162(1998));Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.，227:381(1991);Marks等人丄Mol.Biol.,222:581(1991))。人抗體還可以通過將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物內來製備，例如其中內源性免疫球蛋白基因已被部分或全部滅活的小鼠。例如，包含功能性重排的人免疫球蛋白重鏈轉基因，以及包含來自可以經歷功能性重排的人免疫球蛋白輕鏈基因座的DNA的轉基因的轉基因小鼠，可以用人MCP-1或其片段免疫以引發抗體的產生。需要時，抗體產生細胞可以被分離，且雜交瘤或其他無限增殖化的抗體產生細胞可以如本文描述的和/或如本領域已知的進行製備。可替代地，抗體、特定部分或變體可以使用編碼核酸或其部分在合適的宿主細胞中表達。用合適抗原攻擊後，觀察到人抗體產生，所述人抗體在所有方面都非常類似在人中可見的那種，包括基因重排、裝配和抗體譜。這種方法在例如美國專利號5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016,以及下列科學出版物中描述Marks等人，Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg等人，Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-13(1994);Fishwild等人，NatureBiotechnology14:845-51(1996);Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996);Lonberg和Huezar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。可替代地，人抗體可以經由產生針對耙抗原的抗體的人B淋巴細胞(此類B淋巴細參見，例i口Cole等人,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,第77頁(1985);Boerner等人，J.Immunol.,147(1):86-95(1991);和美國專利號5,750,373。抗體產生細胞還可以從人或其他合適動物的外周血，或優選脾或淋巴結獲得，所述人或其他合適動物已用目的抗原進行免疫。任何其他合適的宿主細胞還可以用於表達編碼本發明的抗體、其特定片段或變體的異源或內源核酸。融合細胞(雜交瘤)i通過有限;釋或細胞分選其他已:口方法進行克隆。、產生具有所需特異性的抗體的細胞可以通過合適測定(例如ELISA)進行選擇。在一種方法中，雜交瘤通過使合適的無限增殖細胞系(例如骨髓瘤細胞系，例如但不限於，Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-l、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2SA3、Sp2MAI、Sp2SSl、Sp2SA5、U937、MLA144、ACTIV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、17COS、RAJI、NIH3T3、HL-60、MLA144、NAMAIWA、NEUR02A等，或異種骨髓瘤(heteromylomas),其融合產物，或由其衍生的任何細胞或融合細胞，或如本領域已知的任何其他合適的細月包系，參見，例如www.atcc.org，www.lifetech.com.,等,與抗體產生糹田月包融合來產生,所述抗體產生細胞例如但不限於分離或克隆的脾、外周血、淋巴、扁桃體、或其他免疫或包含B細胞的細胞，或任何其他細胞，它們表達重或輕鏈恆定或可變或構架或CDR序列，作為內源或異源核酸、作為重組或內源的、病毒、細菌、藻類、原核生物、兩棲動物、昆蟲、爬^f亍動物、魚、哺乳動物、嚙齒類動物、馬、綿羊、山羊、羊、靈長類動物、真核生物、基因組DNA、cDNA、rDNA、線粒體DNA或RNA、葉綠體DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、單、雙、或三鏈、雜交的、等或其任意組合。參見，例如整體引入本文作為參考的Ausubel,同上，和Colligan,Immunology,同上，第2章。與人MCP-1結合且包含限定的重或輕鏈可變區的人抗體可以使用合適方法例如噬菌體展示(Katsube,Y.等人，/^JA^/.MeJ,1(5):863-868(1998))進行製備。可以使用產生或分離具有所需特異性的抗體的其他合適方法，其包括但不限於從肽或蛋白質文庫中選擇重組抗體的方法(例如但不限於，噬菌體、核糖體、寡核苷酸、RNA、cDNA等，展示文庫；例如如可乂人下歹'J獲4尋的CambridgeantibodyTechnologies,Cambridgeshire,UK;MorphoSys,Martinsreid/Planegg,DE;Biovation,Aberdeen,Scotland,UK;Biolnvent,Lund,Sweden;DyaxCorp.,Enzon，Affymax/Biosite;Xoma,Berkeley,CA;Ixsys。參見，例如EP368,684,PCT/GB91/01134;PCT/GB92/01755;PCT/GB92/002240;PCT/GB92/00883;PCT/GB93/00605;US08/350260(5/12/94);PCT/GB94/01422;PCT/GB94/02662;PCT/GB97/01835;(CA窗RC);WO90/14443;WO90/14424;WO90/14430;PCT/US94/1234;W092/18619;WO96/07754;(Scripps);W096/13583,WO97/08320(MorphoSys);WO95/16027(Biolnvent);WO88/06630;WO90/3809(Dyax);US4,704,692(Enzon);PCT/US91/02989(Affymax);WO畫6283;EP371998;EP550400;(Xoma);EP229046;PCT/US91/07149(Ixsys);或隨機產生的肽或蛋白質-US5723323,5763192，5814476,5817483，5824514,5976862,WO86/05803,EP590689(Ixsys,現在的AppliedMolecularEvolution(AME),各自都完整地引入本文作為參考)，或依賴轉基因動物免疫接種的那種(例如SCID小鼠，Nguyen等人，Microbiol.Immunol.41:901-907(1997);Sandhu等人，Crit.Rev.Biotechnol.16:95-118(1996);Eren等人,Immunol.93:154-161(1998),各自整體引入本文作為參考。具體實施方案申請人例示了從噬菌體展示人Fab文庫開始選擇和製備人抗體的方法，所述人抗體具有針對人MCP-1的所需親和力、特異性和生物活性。總之，從所有10次淘選篩選17856個克隆，從而導致產生1104個初步命中和最後26個獨特Fabs。為了提供例示保持與天然存在的MCP-1受體結合能力的抗原的獨特配體，化學合成人MCP-1及其類似物或"突變蛋白質"且進行修飾以用於在選擇、親和力和生物測定中特別使用。人MCP-1lie41和人MCP-1Tyr"用於初步固相淘選以及抗體選擇和親和力成熟測定的其他方面，且與MCP-1突變蛋白質的生物素化形式Ile41、Lys(生物素-PEG4)69)和(Ile41，Lys(生物素-PEGj75(SEQIDNO:1)—樣如本文描述。因為26個獨特Fabs中無一在特定的生物測定中具有測量為KD<0.5nM的親和力或所需IC5o值，所以成熟是必需的。用於親和力成熟的候選物作為Fabs進行選擇，且分別的IgGs與成熟過程平行進行分析。選擇標準是1)在整個細胞受體結合測定中的活性，2)在鈣動員測定中的活性，3)對人MCP-1的親和力，4)對人MCP-1的特異性，和5)對短尾猴(cyno)MCP-1的親和力和與天然MCP-1的結合。溶液中的MCP-1的Fab捕獲才莫式Biacore親和力測量對於4巴成熟候選物分等良好地起作用，且親和力在49-406nM範圍內。最佳的親本Fab顯示50nM的親和力，從而表明親和力必須最優化至少100倍以達到親和力成功標準。此外與短尾猴和天然人MCP-1的結合可以在Fab捕獲模式中檢測到，這是關於成熟的另外先決條件。與短尾猴MCP-1的親和力在與對於人MCP-1相同的範圍內。由於可能的修飾，如例如糖基化，必須顯示抗體不僅識別合成或重組MCP-1,而且還識別天然MCP-1,所述天然MCP-1內源性表達和從PANC-1人細胞上清液中純化。對MCP-1的特異性在Biacore的抗體捕獲才莫式中進行測量，其中加入100nM各種趨化因子且檢測結合信號。用於成熟的大多數候選Fab是特異的，而2個顯示對同源物趨化因子相同的交叉反應性。Fab的非常重要的特徵是中和活性，且設立了幾種不同的測定以分析這種活性。1251MCP-1THP-1細胞結合測定是最靈敏的測定法，這在最優化後是特別重要的。親本Fabs顯示10-650nM的ICso值。除了放射性配體結合測定之外，計劃了其他次級生物測定法以證明在MCP-1下遊信號傳導途徑的不同水平上的中和活性。吸引單核細胞是MCP-1的主要功能之一，但最可能是由於缺少活性、共純化因子或內毒素，親本Fabs在趨化性測定中不起作用，且因此同意只測試分別的IgGl,而不是在這種測定中設法使Fab起作用。另一個下遊信號傳導事件是鈣釋放到細胞質內。事實上在放射性配體結合測定中顯示中和活性的所有Fabs都在THP-1細胞中抑制MCP-1誘導的4丐動員，其IC5o為0.1-3pM。必須顯示親本Fabs的生物活性在轉化成IgG形式後被完全保留。如預期的，所有分別的IgG在放射性配體結合測定、鈣動員測定和甚至趨化性測定中都顯示活性，從而最終證明所有IgGs都保留了在Fab形式中可見的活性且甚至抑制MCP-1誘導的趨化性。對於親和力成熟，根據其特徵選擇了在放射性配體結合測定中具有10-400nMKd和10-650nM1。5值的7個不同Fabs。隨後將它們分成3組用於文庫克隆和後續選擇。L-CDR3和H-CDR2最優化平行進行。產生高質量的文庫。對於選擇過程使用溶液淘選，且選擇的嚴格性通過減少抗原、解離率選擇和非常長的洗滌步驟來增加。對於隨後的篩選過程，使用允許對最優化結合劑高通量分等的BioVeris篩選。篩選對改善的結合劑的鑑定非常有效地起作用。此外可以鑑定在L-CDR3和H-CDR2中最優化的Fabs，從而使得可能對MOR03471和MOR03548衍生物交叉克隆。特別是MOR03471衍生物的交叉克隆非常成功，從而導致與2個最優化的起始Fabs比較再提高100倍的親和力。在17個最優化Fabs中，選擇16個用於詳細表徵，且最終符合所有成功標準的4個結合劑來源於親本MOR03471,2個僅在L-CDR3中最優化，且2個來自交叉克隆。親和力成熟的候選物分析和序列在實施例3和4、表4-6、以及SEQIDNos:2-28中詳述。成熟後，最優化結合劑的親和力不能在Biacore中進行分析，這主要是因為達到了檢測極限。在MorphoSys，使用非常靈敏的Ko測定方20法，其是與BioVeris技術組合的溶液平衡滴定(SET)。單價解離常數可以通過對於Fab和IgG的合適擬合模型進行計算。除親和力測量之夕卜，這種方法用於交叉反應性研究。最終候選物的親和力在BioVeris中測量對於人和短尾猴MCP-1為10-320pM,且在Centocor通過KinexA證實。使用BioVeris的特異性測試顯示所有測試的16個Fabs和IgGs與人MCP-2沒有交叉反應性。幾個Fab和IgG還顯示與人嗜酸性粒細胞趨化因子沒有明顯的交叉反應性。根據成功標準，特異性標準確定為在Biacore抗體捕獲才莫式中不與100nM同源物人MCP-2、3、4以及100nM人嗜酸性粒細胞趨化因子1、2和3結合。在BiacoreFab捕獲衝莫式中，所有選擇的Fabs都顯示與MCP-2和嗜酸性粒細胞趨化因子不同程度的交叉反應性。與IgGs比較Fabs推定的略微增加的不穩定性和趨化因子的一般非特異性結合能力可能已促成非特異性結合。幾個選擇的IgG顯示與同源物趨化因子沒有顯著結合信號，且在BiacoreIgG捕獲模式中符合特異性成功標準。在溶液平衡滴定實驗中，使用BioVeris，甚至幾個Fabs顯示沒有交叉反應性。為了分析在Biacore中檢測的對MCP-2的Fab結合活性是否轉變成中和活性，放射性配體全細胞結合測定在Centocor被開發。在這種測定中測試的Fabs顯示沒有顯著抑制1251標記的MCP-2與Thp-1細胞上的CCR2受體結合(IC5022)。由於需要少量的lng/mlMCP-1,所以放射性配體結合測定是這個計劃中最靈敏的測定，測定的IC5o極限對於Fab為約100pM,且對於IgG甚至為20pM。除了親和力之外，這個測定中的活性用於分等和選擇最優化結合劑用於詳細表徵。在最優化過程中活性中的整體改善最高達lOOOx倍，且最後1個MOR03471衍生的Fab-MOR03878顯示110pM的最高親和力。所有測試的IgG在放射性配體結合測定中保留活性。4個最終的IgG候選物MOR03781、MOR037卯、MOR03850和MOR03878的IC5o值為20-50pM,與Fabs的分別活性比較甚至略微更佳。關於改善的活性的一個原因是二價IgG每個分子中和2個MCP-l(係數2x)。IgGs來自純的按比例增大的產品且因此另一個原因可能是抗體的純度、穩定性或活性。作為次級生物測定，成功開發了基於FACS的測定，其測量MCP-1誘導的CCR2受體內在化的抑制。最後該測定甚至允許IC50測定和分等。最終的4個候選FabsMOR03790、MOR03850、MOR03781和MOR03878顯示3-5nM的ICso值。21需要天然MCP-1以證實針對合成或重組MCP-1分離的MCP-1抗體的活性。天然MCP-1從PANC1上清液中進行純化且用於誘導鈣釋放。:鈣動員。所有MOR03;48衍生的預先選擇的Fabs在竟^ELISA中完全抑制C775與MCP1的結合。所有MOR03471衍生的預先選擇的Fabs在ELISA中顯示部分(~60%)竟爭，從而表明表位是至少重疊的。最終4個抗體MOR03781、MOR03790、MOR03850和MOR03878滿足所有的成功標準，包括特異性標準和天然MCP-1的中和。生產抗體的其他合適方法用於生產本發明抗體的其他方法如本領域已知的和/或如本文描述的能夠生產人抗體譜。此類技術包括但不限於核糖體展示(Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:4937-4942(1997年5月)；Hanes等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135(1998年11月));單細胞抗體生產技術(例如選擇的淋巴細胞抗體法("SLAM")(美國專利號5,627,052，Wen等人,J.Immunol.17:887-892(1987);Babcook等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:7843-7848(1996));;凝膠微滴和流式細胞術(Powell等人，Biotechnol.8:333-337(1990);OneCellSystems,Cambridge,MA;Gray等人，丄Imm.Meth.182:155國163(1995);Kenny等人，Bio/Technol.13:787-790(1995));B細胞選擇(Steenbakkers等人，Molec.Biol.Reports19:125-134(1994);Jonak等人,ProgressBiotech,第5巻,InVitroImmunizationinHybridomaTechnology,Borrebaeck,ed.，ElsevierSciencePublishersB.V.,Amsterdam,Netherlands(1988))。域眾所周知的。一般地，人源化或工程改造的抗體具有來自非人來源的一個或多個胺基酸殘基，所述非人來源例如但不限於小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動物或其他哺乳動物。這些人胺基酸殘基通常稱為"輸入"殘基，它們一般取自已知人序列的"輸入"可變、恆定或其他結構域。已知的人Ig序列是本領域眾所周知的且可以是任何已知序列。用於最優化人工改造的人源化抗體的結合、構象和減少的免疫原性的各種策略已得到描述，參見，例如Presta等人JImmunol.151:2623-2632,1993;WO200302019和WO2005080432。此類輸入序列可以用於減少免疫原性，或減少、增強或修飾如本領域已知的結合、親和力、結合率、解離率、抗體親抗原性、特異性、半衰期、或任何其他合適的特徵。一般部分或全部非人或人CDR序列被維持，而可變和恆定區的非人序列用人或其他胺基酸置換。抗體還可以任選是人源化的，保留對抗原的高親和力和其他有利的生物學特性。為了達到這個目標，人源化抗體還可以任選使用親本和人源化序列的三維模型通過親本序列和各種概念上的人源化產物的分析過程進行製備。三維免疫球蛋白模型通常是可用的且對於本領域技術人員是熟悉的。舉例說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列的可能三維構象結構的電腦程式是可用的。這些展示的檢查允許分析在候選免疫球蛋白序列的功能發揮中殘基的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能力的殘基。以這種方式，可以從共有和輸入序列中選擇和組合FR殘基，從而使得達到所需抗體特徵，例如對靶抗原增加的親和力。一般而言，CDR殘基直接且基本上大多數涉及影響抗原結合。本發明抗體的人源化或工程改造可以使用任何已知方法進行，例如但不限於下列中描述的那些Winter(Jones等人，Nature321:522(1986);Riechmann等人，Nature332:323(1988);Verhoeyen等人，Science239:1534(1988)),Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992);Presta等人，J.Immunol.151:2623(1993),美國專利號5723323、5976862、5824514、5817483、5814476、5763192、5723323、5,766886、5714352、6204023、6180370、5693762、5530101、5585089、5225539;4816567、PCT/:US98/16280、US96/18978、US91/09630、US91/05939、US94/01234、GB89/01334、GB91/01134、GB92/01755;WO90/14443、WO90/14424、WO90/14430、EP229246，各自整體引入本文作為參考，包括其中引用的參考文獻。可以生產與人抗原結合的人抗體譜的轉基因小鼠可以通過已知方法產生(例如但不限於授予Lonberg等人的美國專利號5,770,428、5,569,825、5,545,806、5,625,126、5,625,825、5,633,425、5,661,016和5,789,650;Jakobovits等人WO98/50433，Jakobovits等人WO98/24893,Lonberg等人WO98/24884,Lonberg等人WO97/13852,Lonberg等人23WO94/25585，Kucherlapate等人WO96/34096，Kucherlapate等人EP0463151Bl,Kucherlapate等人EP0710719Al,Surani等人美國專利號5,545,807,Bruggemann等人WO90/04036,Bruggemann等人EP0438474Bl,Lonberg等人EP0814259A2，Lonberg等人GB2272440A,Lonberg等人A^we368:856-859(1994),Taylor等人，/"f./mww"o/.6(4)579-591(1994),Green爭乂，7Wm^eGe"e"cs7:13-21(1994),Mendez等人，胸群G置"cs15:146-156(1997),Taylor等人，7Vwc/e/c爿c/t^尺^'earc/z20(23):6287-6295(1992),Tuaillon等人，/VocA^W爿cm/S"'t/&490(8)3720-3724(1993)，Lonberg等人，/"f"ev/mmw"o/13(1):65-93(1995)和Fishwald等人，Ato^Wec/mo/14(7):845-851(1996)，所述參考文獻各自整體引入本文作為參考)。一般地，這些小鼠包含包括來自至少一種人免疫球蛋白基因座的DNA的至少一種轉基因，所述基因座是功能性重排的，或可以經歷功能性重排。此類小鼠中的內源免疫球蛋白基因座可以被破壞或缺失以消除動物產生由內源基因編碼的抗體的能力。與相似蛋白質或片段特異性結合的抗體篩選可以方便地使用肽展示文庫來完成。這種方法涉及在大型肽集合中篩選具有所需功能或結構的個別成員。肽展示文庫的抗體篩選是本領域眾所周知的。#皮展示的肽序列的長度可以是3-5000個或更多個胺基酸，通常為5-100個胺基酸長，且通常為約8-25個胺基酸長。除用於產生肽文庫的直接化學合成方法之外，幾種重組DNA方法已得到描述。一種類型涉及在噬菌體或細胞表面上展示肽序列。每個噬菌體或細胞包含編碼特定展示的肽序列的核普酸序列。此類方法在PCT專利公開號91/17271、91/18980、91/19818和93/08278中得到描述。用於產生肽文庫的其他系統具有體外化學合成和重組方法的2個方面。參見PCT專利公開號92/05258、92/14843和96/19256。還參見，美國專利號5,658，754;和5,643,768。肽展示文庫、載體和篩選試劑盒從此類供應商如Invitrogen(Carlsbad,CA)和CambridgeantibodyTechnologies(Cambridgeshire,UK)商購可得。參見，例如美國專利號4704692、4939666、4946778、5260203、5455030、5518889、5534621、5656730、5763733、5767260、5856456，轉讓給Enzon;5223409、5403484、5571698、5837500,轉讓給Dyax,5427908、5580717,轉讓糹合Affymax;5885793,轉讓給CambridgeantibodyTechnologies;5750373,轉讓給Genentech,5618920、5595898、5576195、5698435、5693493、5698417,轉讓給Xoma,Colligan,同上；Ausubel,同上；或Sambrook，同上，上述專利和出版物各自整體引入本文作為參考。2.本發明的核酸使用本文提供的信息，例如編碼SEQIDNOS:2-5和27-28中至少一個的至少70-100%鄰接胺基酸的核苷酸序列、其特定片段、變體或共有序列，編碼至少一種抗MCP-1抗體的本發明的核酸分子可以使用本文描述的或如本領域已知的方法獲得。本發明的分離的核酸分子可以包括包含可讀框(ORF)的核酸分子，任選具有一個或多個內含子，例如但不限於，至少一條重鏈(例如SEQIDNOS:6-12、22和23)或輕鏈(例如SEQIDNOS:13-21和24-26)的至少一個CDR,如CDR1、CDR2和/或CDR3的至少一個特定部分；包含抗MCP-1抗體或可變區(例如SEQIDNOS:2-5、27和28)編碼序列的核酸分子；和包含基本上不同於上述那些的核苷酸序列，但由於遺傳密碼簡併性，如本文描述的和/或如本領域已知的仍編碼至少一種抗MCP-1抗體的核酸分子。當然，遺傳密碼是本領域眾所周知的。因此，對於本領域技術人員而言，產生編碼本發明的特異性抗MCP-1抗體的此類簡併核酸變體將是常規的。參見，例如Ausubel等人，同上，且此類核酸變體包括在本發明中。如本文指出的，包含編碼抗MCP-1抗體的核酸的本發明核酸分子可以包括但不限於，單獨編碼抗體片段的胺基酸序列的那些；關於完整抗體或其部分的編碼序列；關於抗體、片段或部分、以及附加序列的編碼序列，例如至少一種信號前導序列或融合肽的編碼序列，具有或不具有前述的附加編碼序列，例如至少一個內含子，連同附加的非編碼序列一起，包括但不限於，非編碼的5，和3，序列，例如在轉錄、mRNA加工，包括剪接和多腺苷酸化信號(例如mRNA的核糖體結合和穩定性)中起作用的轉錄的非翻譯序列；編碼附加胺基酸例如提供附加功能性的那些的附加編碼序列。因此，編碼抗體的序列可以與標記序列例如編碼肽的序列融合，所述肽促進包含抗體片段或部分的融合抗體純化。與如本文所述的多核苷酸選擇性雜交的多核苷酸本發明提供了在選擇性雜交條件下與本文公開的多核苷酸雜交的分離的核酸。因此，這個實施方案的多核苷酸可以用於分離、檢測和/或定量包含此類多核苷酸25的核酸。例如，本發明的多核苷酸可以用於在保藏的文庫中鑑定、分離、或擴增部分或全長克隆。在某些實施方案中，多核苷酸是分離的基因組或cDNA序列，或以其他方式與來自人或哺乳動物核酸文庫的cDNA互補。優選地，cDNA文庫包含至少80%的全長序列，優選至少85%或90%的全長序列，且更優選地至少95%的全長序列。cDNA文庫可以進行標準化以增加罕見序列的表現。低或中等嚴格雜交條件一般但不是唯一地用於相對於互補序列具有減少的序列同一性的序列。中等和高嚴格條件可以任選對於同一性更大的序列使用。低嚴格條件允許具有約70%的序列同一性的序列選擇性雜交，且可以用於鑑定直系同源或旁系同源序列。任選地，本發明的多核苦酸將編碼由本文描述的多核普酸編碼的抗體的至少部分。本發明的多核苷酸包含可以用於與編碼本發明抗體的多核苷酸選擇性雜交的核酸序列。參見，例如Ausubel,同上；Colligan,同上，各自整體引入本文作為參考。核酸的構建本發明的分離的核酸可以使用如本領域眾所周知的(a)重組方法、(b)合成技術、(c)純化技術、或其組合進行製備。用於構建核酸的重組方法本發明的分離的核酸組合物，例如RNA、cDNA、基因組DNA、或其任何組合，可以使用本領域技術人員已知的任何數目的克隆方法從生物學來源獲得。在某些實施方案中，在嚴格條件下與本發明的多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針用於在cDNA或基因組DNA文庫中鑑定所需序列。RNA的分離、以及cDNA和基因組文庫的構建是本領域普通技術人員眾所周知的(參見，例如Ausubel,同上；或Sambrook,同上)。核酸篩選和分離方法cDNA或基因組文庫可以使用依據本發明多核苷酸序列例如本文公開的那些的探針進行篩選。探針可以用於與基因組DNA或cDNA序列雜交以分離相同或不同生物中的同源基因。本領域技術人員將理解各種程度的雜交嚴格性可以在測定中使用；且雜交或洗滌介質可以是嚴格的。隨著用於雜交的條件變得更嚴格，在發生雙鏈體形成的探針和靶之間必須存在更大的互補性程度。嚴格性的程度可以由溫度、離子強度、pH和部分變性溶劑例如甲醯胺的存在中的一種或多種加以控制。例如，雜交的嚴格性通過經由例如將曱醯胺濃度操縱在260%-50%內來改變反應物溶液的極性方便地加以改變。可檢測的結合所需的互補性(序列同一性)程度將根據雜交介質和/或洗滌介質的嚴格性而變。互補性程度將最佳為100%、或70-100%、或其中的任何範圍或值。然而，應當理解探針和引物中較小的序列變異可以通過減少雜交和/或洗滌介質的嚴格性進行補償。擴增RNA或DNA的方法是本領域眾所周知的，且基於本文呈現的教導和指導無需過度實驗即可根據本發明使用。DNA或RNA擴增的已知方法包括但不限於，聚合酶鏈反應(PCR)和相關擴增方法(Mullis等人，美國專利號4,683,202(1987);和Innis等人,PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications,Eds.,AcademicPressInc.,SanDiego,CA(1990)。用於構建核酸的合成方法本發明的分離核酸還可以通過已知方法通過直接化學合成進行製備(參見，例如Ausubel等人，同上)。化學合成一jt&產生單鏈寡核苦酸，它可以通過與互補序列雜交，或用DNA聚合酶使用單鏈作為模板通過聚合轉變成雙鏈DNA。本領域技術人員將認識到儘管DNA的化學合成可以限制於約100個或更多個鹼基的序列，但較長的序列可以通過連接較短序列來獲得。關於編碼序列的化學合成的特別優選方法在美國專利號6521427和6670127中教導。3.載體和表達系統本發明提供了包含編碼抗MCP-1抗體的核酸的載體，優選表達載體，或可以用於獲得包含各種抗體HC或LC基因或其部分的質粒。如本文使用的，術語"載體"指能夠轉運與其連接的另一種核酸的核酸分子。一種載體類型是"質粒"，這指另外的DNA片段可以連接到其內的環狀雙鏈DNA環。另一種載體類型是病毒載體，其中另外的DNA片段可以連接到病毒基因組內。本發明還涉及包括本發明的分離的核酸分子的載體、用重組載體基因工程改造的宿主細胞、以及通過如本領域眾所周知的重組技術生產至少一種抗MCP-1抗體。參見，例如各自整體引入本文作為參考的Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上。對於抗體或其抗體片段的表達，編碼部分或全長輕和重鏈的DNAs可以插入表達盒或載體內，從而使得基因與轉錄和翻譯控制序列可操作地連接。編碼抗體的盒可以作為構建體進行裝配。構建體可以使用本領域已知的方法進行製備。構建體可以作為較大質粒的部分進行製備。此類製備允許以有效方式克隆和選擇正確構造。構建體可以位於質粒或其他載體上的方便的限制位點之間，從而使得它們可以容易地與其餘的質粒序列分開。一般地，質粒載體在沉澱物例如磷酸鈣沉澱物中，或在含DEAE-葡聚糖的帶電脂質的複合物中被引入。如果載體是病毒，那麼它可以使用合適的包裝細胞系在體外進行包裝且隨後轉導到宿主細胞內。載體構建體引入宿主細胞內還可以通過電穿孔或其他已知方法來實現。此類方法在本領域中得到描述，例如Sambrook,同上，1-4和16-18章;Ausubel，同上，1、9、13、15、16章。在這種背景中，術語"可操作地連接的"意指抗體基因被連接到載體內，從而使得載體內的轉錄和翻譯控制序列發揮其調節抗體基因轉錄和翻譯的預期功能。選擇與使用的表達宿主細胞相容的表達載體和表達控制序列。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以被插入分開的載體內，或更一詢殳地，2種基因一皮插入相同表達載體內。抗體基因通過標準方法-波插入表達載體內(例如抗體基因片段和載體上的互補限制位點的連接，或如果不存在限制位點，則為平端連接)。通過將本文所述抗體的輕和重鏈可變區插入已編碼所需同種型的重鏈恆定和輕鏈恆定區的表達載體內，從而使得VH片段與載體內的CH片段可操作地連接，且VI,片段與載體內的CL片段可操作地連接，可重組表達載體可以編碼促進抗體鏈從宿主細胞中分泌的信號肽。可以將抗體鏈基因克隆到載體內，從而使得信號肽與抗體鏈基因的氨基端框內連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即來自非免疫球蛋白的信號肽)。儘管理論上可能在原核或真核宿主細胞中表達本發明的抗體，但抗體在真核細胞且最優選哺乳動物宿主細胞中的表達是最優選的，因為此類真核細胞且特別是哺乳動物細胞比原核細胞更可能裝配和分泌正確摺疊和免疫活性的抗體。一般而言，哺乳動物表達載體將包含(1)調節元件，通常是病毒啟動子或增強子序列的形式，且特徵在於寬的宿主和組織範圍；(2)促進包含抗體編碼序列的DNA片段插入質粒載體內的"多接頭"序列；28和(3)負責mRNA轉錄物的內含子剪接和多腺苷酸化的序列。這種啟動子-多接頭-多腺苷酸化位點的鄰接區域通常稱為轉錄單位。載體將還可能包含(4)選擇標記基因(例如，(3-內醯胺酶基因)，通常賦予對抗生素(例如氨節青黴素)的抗性，從而允許在大腸桿菌(￡.co//)中選擇最初的陽性轉化體；和(5)促進載體在細菌和哺乳動物宿主中複製的序列。包括質粒複製起點用於在大腸桿菌中繁殖表達構建體，且為了在Cos細力包中瞬時表達，將SV40複製起點包括在表達質粒中。啟動子可以選自SV40啟動子(例如晚期或早期SV40啟動子、CMV啟動子(美國專利號5,168,062;5,385,839)、HSVtk啟動子、pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子、EF-1a啟動子(美國專利號5,266,491)、至少一種人免疫球蛋白啟動子。表達載體將優選但任選包括至少一種選擇標記。此類標記包括例如但不限於，對於真核細胞培養的氨曱蝶呤(MTX)、二氳葉酸還原酶(DHFR,美國專利號4,399,216;4,634，665;4,656,134;4,956,288;5，M9,636;5,179,017,氨節青黴素、新黴素(G418)、黴酚酸、或穀氨醯胺合成酶(GS,美國專利號5,122,464;5,770,359;5,827,739)抗性,和對於在大腸桿菌和其他細菌或原核生物中培養的四環素或氨節青黴素抗性基因(上述專利整體在此引入作為參考)。關於上述宿主細胞的合適培養基和條件是本領域已知的。合適的載體對於技術人員將是顯而易見的。當使用真核宿主細胞時，一般向載體內整合入多腺苷酸化或轉錄終止序列。終止序列的例子是來自牛生長激素基因的多腺苷酸化序列。還可以包括用於正確剪接轉錄物的序列。剪接序列的例子是來自SV40的VP1內含子(Spmgue等人，J.Virol.45:773-781(1983))。此外，如本領域已知的，控制宿主細胞中的複製的基因序列可以整合入載體內。同樣，為了避免重鏈分子的高表面表達，可能必需使用消除跨膜結構域變體剪接的表達載體。附加元件包括增強子、Kozak序列以及側接用於RNA剪接的供體和受體位點的間插序列。高效率的轉錄可以使用下列來達到來自SV40的早期和晚期啟動子，來自逆轉錄病毒例如RSV、HTLVI、HIVI的長末端重複序列(LTRS),和巨細胞病毒(CMV)的早期啟動子。然而，也可以使用細胞元件(例如人肌動蛋白啟動子)。用於在本發明實踐中使用的合適表達載體包括例如，載體，例如pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN、或pLNCX(ClonetechLabs，PaloAlto,CA)、pcDNA3.l(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia,Uppsala,瑞典)、pRSVcat(ATCC37152)、pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可替代地，編碼抗體序列的核酸可以在包含整合到染色體內的基因的穩定細胞系中表達。與選擇標記例如dhfr、gpt、新黴素或潮黴素共轉染允許鑑定和分離表達大量編碼的抗體的轉染細胞。DHFR(二氫葉酸還原酶)標記對於開發攜帶幾百或甚至幾千拷貝的目的基因的細胞系有用。另一種有用的選擇標記是穀氨醯胺合酶(GS)(Murphy等人，Biochem.J.227:277-279(1991);Bebbington等人，Bio/Technology10:169-175(1992))。使用這些標記，哺乳動物細胞在選一奪性培養基中生長且選擇具有最高抗性的細胞。這些細胞系包含整合到染色體內的擴增的基因。中國倉鼠卵巢(CHO)和NSO細胞通常用於生產抗體。本發明抗體生產中使用的DNA構建體可以任選包括至少一種隔離子(insulator)序列。術語"隔離子"、"隔離子序列"和"隔離子元件"在本文中可互換使用。隔離子元件是隔離置於其作用範圍內的基因轉錄但不會負面或正面幹擾基因表達的控制元件。優選地，隔離子序列插入待轉錄的DNA序列的任何一側上。例如，隔離子可以定位於距離啟動子5，約200bp-約1kb,且在目的基因3'末端處距離啟動子至少約1kb-5kb。隔離子序列與啟動子和目的基因3，末端的距離可以由本領域技術人員取決於目的基因的相對大小、構建體中使用的啟動子和增強子進行確定。此外，超過一個啟動子序列可以定位於啟動子的5，或轉基因的3，末端處。例如，2個或更多個隔離子序列可以定位於啟動子的5，。轉基因3，末端處的一個或多個隔離子可以定位於目的基因的3'末端處，或3，調節序列例如3'非翻譯區(UTR)或3'側翼序列的3'末端處。合適的誘導型非融合大腸桿菌表達載體的例子包括pTrc(Amann等人，(1988)Gene69:301-315)和pETlid(Studier等人，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)60-89)。來自pTrc載體的靶基因表達依賴於從雜交trp-lac融合啟動子起的宿主RNA聚合酶轉錄。來自pETlld載體的耙基因表達依賴由共表達的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介導的、從T7gnlO-lac融合啟動子起的轉錄。這種病毒聚合酶由來自定居X原噬菌體的宿主抹BL21(DE3)或HMS174(DE3)供應，所述X原噬菌體具有在lacUV5啟動子的轉錄控制下的T7gnl基因。在另一實施方案中，表達載體是酵母表達載體。用於在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中表達的載體例子包括pYepSecl(Baldari等人(1987)EMBOJ.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz、(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultz等人(1987)Gene54:113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)、和pPicZ(InvitrogenCorp,SanDiego,Calif.)。可替代地，表達載體是杆狀病毒表達載體。可用於在培養的昆蟲細胞(例如Sf9細胞)中表達蛋白質的杆狀病毒載體包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology170:31-39)。在再一實施方案中，本發明的核酸使用哺乳動物表達載體在哺乳動物細胞中進行表達。哺乳動物表達載體的例子包括pCDM8(Seed(1987)Nature329:840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987尼MBOJ.6:187-195)。當在哺乳動物細胞中使用時，表達載體的控制功能通常由病毒調節元件提供。例如，常用的啟動子來源於多瘤、腺病毒2、巨細胞病毒和猿猴病毒40。關於原核和真核細胞的其他合適表達系統，參見Sambrook等人，同上的16和17章。在另一實施方案中，重組哺乳動物表達載體能夠指導核酸表達，優選在特定細胞類型中，例如淋巴瘤細胞(例如小鼠骨髓瘤細胞)。在特定細胞類型中，組織特異性調節元件用於表達核酸。組織特異性調節元件是本領域已知的。合適的組織特異性啟動子的非限制性例子包括清蛋白啟動子(肝特異性;Pinkert等人(1987)GenesDev.1:268-277),淋巴樣特異性啟動子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43:235-275),特別是T細胞受體(Winoto和Baltimore(1989)EMBOJ.8:729-733)和免疫球蛋白(Banerji等人(1983)Cell33:729-740;Queen和Baltimore(1983)Cell33:741-748)啟動子，神經元特異性啟動子(例如神經絲啟動子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:5473-5477),胰特異性啟動子(Edlund等人(1985)Science230:912-916),和乳腺特異性啟動子(例如乳清啟動子;美國專利號4,873,31631和歐洲申請公開號264,166)。還可以包含發育調節啟動子，例如鼠hox啟動子(Kessel和Gmss(1990)Science249:374-379)和曱胎蛋白啟動子(Campes和Tilghman(1989)GenesDev.3:537-546)。本發明進一步提供了包含在反義方向上克隆到表達載體內的DNA分子的重組表達載體。即，DNA分子以允許RNA分子表達(通過DNA分子轉錄)的形式與調節序列可操作地連接，所述RNA分子對編碼多肽的mRNA是反義的。可以選擇與在反義方向上克隆的核酸可操作地連接的調節序列，它指導反義RNA分子在多種細胞類型中的連續表達。例如，可以選擇病毒啟動子和/或增強子、或調節序列，它指導反義RNA的組成型、組織特異性、或細胞類型特異性表達。反義表達載體可以是重組質粒、噬菌粒、或減弱病毒的形式，其中反義核酸在高效率調節區的控制下生產，其活性可以由載體引入其中的細胞類型來決定。關於使用反義基因的基因表達調節的討論，參見Weintraub等人(Reviews—TrendsinGenetics,第1巻(1)1986)。在骨髓瘤細胞中的克隆和表達稱為cM-T412(整體引入作為參考的EP0511308)的針對人CD4的嵌合小鼠/人IgGlk單克隆抗體，被觀察到在轉染的小鼠骨髓瘤細胞中以高水平表達(Looney等人1992.HumAntibodiesHybridomas3(4):191-200)。在最優化培養條件方面沒有大量努力，在1990年於Centocor,Inc.Malvern,PA容易地獲得>500mg/L的生產水平(在pg/細胞/天的基礎上的比生產力未知)。基於這些表達載體的組分，開發了對HC和LC克隆有用的抗體克隆載體，它包括基因啟動子/轉錄起始核酸序列、5，非翻譯序列和翻譯起始核酸序列、編碼信號序列的核酸序列、用於信號內含子和J-C內含子的內含子/外顯子剪接供體序列，以及J-C內含子增強子核酸序列。質粒pl39,pUC19質粒包含從分泌完全小鼠M-T412Ab的C123雜交瘤細胞克隆的5.8kbEcoRI-EcoRI基因組片段；該片段包含cM-T412HC基因的啟動子和V區部分。用於LCV區載體工程改造的原材料是質粒p39,包含從C123雜交瘤細胞克隆的3kbHindlll-Hindlll基因組片段的pUC質粒；這個片段包含cM-T412LC基因的啟動子和V區部分。來源於p139和p39的工程改造的載體設計成使得能夠在2步過程中方便的裝配適合於在哺乳動物宿主細胞中表達的HC或LC基因，所述過程需要1)克隆編碼在V區載體中特別製備的限制位點之間的目的序列的DNA,由此V區編碼序列緊位於載體編碼的信號序列下遊，以及部分或全部基因啟動子下遊；和2)轉移在正確方向上跨越從V區載體到C區載體的插入序列的片段，由此所得到的質粒構成適合於在細胞中表達的最終表達質粒(Scallon等人1995Cytokine7(8):759-769)。在CHO細胞中的克隆和表達質粒pC4是質粒pSV2-dhfr(ATCC登記號37146)的衍生物。該質粒包含在SV40早期啟動子控制下的小鼠DHFR基因。用這些質粒轉染的中國倉鼠卵巢或缺乏二氫葉酸活性的其他細胞，可以通過使細胞在補加了化學治療劑氨曱蝶呤的選擇培養基(例如alphaminusMEM,LifeTechnologies,Ga池ersburg,MD)中生長進行選擇。在對氨甲蝶呤(MTX)抗性的細胞中擴增DHFR基因已得到充分證明(參見，例如，F.W.Alt等人，J.Biol.Chem.253:1357-1370(1978);J.L.Hamlin和C.Ma,Biochem.etBiophys.Acta1097:107-143(1990);以及M.J.Page和M.A.Sydenham,Biotechnology9:64-68(1991))。在濃度漸增的MTX中生長的細胞由於DHFR基因擴增通過超量生產靶酶DHFR發展出對藥物的抗性。如果第二種基因與DHFR基因連接，那麼它通常被共擴增和超表達。本領域已知的是這種方法可以用於開發攜帶超過1,000個擴增的基因拷貝的細胞系。隨後，當氨曱蝶呤被取出時，獲得包含整合到宿主細胞的一個或多個染色體內的擴增的基因的細胞系。質粒pC4包含用於表達目的基因的勞斯肉瘤病毒的長末端重複序列(LTR)的強啟動子(Cullen等人，Molec.Cell.Biol.5:438-447(1985))，加上從人巨細胞病毒(CMV)的立即早期基因的增強子分離的片段(Boshart等人，Cell41:521-530(1985))。啟動子的下遊是允許基因整合的BamHI、Xbal和Asp718限制酶切割位點。在這些克隆位點之後，該質粒包含3，內含子和大鼠前胰島素原基因的多腺苷酸化位點。其他高效率的啟動子也可以用於表達，例如人b-肌動蛋白啟動子、SV40早期或晚期啟動子、或來自其他逆轉錄病毒例如HIV和HTLVI的長末端重複序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表達系統和類似系統可以用於在哺乳動物細胞中以受調節的方式表達MCP-1抗體(M.Gossen和H.Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:5547-5551(1992))。對33於mRNA的多腺普酸化，也可以使用例如來自人生長激素或珠蛋白基因的其他信號。4.用於生產抗體的宿主細胞如本領域眾所周知的，本發明的至少一種抗MCP-1抗體可以任選通過細胞系、混合細胞系、無限增殖化細胞或無限增殖化細胞的克隆群體來生產。參見,侈'j^口,Ausubel等人,ed.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY,NY(1987-2004);Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarbor,NY(1989);Harlow和Lane,antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY(1989);Colligan等人，eds.,CurrentProtocolsmImmunology,JohnWiley&Sons,Inc.,NY(1994-2004);Colligan等人，CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY,(1997-2004),各自整體引入本文作為參考。為了生產生物藥物產品，需要能夠有效和可重複表達重組多肽的生產細胞系。該細胞系是穩定和可獲利的(bankable)。多種宿主細胞系可以用於這個目的。作為對細胞機器如何影響生物治療產品的最終量和組成的複雜性的理解，將賦予產品生產和組成所需屬性的宿主細胞系的選擇變得更明顯。與由連續基因組DNA序列轉錄的大多數基因不同，抗體基因由可以在種系中廣泛分開的基因片段裝配。具體地，重鏈基因由編碼抗體可變(V)、多變(D)和連接(J)/恆定(C)區的3個基因組片段重組形成。功能性輕鏈基因通過連接2個基因片段形成；一個編碼V區且另一個編碼J/C區。重鏈和K輕鏈基因座都包含估計跨越大大超過1000kb的多個V基因片段(估計大小為lOOs-lOOOs)。相反，X基因座小得多，且已顯示在小鼠染色體16上跨越大約300kb。它由2個可變基因片段和4個連接/恆定(J/C)區基因片段組成。功能性基因的形成需要V和J/C元件之間的重組。在其中抗體天然產生的b細胞中，重排的重和K輕鏈基因的轉錄控制依賴V區上遊的組織特異性啟動子和位於J-C內含子中的組織特異性增強子的活性。這些元件協同發揮作用。同樣，第二種B細胞特異性增強子已在K輕鏈基因座中鑑定。這個另外的增強子位於Ck下遊9kb。34因此，使抗體表達基因無限增殖化的雜交瘤方法依賴親本B細胞譜系的內源啟動子和增強子序列。可替代地，本發明的核酸可以在包含編碼本發明抗體的內源DNA的宿主細胞中通過開啟(通過操縱)在宿主細胞中進行表達。此類方法是本領域眾所周知的，例如，如美國專利號5,580,734、5,641,670、5,733,746和5，733,761中描述的,所述專利整體引入本文作為參考。將抗體基因組DNA克隆到人造載體內是製備能夠表達抗體的宿主細胞的另一種方法。然而，在強啟動子之後的單克隆抗體表達增加鑑定高生產細胞系和獲得更高產量的單克隆抗體的機會。本發明的抗體可以使用例如如本領域眾所周知的重組DNA技術和基因轉染方法的組合(例如Morrison,S.(1985)Science229:1202)在宿主細胞轉染瘤中生產。用於在多種不同的宿主細胞中克隆和表達生物藥物包括抗體的系統是眾所周知的。合適的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、酵母和杆狀病毒系統以及轉基因植物和動物。在本領域中可用於表達異源多肽完整糖基化蛋白的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK)、NSO小鼠黑素瘤細胞和衍生細胞系，例如SP2/0、YB2/0(ATCCRL-1662)大鼠骨髓瘤細胞、人胚腎細胞(HEK)、人胚視網膜細胞PerC.6細胞、hepG2細胞、BSC-1(例如，ATCCCRL-26)、以及可從例如美國典型培養物保藏中心，Manassas,Va(www.atcc.org)獲得的許多其他細胞。常見的優選細菌宿主是大腸桿菌。哺乳動物細胞例如CHO細胞、骨髓瘤細胞、HEK293細胞、BHK細胞(BHK21,ATCCCRL誦IO)、小鼠Ltk-細胞、和NIH3T3細胞已經常用於異源基因的穩定表達。相反，細胞系例如Cos(COS-lATCCCRL1650;COS-7，ATCCCRL-1651)和HEK293常規地用於重組蛋白質的瞬時表達。由於其高表達率，用於表達本發明的重組抗體的優選哺乳動物宿主細胞包括骨髓瘤細胞，例如Sp2/0、YB2/0(ATCCRL-1662)、NSO和P3X63.Ag8.653(例如SP2/0-Ag14)。具體地，對於與NSO骨髓瘤細胞的使用，另一種優選的表達系統是WO87/04462、WO89/01036和EP338,841中公開的GS基因表達系統。當編碼抗體基因的重組表達載體引入哺乳動物宿主細胞中時，抗體通過使宿主細胞培養足夠的時間段來產生，所述時間段允許抗體在宿主細胞中表達，或更優選地，抗體分泌到宿主細胞在其中生長的培養基內。抗體可以使用標準蛋白質純化方法從i咅養基回收。用於生產抗體、其特定部分或變體的細胞培養物實例是哺乳動物細胞。哺乳動物細胞系統通常將是細胞單層的形式，儘管哺乳動物細胞懸浮液或生物反應器也可以使用。能夠表達完整糖基化蛋白的許多合適的宿主細胞系已在本領域被開發，且包括COS-l(例如ATCCCRL1650)、COS-7(例如ATCCCRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCCCRL-10)、CHO(例如ATCCCRL1610)和BSC-1(例如ATCCCRL畫26)細胞系、Cos-7細胞、CHO細胞、hepG2糹田月包、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293細胞、HeLa細胞等，它們可從例如美國典型培養物保藏中心，Manassas,Va(www.atcc.org)容易獲得。優選的宿主細胞包括淋巴樣起源的細胞，例如骨髓瘤和淋巴瘤細胞。特別優選的宿主細胞是P3X63Ag8.653細胞(ATCC登記號CRL-1580)和SP2/0-Ag14細胞(ATCC登記號CRL-1851)。CHO-K1和DHFR-CHO細胞DG44和DUK曙Bll(G.Urlaub,L.A.Chasin,1980.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77,4216-4220)用於高水平的蛋白質生產，因為目的基因擴增通過整合入選擇、可擴增標記DHFR使用例如藥物氨甲蝶呤(MTX)能夠進行(R丄Kaufman,1990.MethodsEnzymol.185:537-566)。DHFR-CHO細胞可以成功地用於以高水平生產重組mAbs。DHFR;CHO可以以80-110mg106細胞"天"或超過200mg106細胞"天"的速率生產抗MCP-1抗體。多種啟動子已用於在這些CHO細胞中獲得H-和L-鏈的表達，例如，b-肌動蛋白啟動子、人CMVMIE啟動子、Ad病毒主要晚期啟動子(MLP)、RSV啟動子和鼠白血病病毒LTR。用於mAb表達的許多載體在文獻中得到描述，其中2條Ig鏈由具有獨立選擇/可擴增標記的2種不同質粒攜帶。包含1條抗體鏈，例如與DHFR標記連接的H-鏈，和具有Nec/標記的L-鍊表達盒或反之亦然的載體可用於在旋轉器瓶中獲得最高達180mg的人源化mAbL"7眾所周知的。一般而言，高水平的mAb表達可以使用下列步驟獲得候選克隆的初始選擇和後續擴增，共選擇(例如在其中H-鏈和L-鍊表36達載體都攜帶DHFR表達單位的情況下)和擴增，使用不同可擴增標記的共擴增，以及在大量培養中初始選擇和擴增，隨後為稀釋克隆法以鑑定個別高表達的克隆。因為整合位點可以影響H-鏈和L-鍊表達以及總體mAb表達的效率，所以已製備其中2個Ig-鍊表達單位串聯放置的單個載體。這些載體還攜帶顯性選4奪標記，例如Nec/和DHFR表達盒。關於糹宗述,參見Ganguly,S.和A.Shatzman.ExpressionSystems,mammaliancellsIN:EncyclopediaofBioprocessTechnology:Fermentation,Biocatalysis,andBioseparation.1999byJohnWiley&Sons,Inc。Cockett等人(1990.Bio/Technology8,662-667)開發了GS系統用於在CHO細胞中高水平表達異源基因。將包含cDNA(在hCMV啟動子的轉錄控制下)和GS小基因(在SV40晚期啟動子的控制下)的表達載體轉染到CHO-K1細胞內(隨後用20mM-500mMMSX選擇)可以用於產生表達本發明抗體的克隆，其產量與DHFR-CHO系統的那種可比4交。GS系統整體或部分連同歐洲專利號0216846、0256055和0323997以及歐洲專利申i貪號89303964.4討論。作為非限制性例子，表達重組蛋白質的轉基因菸草葉已成功地用於提供大量重組蛋白質，例如使用誘導型啟動子。參見，例如Cramer等人，Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118(1999)和其中引用的參考文獻。同樣，轉基因玉米已用於以商業生產水平表達哺乳動物蛋白質，其生物活性等同於在其他重組系統中生產或從天然來源純化的那些。參見，例如Hood等人，Adv.Exp.Med.Biol.464:127-147(1999)和其中引用的參考文獻。也已由轉基因植物種子包括菸草種子和馬鈴薯塊莖大量生產了抗體，包括抗體片段，例如單鏈抗體(scFv，s)。參見，例如Conrad等人，PlantMol.Biol.38:101-109(1998)和其中引用的參考文獻。因此，本發明的抗體還可以使用轉基因植物根據已知方法進行生產。還參見，例如Fischer等人，Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108(Oct.,1999)，Ma等人,TrendsBiotechnol.13:522-7(1995);Ma等人，PlantPhysiol.109:341-6(1995);Whitelam等人,Biochem.Soc.Trans.22:940-944(1994);其中引用的參考文獻。關於抗體的植物表達一般還參見但不限於美國專利號5959177。上述參考文獻各自整體引入本文作為參考。5.抗體的純化抗MCP-1抗體可以通過眾所周知的方法從重組細胞培養物中進行回收和純化，所述方法包括但不限於，A蛋白純化、闢u酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析法、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。高效液相層析("HPLC")也可以用於糹屯4t。參見,例i口Colligan，CurrentProtocolsinImmunology,或CurrentProtocolsinProteinScience,JohnWiley&Sons,NY,NY,(1997-2001)，例如l、4、6、8、9、10章，各自整體引入本文作為參考。本發明的抗體包括天然純化的產物、化學合成方法的產物、和通過重組技術由真核宿主生產的產物，所述真核宿主包括例如酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞。取決於在重組生產方法中使用的宿主，本發明的抗體可以是糖基化的或可以是非糖基化的，而糖基化的是優選的。此類方法在許多標準實驗室手冊中描述，例如Sambrook,同上，17.37-17.42節；Ausubel,同上，10、12、13、16、18和20章，Colligan,ProtdnScience，同上，12-14章，所述參考文獻全部整體引入本文作為參考。6.本發明的抗體在本發明的方法和組合物中有用的抗MCP-l抗體(也稱為抗CCL-2抗體或MCP-l抗體)可以任選表徵為與MCP-l的高親和力結合、與MCP-l的高特異性結合、抑制與MCP-l有關的一種或多種生物學活性的能力、並任選和優選具有低毒性。本發明的抗體可以以廣泛範圍的親和力(KD)結合人MCP-1。在優選實施方案中，本發明的至少一種人mAb可以任選以高親和力結合人MCP-1。例如，人mAb可以以等於或小於約1(T7M的KD結合人MCP-1,例如但不限於0.1-9.9(或其中的任何範圍或值)Xl(T7、IO-8、IO-9、l(T10、10—11、10—12、10—13或其中的任何範圍或值。抗體對於抗原的親和力或抗體親抗原性可以使用任何合適的方法實驗上測定。(參見，例如Berzofsky等人，"Antibody-AntigenInteractions,"InFundamentalImmunology,Paul，W.E.，Ed.,RavenPress:NewYork,NY(1984);Kuby,JanisImmunology,W.H.Freemanand38Company:NewYork,NY(1992);和本文描述的方法)。如果在不同條件(例如，鹽濃度、pH)下測量，那麼特定抗體-抗原相互作用的測量的親和力可以不同。因此，親和力和其他抗原結合參數(例如Kd、Ka、Kd)的測量優選用抗體和抗原的標準溶液以及標準緩衝液，例如本文描述的標準溶液和緩衝液來進行。本發明的分離的抗體包含由任何合適的多核苷酸編碼的本文公開的抗體胺基酸序列，或任何分離的或製備的抗體。優選地，人抗體或抗原結合片段結合人MCP-1,且由此部分或基本上中和蛋白質的至少一種生物學活性。部分或優選基本上中和至少一種MCP-1蛋白質或片段的至少一種生物學活性的抗體或其特定部分或變體，可以結合蛋白質或片段，且由此抑制通過MCP-1與MCP-1受體結合或通過其他MCP-1依賴性或介導的機制介導的活性。如本文使用的，術語"中和抗體"指取決於測定可以將MCP-1依賴性活性抑制約20-120%的抗體，優選至少約10、20、30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%或更多。抗MCP-1抗體抑制MCP-1依賴性活性的能力優選通過如本文描述的和/或如本領域已知的至少一種合適的MCP-1蛋白質或受體測定進行評估。本發明的人抗體可以是任何種類(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同種型，且可以包含k或X輕鏈。在一個實施方案中，人抗體包含IgG重鏈或限定片段，例如至少一種同種型IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。這種類型的抗體可以如本文描述的和/或如本領域已知的通過使用轉基因小鼠或其他轉基因非人哺乳動物來製備，所述哺乳動物包含至少一種人輕鏈(例如IgG、IgA和IgM(例如yl、丫2、Y3、y4)轉基因。在另一實施方案中，抗人MCP-l人抗體包含IgGl重鏈和IgGl輕鏈。本發明的至少一種抗體結合對至少一種MCP-1蛋白質、片段、部分或其任何組合特異的至少一種特定表位。至少一種表位可以包含包括蛋白質的至少一個部分的至少一個抗體結合區域，所述表位優選包含SEQIDNO:1鄰接胺基酸的至少1-3個胺基酸至整個特定部分。述抗原結合區域包含至少一個人互補性決定區(CDR1、CDR2和CDR3)或至少一個重鏈可變區變體，以及至少一個人互補性決定區(CDRl、CDR2和CDR3)或至少一個輕鏈可變區變體。作為非限制性例子，抗列的至少一個重鏈CDR3，和/或具有SEQIDNO:15-17、20或21的胺基酸序列的輕鏈CDR3。在具體實施方案中，抗體或抗原結合片段可以具有抗原結合區域，所述抗原結合區域包含具有相應CDRs1、2和/或3的胺基酸序列(例如SEQIDNOS:6-12和/或22、23和26)的至少一個重鏈CDR(即，CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少部分。在另一所述抗原結合區域包含具有相應CDRs1、2和/或3的胺基酸序列(例如SEQIDNOS:13-21和/或24和25)的至少一個輕鏈CDR(即CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少部分。在優選實施方案中，抗體或抗原結合片段的3個重鏈CDRs和3個輕鏈CDRs具有來源於如本文所述的FabMOR0336、MOR03464、MOR03468、MOR03470、MOR03471、MOR03473、MOR03548中至少一個的相應CDR的胺基酸序列，且重鏈構架區來源於VH3抗體(SEQIDN0.2),且輕鏈構架區來源於K型抗體(SEQIDN0.4)。此類抗體可以通過下列方法製備使用常規技術將抗體的各個部分(CDRs和構架)化學連接在一起，使用重組DNA技酸分子。抗MCP-1抗體可以包含具有在構架區中限定胺基酸序列的至少一個重或輕鏈可變區。例如，在優選實施方案中，抗MCP-1抗體包含任選具有SEQIDNO:2或3的胺基酸序列的至少一個重鏈可變區和/或任選具有SEQIDNO:4或5的胺基酸序列的至少一個輕鏈可變區中的至少一個。抗體種類或同種型(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)被給予由重鏈恆定區基因編碼的恆定區。在人IgG種類中，存在4個亞類或亞型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，按照其在血清中的天然豐度從最高到最低的順序命名。IgA抗體發現了2個亞類IgAl和IgA2。如本文使用的，"同種型轉換"也指IgG亞類或亞型之間的變化。本發明還涉及包含胺基酸序列的抗體、抗原結合片段、免疫球蛋白鏈和CDRs,所述胺基酸序列基本上與本文描述的胺基酸序列相同。優選地，此類抗體或抗原結合片段和包含此類鏈或CDRs的抗體可以以高親和力(例如小於或等於約10—9M的KD)結合人MCP-1。基本上與本文所述序列相同的胺基酸序列包括包含保守胺基酸置換、以及胺基酸缺失和/或插入的序列。保守胺基酸置換指用第二種胺基酸置換第一種胺基酸，所述第二種胺基酸具有的化學和/或物理性質(例如電荷、結構、極性、疏水性/親水性)與第一種胺基酸的那些相似。保守置換包括一種胺基酸用下列組內的另一種置換賴氨酸(K)、精氨酸(R)和組氨酸(H);天冬氨酸(D)和穀氨酸(E);天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E;丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、曱硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G);F、W和Y;C、S和T。本發明的抗MCP-1抗體可以包括來自自然突變或人為處理的一種或多種胺基酸置換、缺失或添加，如關於來源於人種系基因序列且通過序列相似性分類成命名為VH1A、VH1B、VH2等的家族，且通過輕鏈分類為k或X亞群的可變區如本文詳細說明的或如Knappik等人US6828422中教導的。可以在本發明中使用的這些序列和其他序列包括但不限於，表l中呈現的構型，如於2004年6月21日提交的PCT公開WO05/005604和US10/872,932的圖1-42中進一步描述的，所述專利整體引入本文作為參考，其中參考的圖1-42顯示了重和輕鏈可變和恆定結構域序列、構架、亞結構域、區域和置換的例子，所述部分可以在如本文教導的本發明的Ig衍生蛋白質中使用。表1.人抗體構型區域重鏈可變區FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4輕鏈可變區FR1CDR1FR2CDR2FR3CDR3FR4IgAl、IgA2、IgD、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4恆定區cm鉸鏈l-4CH2CH3SIgA、IgMCH1鉸鏈l-4CH2CH3J-鏈IgECH1CH2CH3CH4技術人員可以製備的胺基酸置換數目取決於許多因素，包括上文描41述的那些。一般而言，對於任何給定的抗MCP-1抗體、片l殳或變體的胺基酸置換、插入或缺失數目將不超過40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個，例如1-30個或如本文指定的其中的任何範圍或值。在本發明的抗MCP-1抗體中對功能必需的胺基酸可以通過本領域已知方法進行鑑定，例如定點誘變或丙氨酸掃描誘變(例如，Ausubel，同上，8、15章；Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989))。後面的方法在分子的每個殘基處引入單個丙氨酸突變。隨後測試所得到的突變分子的生物學活性，例如但不限於至少一種MCP-1中和活性。對抗體結合關鍵的位點也可以通過結構分析進行鑑定，例如結晶、核磁共振或光親和標記(Smith等人，J.Mol.Biol.224:899-904(1992)和deVos等人,Science255:306-312(1992))。本發明的抗MCP-1抗體可以包括但不限於，選自SEQIDNOS:2-5和27-28中至少一個的5至所有鄰接胺基酸的至少一個部分、序列或組合。抗MCP-l抗體可以進一步任選包含SEQIDNOS:27和28中至少一個的多肽。在一個實施方案中，若非不改變抗MCP-1抗體的結合特異性的保守置換，免疫球蛋白鏈的胺基酸序列或其部分與SEQIDNOS:27-28中至少一個的相應鏈的胺基酸序列具有約100%的同一性。例如，輕鏈可變區的胺基酸序列可以與SEQIDNO:4或5的序列進行比較，或重鏈的胺基酸序列可以與SEQIDNO:2或3進行比較。優選地，胺基酸同一性使用如本領域已知的合適計算機算法進行測定。如技術人員應當理解的，本發明包括本發明的至少一種生物活性抗體。生物活性抗體具有天然(非合成)、內源或相關和已知抗體比活性的至少20%、30%或40%,且優選至少50%、60%或70%,且最優選至少80%、90%或95%-1000%的比活性。測定和定量測量酶促活性和底物特異性的方法是本領域技術人員眾所周知的且在本文中得到描述。在另一方面，本發明涉及通過共價附著有機部分進行修飾、如本文描述的人抗體和抗原結合片段。此類修飾可以產生具有改善的藥物代謝動力學特徵(例如增加的體內血清半衰期)的抗體或抗原結合片段。有機部分可以是線性或分支的親水聚合基團、脂肪酸基團、或脂肪酸酯基團。在具體實施方案中，親水聚合基團可以具有約800-約120,000道爾頓的分子量，且可以是聚鏈烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、胺基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，且脂肪酸或脂肪酸酯基團可以包含約8-約40個碳原子。本發明修飾的抗體和抗原結合片段可以包含與抗體直接或間接共價結合的一個或多個有機部分。與本發明的抗體和抗原結合片段結合的每個有機部分可以獨立地是親水聚合基團、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團。如本文使用的，術語"脂肪酸"包含單羧酸和二羧酸。"親水聚合基團"如該術語在本文使用的指在水中比在辛烷中更易溶的有機聚合物。例如，聚賴氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，通過共價附著聚賴氨酸修飾的抗體由本發明包含。適合於修飾本發明抗體的親水聚合物可以是線性或分支的，且包括例如聚鏈烷二醇(例如PEG、單曱氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如葡聚糖、纖維素、寡糖、多糖等)、親水性胺基酸聚合物(例如聚賴氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚環氧鏈烷(例如，聚環氧乙烷、聚環氧丙烷等)和聚乙烯吡有約800-約150,000道爾頓的分子量。例如可以使用PEG5ooo和PEG20，000,其中下標是以道爾頓表示的聚合物的平均分子量。親水聚合基團可以由l-約6個烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基團取代。由脂肪酸或脂肪酸酯基團取代的親水聚合物可以通過使用合適方法進行製備。例如，包含胺基的聚合物可以與脂肪酸或脂肪酸酯的羧基偶聯，且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧基(例如用N,N-羰基二咪唑活化的)可以與聚合物上的羥基偶聯。適合於修飾本發明抗體的脂肪酸和脂肪酸酯可以是飽和的或可以包含一個或多個不飽和單位。適合於修飾本發明抗體的脂肪酸包括，例如正十二烷酸(C12,月桂酸)、正十四烷酸(C14,肉豆蔻酸)、正十八烷酸(C18,硬脂酸)、正二十烷酸(C2q,花生酸)、正二十二烷酸(C22,山嵛酸)、正三十烷酸(C30)、正四十烷酸(C40)、順式-A9-十八烷酸(C18，油酸)、全順式-△5,8,11,14-二十烷四烯酸(eicosatetraenoate)(C2o，花生四烯酸)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合適的脂肪酸酯包括包含線性或分支低級烷基的二羧酸單酯。低級烷基可以包含1-約12個，優選l-約6個碳原子。修飾的人抗體和抗原結合片段可以使用合適方法，例如通過與一種或多種改性劑反應進行製備。"改性劑"如該術語在本文中使用的指包含活化基團的合適有機基團(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。"活化基團"是化學部分或官能團，它們在合適條件下可與第二種化學基團反應，由此在改性劑和第二種化學基團之間形成共價鍵。例如，胺反應活化基團包括親電基團，例如曱苯磺酸酯、甲磺酸酯、滷(氯、溴、氟、碘)、N-羥基琥珀醯亞胺基酯(NHS)等。可以與闢L醇反應的活化基團包括例如馬來醯亞胺、碘代乙醯基、丙烯酸(acrylolyl)、吡啶基二疏化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛官能團可以與含胺或醯肼的分子偶聯，且疊氮基可以與三價含磷基團反應以形成氨基磷酸酯或phosphorimide鍵。將活化基團引入分子的合適方法是本領域已知的(參見例4口Hermanson,G.T.,S/oco"/wgv^erec/zm'wes,AcademicPress:SanDiego,CA(1996))。活化基團可以直接或通過接頭部分與有機基團(例如親水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)結合，所述接頭部分例如其中一個或多個碳原子可以由雜原子例如氧、氮或硫置換的二價C廣Cu基團。合適的接頭部分包括例如四甘醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH^^CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH-NH-。包含接頭部分的改性劑可以通過下述產生例如在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的存在下，使單-Boc-烷基二胺(例如單-Boc-乙二胺、單-Boc-二氨基己烷)與脂肪酸反應，以在游離胺和脂肪酸歡基之間形成醯胺鍵。Boc保護基團可以通過用三氟乙酸(TFA)處理從產物中去除，以暴露伯胺，所述伯胺如所述地可以與另一種羧基偶聯，或可以與馬來酐反應，且所得到的產物環化以產生脂肪酸的活化馬來醯亞胺基(malenmdo)衍生物。(參見，例如Thompson等人，W092/16221,其完整教導引入本文作為參考。)本發明的修飾抗體可以通過使人抗體或抗原結合片段與改性劑反應來產生。例如，有才幾部分可以通過使用胺反應性改性劑例如PEG的NHS酯以非位點特異性方式與抗體結合。修飾的人抗體或抗原結合片段還可以通過使抗體或抗原結合片段的二硫鍵(例如鏈內二硫鍵)還原來製備。還原的抗體或抗原結合片段隨後可以與硫醇反應性改性劑反應以產生本發明的修飾抗體。包含有機部分的修飾的人抗體或抗原結合片段可以使用合適方法進行製備，所述有機部分與本發明抗體的特定位點結合，所述方法例如反向蛋白質水解(Fisch等人，Swco"ywgafeOzem.,3:147-153(1992);Werlen爭乂，腸,y，^C/縫，5:411-417(1994);44Kumamn等人，屍raWw6(10):2233-2241(1997);Itoh等人，C7^m.,24(1):59-68(1996);Capellas爭乂，Ao&c/mo/.所oewg.，56(4):456-463(1997))，以及Hermanson，G.丁.,Aoco"y'wg"ferec/m—es，AcademicPress:SanDiego,CAU996)中描述的方法。7.針對抗MCP-1抗體的抗獨特型抗體除了單克隆或嵌合抗MCP-1抗體之外，本發明還涉及對本發明的此類抗體特異的抗獨特型(抗Id)抗體。抗Id抗體是識別一般與另一種抗體的抗原結合區域相關的獨特決定蔟的抗體。抗Id可以通過用抗體或其包含CDR的區域免疫與Id抗體來源相同的物種和遺傳類型(例如小鼠品系)的動物進行製備。被免疫動物將識別且對免疫抗體的獨特型決定蔟應答，且產生抗Id抗體。抗Id抗體還可以用作"免疫原"以在另一動物中i秀導免疫應答，/人而產生所謂的抗抗Id抗體。8.包含另外的治療活性成分的抗體組合物組合物可以任選進一步包含有效量的至少一種化合物或蛋白質，所述化合物或蛋白質選自皮膚病學藥物，消炎藥，止痛劑，腎藥(例如血管緊張素受體阻斷劑(ARB)或拮抗劑)，抗感染藥，心血管(CV)系統藥物，中樞神經系統(CNS)藥物，自主神經系統(ANS)藥物，呼吸道藥物，胃腸(GI)道藥物，激素藥物，用於流體或電解質平衡的藥物，血液學藥物，抗癌藥，免疫調諧藥物，眼、耳或鼻藥物，局部藥物，營養藥物等中的至少一種。此類藥物是本領域眾所周知的，包括關於本文提出的每一種的配製、適應症、給藥和施用(參見，例如，Nursing2001HandbookofDrugs,第21版,SpringhouseCorp.,Springhouse,PA,2001;HealthProfessional'sDrugGuide2001,ed.,Shannon,Wilson,Stang,Prentice-Hall,Inc,UpperSaddleRiver,NJ;PharmcotherapyHandbook,Wells等人，ed.，Appleton&Lange,Stamford,CT,所述參考文獻各自整體引入本文作為參考)。本發明的抗MCP-1抗體組合物可以進一步包括任何合適和有效量的組合物或藥物組合物中的至少一種，所述組合物或藥物組合物包含對於需要此類調節、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者的至少一種抗MCP-1抗體，任選進一步包含選自下列的至少一種至少一種TNF拮抗劑(例如但不限於TNF化學或蛋白質拮抗劑，TNF單克隆或多克隆抗體或片段，可溶性TNF受體(例如p55、p70或p85)或其片段、融合多肽，或小分子TNF拮抗劑，例如TNF結合蛋白I或II(TBP-1或TBP-II),nerelimonmab,英夫單抗，enteracept,CDP-571,CDP-870,afelimomab,lenercept等)，抗風溼藥(例如氨甲蝶呤、醋硫葡金、葡糖硫金、硫唑噪呤、etanercept、硫代蘋果酸金鈉、硫酸羥氯喹、來氟洛米、柳氮磺吡啶)，肌肉鬆弛藥，麻醉藥，非類固醇消炎藥(NSAID),止痛劑，麻醉劑，鎮靜劑，局部麻醉劑，神經肌肉阻斷劑，抗微生物劑(例如氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生物劑、抗病毒劑、碳青黴烯、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環內酯、青黴素、磺胺藥物、四環素、另一種抗微生物劑)，抗牛皮褲劑，皮質類固醇，促蛋白合成類固醇，糖尿病相關劑，礦物質，營養物，曱狀腺劑，維生素，鈣相關激素，止瀉劑，止咳藥，止吐劑，抗潰瘍藥，緩瀉藥，抗凝劑，促紅細胞生成素(例如重組人類紅細胞生成素a)，非格司亭(例如G-CSF,重組人粒細胞集落刺激因子)，沙格司亭(GM-CSF,白細胞素)，慢性阻塞性肺病(COPD)劑，抗纖維變性劑，免疫接種，免疫球蛋白，免疫抑制劑(例如basiliximab、環孢菌素、daclizumab),生長激素，激素替代藥物，雌激素受體調節劑，散瞳劑，睫狀肌麻痺藥，烷化劑，抗代謝物，有絲分裂抑制劑，防輻射藥物，抗抑鬱藥，抗躁狂劑，抗精神病藥，抗焦慮藥，催眠藥，擬交感神經藥，興奮劑，多奈哌齊，單滿吖啶氨，哞喘藥，(3激動劑，吸入類固醇，白細胞三烯抑制劑，甲基黃。票呤，色甘酸，腎上腺素或類似物，阿法脫氧核糖核酸酶(Pulmozyme),細月包因子或細;!包因子拮抗劑。此類細胞因子的非限制性例子包括但不限於IL-l-IL-29中任何一種。合適的劑量是本領域眾所周知的。參見，例如，Wells等人，eds.，PharmacotherapyHandbook,第2版,AppletonandLange,Stamford,CT(2000);PDRPharmacopoeia,TarasconPocketPharmacopoeia2000,DeluxeEdition,TarasconPublishing,LomaLinda,CA(2000),所述參考文獻各自整體引入本文作為參考。此類抗癌藥或抗感染藥還可以包括與本發明的至少一種抗體締合、結合、共配製或共施用的毒素分子。毒素可以任選起作用以選擇性殺死病理性細胞或組織。病理性細胞可以是癌或其他細胞。此類毒素可以是但不限於，純化或重組毒素或包含毒素的至少一個功能性細胞毒性結構域的毒素片段，例如選自蓖麻毒蛋白、白喉毒素、毒液毒素、或細菌毒素中的至少一種。術語毒素還包括由任何天然存在的、突變型或重組細菌或病毒產生的內毒素和外毒素，所述細菌或病毒可以在人和其他哺乳動物中引起任何病理狀況，包括毒素休克，這可以導致死亡。此類毒素可以包括但不限於，產腸毒素的大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT),熱穩定腸毒素(ST),志賀氏菌屬(S/z/ge//a)細胞毒素，氣單胞菌屬(Jerawo"M)腸毒素，中毒性休克症候群毒素-1(TSST-1),葡萄球菌(Staphylococcal)腸毒素A(SEA)、B(SEB)、或C(SEC),鏈球菌(Streptococcal)腸毒素等。此類細菌包括但不限於下列物種的菌林產腸毒素大腸桿菌(ETEC),腸出血性大腸桿菌(例如血清型0157:H7菌抹)，葡萄球菌屬物種(例如金黃色葡萄球菌(Stop/^/ococcM"wrews)、化膿性葡萄球菌(5Va//^/ococcws/^oge"es)),志賀氏菌屬物種(例如痢疾志賀氏菌(S/n'ge〃at/，e"/enae)、弗氏志賀氏菌(5T^ge〃",駕n')、鮑氏志賀氏菌(S/nge〃a6—/)和宋內氏志賀氏菌(幼/ge〃a))，沙門氏菌屬(Sa/m騰〃a)物種(例如傷寒沙門氏菌(Sa/m,〃a妙/n')、豬霍亂沙門氏菌(Sa/,we〃<2c/zo/era-纖's)、腸炎沙門氏菌(Sa/wowe〃aewfe"'"(3fo)),才炎菌屬(C7ov/W(i/wm)4勿種(例^口產氣莢月莫才炎菌(C7ostnWwm/e/yh'wge朋)、7艮只食才炎菌(C/cw/WJ/wm(^力'"7e)、肉毒才炎菌(C/oW"'(i/iwZ)o/Wz'"iw2)),G2m/7似06a"er物種(例如G2m//z/c^a"er7力'wm'、Caw//z/o6a"er/"us*),//W/o6""er4勿種(寸列^口//e/^^a"w/^/w7'),氣單胞菌屬物種(例如溫和氣單胞菌(爿^Zn'a)、嗜水氣單胞菌(/^/n/a)、豚鼠氣單胞菌(JeramowcwcaWae)),屍/e/卵mowtws/^ge〃o/tfess小腸結腸炎耶爾森氏菌Ue薩嫌詢co/"謡),弧菌屬(m/w)物種(例如霍亂弧菌(P76n'cwc/zo/erae)、副'溶血孓瓜菌(Kz力n'as/ara/zemo〃cws)),克雷4白氏菌屬(^7e6w'e〃i3)4勿種,4同糹錄々支單月包菌(屍sei/(io附o"ay"en/gz'wosa)和鏈球菌(S^eptococc/)。參見，例如Stein,ed.,INTERNALMEDICINE,笫3版，第1-13頁，Little,BrownandCo.,Boston,(1990);Evans等人，eds.,BacterialInfectionsofHumans:EpidemiologyandControl,第2版，第239-254頁，PlenumMedicalBookCo.,NewYork(1991);Mandell等人,gi;inciplesandPracticeofInfectiousDiseases,第3版.,ChurchillLivingstone,NewYork(1990);Berkow等人,eds.,77zeMen:^:A/朋wa/,第16版，MerckandCo.,Rahway，N丄，1992;Wood等人，FEMSMicrobiologyImmunology,76:121-134(1991);Marrack等人，Science,248:705-711(1990),所述參考文獻的內容整體引入本文作為參考。本發明的抗MCP-1抗體化合物、組合物或組合可以進一步包含任何合適輔助劑中的至少一種，例如但不限於，稀釋劑、粘合劑、穩定劑、緩沖劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑等。藥學可接受的輔助劑是優選的。此類無菌溶液的非限制性例子和製備方法是本領域眾所周知的，例》口/f旦不卩艮於Gennaro,Ed.,"e7m力g/w屍/zo777acew"'ca/5We"ces，第18版,MackPublishingCo.(Easton,PA)1990。如本領域眾所周知的或如本文描述的，可以常規選擇適合於抗MCP-1抗體、片段或變體組合物的施用方式、溶解性和/或穩定性的藥學可接受的載體。在本組合物中有用的藥學賦形劑和添加劑包括但不限於蛋白質、肽、胺基酸、脂質和碳水化合物(例如糖，包括單糖、二、三、四和寡糖；衍生糖，例如糖醇、糖醛酸、酯化糖等；和多糖或糖聚合物)，它可以單獨或組合存在，單獨或組合地構成1-99.99重量或體積％。示例性蛋白質賦形劑包括血清清蛋白，例如人血清清蛋白(HSA)、重組人清蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白等。也可以在緩沖能力方面起作用的代表性胺基酸/抗體組分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜鹼、組氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、曱硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。一種優選的胺基酸是甘氨酸。果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖:口例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麥芽糖糊精、葡聚糖、澱粉等；和糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麥芽糖醇(maltitol)、乳糖醇(lactitol)、木糖醇山梨糖醇(葡糖醇(glucitol))、肌醇等。糖。抗MCP-1抗體組合物還可以包括緩衝劑或pH調節劑；一般地，緩衝劑是由有機酸或鹼製備的鹽。代表性緩沖劑包括有機酸鹽，例如檸檬酸、抗壞血酸、葡糖酸、石友酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或鄰苯二曱酸的鹽；Tris,鹽酸三羥曱基氨基甲烷，或磷酸鹽緩沖劑。用於在本發明組48合物中使用的優選緩衝劑是有機酸鹽，例如檸檬酸鹽。此外，本發明的抗MCP-1抗體組合物可以包括聚合賦形劑/添加劑，例如聚乙烯吡咯烷酮、ficolls(聚合糖)、葡萄糖結合劑(例如環糊精，例如2-羥丙基-P-環糊精)、聚乙二醇、調味劑、抗微生物劑、增甜劑、抗氧化劑、抗靜電劑、表面活性劑(例如聚山梨醇酯，例如"TWEEN20"和"TWEEN80")、脂質(例如磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇)、和螯合劑(例如EDTA)。適合於在根據本發明的抗MCP-1抗體、部分或變體組合物中使用的這些和另外已知的藥學賦形劑和/或添加劑是本領域已知的，例如，如"Remington:TheScience&PracticeofPharmacy",第19版,Williams&Williams,(1995)以及"Physidan，sDeskReference",第52版，MedicalEconomics,Montvale,NJ(1998)中列出的，所述參考文獻的公開內容整體引入本文作為參考。優選的載體或賦形劑材料是碳水化合物(例如糖和糖醇)和緩衝劑(例如檸檬酸鹽)或聚合劑。9.製劑如上文指出的，本發明提供了適合於藥學或獸醫學用途的穩定製劑，其在藥學可接受的製劑中包含至少一種抗MCP-1抗體。如上文指出的，本發明提供了包含包裝材料和至少一個小瓶的製品，所述小瓶包含至少一種MCP-1抗體與指定緩衝劑和/或防腐劑任選溶於水性稀釋劑中的溶液，其中所述包裝材料包含標明此類溶液可以在1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小時或更長時間段內保存的標籤。本發明進一步包含製品，其包含包裝材料、包含冷凍乾燥的至少一種抗MCP-1抗體的第一個小瓶、和包含指定緩沖劑和/或防腐劑的水性稀釋劑的第二個小瓶，其中所述包裝材料包含指導患者在水性稀釋劑中重構至少一種抗MCP-1抗體，以形成可以在24小時或更長時間段內保存的溶液的標籤。如果在溼潤/乾燥系統中，那麼本發明產品中的至少一種抗MCP-1抗體的範圍包括重構後產生約1.0pg/ml-約1000mg/ml的濃度的量，儘管更低和更高的濃度是可行的且取決於計劃的遞送載體，例如溶液製劑將不同於經皮貼劑、肺、跨黏膜、或滲透或微量泵方法。水性稀釋劑任選進一步包含藥學可接受的防腐劑。優選的防腐劑包括選自苯酚、間甲酚、對曱酚、鄰甲酚、氯曱盼、苯甲醇、對羥基苯曱酸烷基酯(alkylpamben)(甲基酯、乙基酯、丙基酯、丁基酯等)、苄扎氯銨、氯化千乙氧銨、脫氫乙酸鈉和硫柳汞、或其混合物的防腐劑。在製劑中使用的防腐劑的濃度是足以產生抗微生物作用的濃度。此類濃度取決於所選防腐劑且由技術人員容易確定。其他賦形劑例如等滲劑、緩沖劑、抗氧化劑、防腐劑增強劑，可以任選且優選加入稀釋劑中。等滲劑例如甘油通常以已知濃度使用。優選加入生理學耐受的緩衝劑以提供改善的pH控制。製劑可以覆蓋寬範圍的pHs,例如約pH4-約pH10,且優選範圍是約pH5-約pH9，且最優選的範圍是約6.0-約8.0。優選地本發明的製劑具有約6.8-約7.8的pH。優選緩衝劑包括磷酸鹽緩沖液，最優選磷酸鈉，特別是磷酸緩衝鹽水(PBS)。其他添加劑例如藥學可接受的增溶劑如Tween20(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單月桂酸酯)、Tween40(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單棕櫚酸酯)、Tween80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯)、PluronicF68(聚氧乙烯聚氧丙烯嵌段共聚物)、和PEG(聚乙二醇)或非離子表面活性劑，例如聚山梨醇酯20或80或泊洛沙姆184或188,Pluronicpolyls,其他嵌段共聚物，以及螯合劑例如EDTA和EGTA可以任選加入製劑或組合物中以減少聚集。如果使用泵或塑料容器施用製劑，那麼這些添加劑是特別有用的。藥學可接受的表面活性劑的存在減輕了蛋白質聚集的傾向。本發明的製劑可以通過如下方法來製備，所述方法包括使至少一種抗MCP-1抗體和緩衝溶液以足夠提供所需濃度的蛋白質的量混合。這種方法的變化將是本領域普通技術人員可認識到的。例如，組分添加的順序、是否使用另外的添加劑、製劑製備時的溫度和pH都是可以對使用的濃度和施用方式進行最優化的因素。請求保護的製劑可以作為溶液或作為雙小瓶提供給患者，所述雙小瓶包含一小瓶冷凍乾燥的至少一種抗-MCP-l抗體，所述抗體用第二個小瓶重構，所述第二個小瓶包含在水性稀釋劑中的水、防腐劑和/或賦形劑，優選磷酸鹽緩衝液和/或鹽水和所選鹽。單個溶液小瓶或需要重構的雙小瓶都可以多次再使用，且可以滿足患者治療的單個或多個循環，且因此可以提供比目前可用的更方便的治療方案。本發明請求保護的製品對於在立即-24小時或更長時間段內的施用是有用的。因此，本發明請求保護的製品提供了對於患者的明顯優點。本發明的製劑可以任選安全地貯存於約2-約40。C的溫度，且使蛋白質的生物活性保持延長的時間段，從而允許包裝標籤標明溶液可以保持和/或在6、12、18、24、36、48、72或96小時或更長時間段內使用。如果使用防腐的稀釋劑，那麼此類標籤可以包括最高達1-12個月、半年、一年半和/或2年的使用。請求保護的產品可以通過提供給藥房、門診部或其他此類機構和設施、澄清溶液或雙小瓶間接提供給患者，所述雙小瓶包含一小瓶冷凍乾燥的至少一種抗-MCP-l抗體，所述抗體用包含水性稀釋劑的第二個小瓶重構。在這種情況下的澄清溶液的大小可以是最高達1升或甚至更大，從而提供較大儲庫(reservois),較小部分的至少一種抗體的溶液可以從其中一次或多次取出用於轉移到較小的小瓶內、且通過藥房或門診部提供給它們的顧客和/或患者。包含這些單小瓶系統的公認的裝置包括用於遞送溶液的那些筆式注射器裝置，例如BDPens、BDAutojector、HumajectNovoPen、B-DPen、AutoPen、和OptiPen、GenotropinPen、GenotronormPen、HumatroPen、Reco-Pen、RoferonPen、Biojector、Iject、J-tipNeedle-FreeInjector、Intraject、Medi-Ject,侈寸^口,^口BectonDickensen(FranklinLakes,NJ,www.bectondickenson.com)、Disetronic(Burgdorf,J島士,www.disetronic.com;Bioject,》皮蘭,Oregon(www.bioject.com);NationalMedicalProducts,WestonMedical(Peterborough，UK，www.weston-medical.com),Medi-JectCorp(Minneapolis，MN,www.mediject.com)製備或開發的。包含雙小瓶系統的公認的裝置包括用於在藥筒中重構冷凍乾燥藥物用於遞送重構溶液的那些筆式注射器系統，例如HumatroPen。本發明請求保護的產品包括包裝材料。包裝材料除了提供管理機構要求的信息之外，還提供了產品可以在其中使用的條件。對於雙小瓶、溼潤/乾燥產品，本發明的包裝材料提供了患者在水稀釋劑中重構至少一種抗MCP-1抗體以形成溶液，且在2-24小時或更長時間l殳內^f吏用溶液的說明書。對於單小瓶溶液產品，標籤標明此類溶液可以在2-24小時或更長時間段內使用。本發明請求保護的產品對於人藥學產品使用有用。體的冷凍乾燥粉末的澄清溶液。在非澄清溶液中的是包含顆粒懸浮液的製劑，所述顆粒是包含可變尺寸結構的抗MCP-1抗體的組4、物，且名稱不一地稱為微球體、微粒、納米顆粒(nanoparticle)、納米球體(nanosphere)或脂質體。如U.S.4,589,330中教導的，包含活性劑的此類相對同質、基本上球形的顆粒製劑可以通過下列方法形成使包含活性物和聚合物的水相與非水相接觸，隨後蒸發非水相以導致顆粒從水相凝聚。如U.S.4,818,542中教導的，多孔微粒可以通過下列製備使用包含在連續溶劑中分散的活性物和聚合物的第一個相，和通過冷凍乾燥或稀釋_提取_沉澱從懸浮液中去除所述溶劑。用於此類製劑的優選聚合物是天然或合成共聚物或聚合物，它們選自gleatin瓊脂、澱粉、阿拉伯半乳聚糖、清蛋白、膠原、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(s-己內酯、e-己內酯-乳酸共聚物、e-己內酯-乙醇酸共聚物、聚(卩-羥基丁酸)、聚氧化乙烷、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(曱基丙烯酸羥乙酯)、聚醯胺、聚(胺基酸)、聚(2-羥乙基DL-aspartamide)、聚(酯脲)、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/l,6-二異氰酸己烷)和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特別優選的聚合物是聚酯，例如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚U-己內酯、s-己內酯-乳酸共聚物和s-己內S旨-乙醇酸共聚物。對溶解聚合物和/或活性物有用的溶劑包括水、六氟異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、己烷、苯、或六氟丙酮倍半水合物。分散包含活性物的相與第二個相的方法可以包括施加壓力從而迫使所述第一個相通過噴嘴中的孔口以影響小滴形成。乾粉製劑可以由不同於冷凍乾燥的方法產生，例如通過噴霧乾燥或通過蒸發提取溶劑或通過沉澱結晶組合物，隨後為去除水性或非水性溶劑的一個或多個步驟。噴霧乾燥的抗體製劑的製備在U.S.6,019,968中教導。基於抗體的乾粉組合物可以通過在一定條件下噴霧乾燥溶於溶劑的抗體和任選地賦形劑的溶液或漿，以提供可呼吸的乾粉來生產。溶劑可以包括可以容易乾燥的極性化合物，例如水和乙醇。抗體的穩定性可以通過在不存在氧的情況下例如在氮氣層下，或通過使用氮作為乾燥氣體進行噴霧乾燥操作得到增強。如WO9916419中教導的，另一種相對乾燥的製劑是分散在懸浮介質中的許多有孔微結構的分散體，所述懸浮介質一般包含氫氟烷推進劑。穩定化的分散體可以使用計量的吸入器施52用於患者的肺。在噴霧乾燥藥物的商業製備中有用的設備由BuchiLtd或NiroCorp製造。本文所述的在穩定或防腐製劑或溶液中的至少一種抗MCP-1抗體可以依照本發明經由多種遞送方法施用於患者，所述遞送方法包括如本領域眾所周知的SC或IM注射；經皮、肺、跨黏膜、植入、滲透泵、藥筒、微型泵、或技術人員理解的其他方法。10.治療應用本發明還提供了使用本發明的至少一種MCP-1抗體調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關疾病的方法，如本領域已知的或如本文描述的。本發明還提供了用於調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關疾病的方法，所述疾病包括但不限於，惡性疾病、代i射疾病、免疫或炎症相關疾病、心血管疾病、傳染病、或神經疾病中的至少一種。此類狀況選自但不限於，由細胞粘附和/或血管發生介導的疾病或狀況。此類疾病或狀況包4舌免疫病症或疾病，心血管病症或疾病，傳染性、惡性和/或神經病症或疾病，或其他已知或特定MCP-1相關狀況。具體地，抗體對於治療下列疾病有用，所述疾病涉及血管發生，例如眼疾病和胂瘤性疾病，組織重建例如再狹窄，以及某些細胞類型的增殖特別是上皮和鱗狀細胞癌。具體適應症包括在動脈粥樣硬化、再狹窄、癌症轉移、類風溼性關節炎、糖尿病性視網膜病和黃斑變性治療中的用途。本發明的中和抗體還用於預防或治療不需要的骨再吸收或降解，例如如骨質疏鬆症中發現的或由某些腫瘤超表達PTHrP引起的。抗體還可能在各種纖維變性疾病的治療中有用，例如特發性肺纖維變性、糖尿病腎病、肝炎和肝硬4b。因此，本發明提供了使用本發明的至少一種MCP-1抗體調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種MCP-1相關疾病的方法，如本領域已知的或如本文描述的。具體適應症在下文討-論肺部疾病本發明還提供了用於調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種惡性疾病的方法，所述惡性疾病包括但不限於，下列中的至53少一種肺炎；肺膿腫；由粉塵、氣體或薄霧形式的試劑引起的職業性肺部疾病；哮喘，閉塞性纖維性細支氣管炎，呼吸衰竭，肺的超敏感性疾病包括超敏感性肺炎(外源性變應性肺泡炎)，變應性支氣管肺麴黴病，和藥物反應；成人呼吸窘迫症候群(ARDS),Goodpasture氏症候群，慢性阻塞性氣道病症(COPD),特發性間質性肺病例如特發性肺纖維變性和結節病，脫屑性間質性肺炎，急性間質性肺炎，呼吸細支氣管炎相關性間質性肺病，含機化性肺炎的特發性閉塞性細支氣管炎，淋巴細胞性間質性肺炎，郎格漢斯細胞肉芽腫病，特發性肺含鐵血黃素沉積症；急性支氣管炎，肺泡蛋白沉積症，支氣管擴張，胸膜病症，肺膨脹不全，嚢性纖維變性，以及肺腫瘤和肺栓塞。惡性疾病本發明還提供了用於調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種惡性疾病的方法，所述惡性疾病包括但不限於，下列中的至少一種白血病，急性白血病，急性成淋巴細胞性白血病(ALL)，B細胞、T細胞或FABALL,急性髓細胞樣白血病(AML),慢性髓細胞性白血病(CML),慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，毛細胞性白血病，骨髓異常增生症候群(MDS),淋巴瘤，何杰金病，惡性淋巴瘤，非何杰金淋巴瘤，Burkitt氏淋巴瘤，多發性骨髓瘤，卡波西肉瘤，結腸直腸癌，胰腺癌，腎細胞癌，乳腺癌，鼻咽癌，惡性組織細胞增多症，惡性胂瘤的腫瘤相關症候群/高血鈣症候群，實體瘤，腺癌，鱗狀細胞癌，肉瘤，惡性黑素瘤，特別是轉移性黑素瘤，血管瘤，轉移性疾病，癌症相關的骨再吸收，癌症相關的骨痛等。免疫相關疾病本發明還提供了用於調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種免疫相關疾病的方法，所述免疫相關疾病包括但不限於，下列中的至少一種類風溼性關節炎、青少年類風溼性關節炎、全身性發作的青少年類風溼性關節炎、牛皮癬性關節炎、強直性脊柱炎、胃潰瘍、血清陰性關節病、骨關節炎、炎性腸病、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑狼痴、抗磷脂症候群、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、特發性肺纖維變性、系統性脈管炎/韋格納肉芽腫病、結節病、睪丸炎/輸精管切除術逆向才喿"f乍(vasectomyreversalprocedures)、變應'1"生/4爭應'1"生疾病、哞喘、變應性鼻炎、溼滲、變應性接觸性皮炎、變應性結膜炎、超敏感性肺炎、移植、器官移植排斥、移植物抗宿主病、全身性炎性反應症候群、膿毒病症候群、革蘭氏陽性膿毒症、革蘭氏陰性膿毒症、培養物陰性膿毒症、真菌性膿毒症、嗜中性白細胞減少性發熱、尿膿毒症、腦膜炎球菌血症、外傷/出血、灼傷、電離射線暴露、急性胰腺炎、成人呼吸窘迫症候群、類風溼性關節炎、酒精誘導的肝炎、慢性炎性病理狀態、結節病、Crohn氏病理狀態、鐮狀細胞貧血、糖尿病、腎病、特應性疾病、超敏反應、變應性鼻炎、枯草熱、常年性鼻炎、結膜炎、子宮內膜異位、哮喘、蕁麻滲、systematicanaphalaxis、皮炎、惡性貧血、溶血病、血小板減少症、任何器官或組織的移植排斥、腎移植排斥、心臟移植排斥、肝移植排斥、胰移植排斥、肺移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、皮膚同種異體移植排斥、軟骨移植排斥、骨移植排斥、小腸移植排斥、胎兒胸腺植入物排斥、曱狀旁腺移植排斥、任何器官或組織的異種移植排斥、同種異體移植排斥、抗受體超敏反應、Graves病、Raynoud氏病、B型胰島素抗性糖尿病、哮喘、重症肌無力、抗體介導的細胞毒性、III型超敏反應、全身性紅斑狼瘡、POEMS症候群(多發性神經病、器官巨大症、內分泌病、單克隆丙種球蛋白病、和皮膚改變症候群)、多發性神經病、器官巨大症、內分泌病、單克隆丙種球蛋白病、皮膚改變症候群、抗磷脂症候群、天皰瘡、硬皮病、混合型結締組織病、特發性Addison氏病、糖尿病、慢性活動性肝炎、原發性膽汁性肝硬變、白癜風、脈管炎、MI後心切開術症候群、IV型超敏反應、接觸性皮炎、超敏感性肺炎、同種異體移植排斥、胞內生物導致的肉芽瘤、藥物敏感性、新陳代謝/特發性、Wilson氏病、血色素沉著、a-l抗胰蛋白酶缺乏、糖尿病性一見網膜病、橋本曱狀腺炎、骨質疏鬆症、下丘腦-垂體-腎上腺軸評估、原發性膽汁性肝硬變、甲狀腺炎、腦脊髓炎、惡病質、嚢性纖維變性、新生兒慢性肺疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、familialhematophagocyticlymphohistocytosis、皮膚病狀況、牛皮痺、禿頭、腎病症候群、腎炎、腎小球性腎炎、急性腎衰竭、血液透析、尿毒症、毒性、先兆子癇、OKT3療法、抗CD3療法、細胞因子療法、化學療法、放射療法(例如包括但不限於無力、貧血、惡病質等)、慢性水楊酸中毒等。參見，例如MerckManual,第12-27版，Merck&Company,Rahway,NJ(1972,1977,551982,1987，1992，1999),PharmacotherapyHandbook,Wells等人，eds.,第2版，AppletonandLange,Stamford,Conn.(1998,2000),各自整體引入作為參考。心血管疾病本發明還提供了用於調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種心血管疾病的方法，所述心血管疾病包括但不限於，下列中的至少一種心臟震昏症候群、心肌梗死、充血性心力衰竭、中風、缺血性中風、出血、動脈硬化症、動脈粥樣硬化、再狹窄、糖尿病性動脈硬化病、高血壓、動脈高壓、腎血管性高血壓、昏厥、休克、心血管系統梅毒、心力衰竭、肺源性心臟病、原發性肺動脈高壓、心律失常、心房異位搏動、心房樸動、心房纖顫(持續或陣發性)、灌注後症候群、心肺分流術炎症反應、紊亂性或多源性房性心動過速、規則狹窄性QRS心動過速、特殊心律失常、心室纖顫、希氏束性心律失常、房室傳導阻滯、束支傳導阻滯、心肌缺血性病症、冠狀動脈病、心絞痛pectoris、心肌梗死、心肌病、擴張性充血性心肌病、限制性心肌病、瓣膜心臟病、心內膜炎、心包病、心臟腫瘤、主動脈和周圍性動脈瘤、主動脈壁夾層形成、主動脈炎症、腹主動脈及其分支阻塞、外周血管病症、阻塞性動脈病症、外周動脈粥樣硬化病、血栓閉塞性血管炎、功能性外周動脈病症、Raynaud氏現象和疾病、手足發紺、紅斑性肢痛病、靜脈疾病、靜脈血栓形成、曲張4爭脈、動靜脈瘻、lymphederma、脂肪水腫、不穩定心絞痛、再灌注損傷、泵後症候群(postpumpsyndrome)、缺血-再灌注損傷等。此類方法可以任選包括給需要此類調節、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者施用有效量的、包含至少一種抗MCP-1抗體的組合物或藥物組合物。神經疾病本發明還提供了用於調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種神經疾病的方法，所述神經疾病包括但不限於，下列中的至少一種神經變性疾病，多發性硬化，偏頭痛，AIDS痴呆症候群，脫髓鞘性病，例如多發性硬化和急性橫貫性脊髓炎；錐體束外和小腦病症，例如脊髓皮質系統損害；基底神經節病症或小腦病症；運動機能亢進性運動障礙，例如亨廷頓舞蹈病和老年性舞蹈病；藥物誘發的運動失調，例如由阻斷CNS多巴胺受體的藥物誘導的那些；運動機能減退性運動失調，例如帕金森病；進行性核上麻痺；小腦結構損害；脊髓小腦變性，例如脊推性共濟失調、弗裡德賴希共濟失調、小腦皮質變性、多系統變性(Mencel、Dejerine畫Thomas、Shi-Drager和Machado-Joseph);全身病症(Refsum氏病、血卩脂蛋白缺乏症)、共濟失調、毛細血管擴張、和線粒體多系統病症)；脫髓鞘核心病症，例如多發性硬化、急性橫貫性脊髓炎；以及運動單位病症，例如神經原性肌萎縮(前角細胞變性，例如肌萎縮性側索硬化症、嬰兒脊髓性肌萎縮和青少年脊髓性肌萎縮)；阿爾茨海默氏病；中年唐氏症候群；彌散性Lewy體病；Lewy體型老年性痴呆；Wernicke-Korsakoff症候群；慢性酒精中毒；Creutzfeldt-Jakob病；亞急性硬化性全腦炎、Hallerrorden-Spatz病；和拳擊員痴呆(Dementiapugilistica)等。此類方法可以任選包括給需要此類調節、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者施用有效量的、包含至少一種TNF抗體或特定部分或變體的組合物或藥物組合物。參見，例如MerckManual,第16版，Merck&Company,Rahway,NJ(1992)。纖維變性狀況除了上述狀況和疾病之外，本發明還提供了用於調節或治療各種病因的纖維變性狀況的方法，例如肝纖維變性(包括但不限於酒精誘發的肝硬化、病毒誘發的肝硬化、自身免疫誘發的肝炎)；肺纖維變性(包括但不限於硬皮病、特發性肺纖維變性)；腎纖維變性(包括但不限於硬皮病、糖尿病性腎炎、腎小球腎炎、狼瘡腎炎)；皮膚纖維變性(包括但不限於硬皮病、肥大性和瘢痕疙疼性瘢痕形成、灼傷)；骨髓纖維變性；神經纖維瘤病；纖維瘤；腸纖維變性；和由外科手術操作引起的纖維變性粘連。本發明還提供了用於調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種創傷、外傷或組織損傷或由其產生或與其相關的慢性狀況的方法，包括但不限於，下列中的任何一種身體損傷或與外科手術相關的外傷，所述手術包括胸、腹、顱或口腔外科手術；或其中所述創傷選自無菌創傷、挫傷、割傷、撕裂傷、非穿透傷、開放性創傷、穿透傷、貫通傷、刺傷、染毒創傷、梗塞形成和皮下創傷；或其中所述創傷選自缺血性潰瘍、褥瘡、瘻、嚴重咬傷、熱灼傷和供體部位創傷；或其中所述創傷是口瘡創傷、外傷性創傷或皰滲相關創傷。供體部位創傷是例如與從身體的一個部分切除硬組織至身體的另一部分有關，例如與移植有關發生的創傷。由此類手術產生的創傷是非常疼痛的且改善的癒合因此最有價值。創傷纖維變性也順應抗MCP-1抗體療法，因為侵襲創傷區域的第一種細胞是嗜中性粒細胞，隨後為由巨噬細胞活化的單核細胞。巨噬細胞被認為是有效的創傷癒合所必需的，因為它們還負責病原性生物的吞噬作用且去清除組織碎片。此外，它們釋放涉及後續癒合過程事件的眾多因子。巨噬細胞吸引起始膠原產生的成纖維細胞。幾乎所有組織修復過程都包括早期結締組織形成、這個以及後續過程的刺激改善組織癒合，然而，結締組織和膠原的超量產生可以導致特徵為非彈性和含氧量低的纖維變性組織。本發明的抗MCP-1抗體可以在用於調節、治療或預防此類創傷癒合後遺症的方法中使用。心臟移植的慢性排斥中的至少一種症狀的方法中使用。抗MCP-1抗體的其他治療用途本發明還提供了用於調節或治療細胞、組織、器官、動物或患者中的至少一種傳染病的方法，所述傳染病包括但不限於，下列中的至少一種急性或慢性細菌感染，急性和慢性寄生物或傳染性過程，包括細菌、病毒和真菌感染，HIV感染/HIV神經病，腦膜炎，肝炎(曱型、乙型或丙型等)，膿毒性關節炎，腹膜炎，肺炎，會厭炎，大腸桿菌0157:h7,溶血尿毒症症候群/溶解血栓性血小板減少性紫癥，痴疾，登革出血熱，利什曼病，麻風病，中毒性休克症候群，鏈球菌性肌炎，氣性環疽，結核分枝桿菌，細胞內鳥分枝桿菌，卡氏肺嚢蟲性肺炎，骨盆炎症性疾病，睪丸炎/附睪炎，軍團桿菌，lyme病，a型流行性感冒，EB病毒，vital-associatedhemaphagocyticsyndrome,重要月畝炎/無菌'l"生月畝月莫炎等。本發明的任何方法都可以包括給需要此類調節、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者施用有效量的、包含至少一種抗MCP-1抗體的組合物或藥物組合物。此類方法可以任選進一步選自下列的至少一種至少一種TNF拮抗劑(例如但不限於TNF抗體或片段，可溶性TNF受體或其片段、融合蛋白，或小分子TNF拮抗劑)，抗風溼藥(例58如氨曱蝶呤、醋硫葡金、葡糖硫金、硫唑嘌呤、etanercept、硫代蘋果酸金鈉、硫酸羥氯喹、來氟洛米、柳氮磺p比咬)，肌肉鬆弛藥，麻醉藥，非類固醇消炎藥(NSAID),止痛劑，麻醉劑，鎮靜劑，局部麻醉劑，神經肌肉阻斷劑，抗微生物劑(例如氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生物劑、抗病毒劑、碳青黴烯、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環內酯、青黴素、磺胺藥物、四環素、另一種抗微生物劑)，抗牛皮齊劑，皮質類固醇(地塞米松)，促蛋白合成類固醇(睪酮)，糖尿病相關劑，礦物質，營養物，甲狀腺劑，維生素，4丐相關激素，止竭劑，止咳藥，止吐劑，抗潰瘍藥，緩瀉藥，抗凝劑，促紅細胞生成素(例如重組人類紅細胞生成素a),非格司亭(例如G-CSF,重組人粒細胞集落刺激因子)，沙格司亭(GM-CSF，白細胞素)，免疫接種，免疫球蛋白(利妥希碼)，免疫抑制劑(例如basiliximab、環孢菌素、daclizumab),生長激素，激素拮抗劑，生殖激素拮抗劑(氟利坦、尼魯米特)，激素釋放調節劑(亮丙瑞林，性瑞林)，激素替代藥物，雌激素受體調節劑(他莫西芬)，類視黃醇(維曱酸)，拓樸異構酶抑制劑(依託泊苷、依立替康)，cytoxin(阿黴素)，散瞳劑，睫狀肌麻痺藥，烷化劑(卡鉑)，氮芥(美法侖，苯丁酸氮芥(chlorabucil)),亞硝基脲(卡莫司汀、雌莫司汀)，抗代謝物(氨甲蝶呤、阿糖胞苷、氟尿嘧啶)，有絲分裂抑制劑(長春新鹼、紫杉醇)，防輻射藥物(碘131-託西莫單抗(tositumomab)),輻射敏化劑(米索硝唑、替拉扎明)，抗抑鬱藥，抗躁狂劑，抗精神病藥，抗焦慮藥，催眠藥，擬交感神經藥，興奮劑，多奈哌齊，單滿吖啶氨，哮喘藥，卩激動劑，吸入類固醇，白細胞三烯抑制劑，甲基黃嘌呤，色甘酸，腎上腺素或類似物，阿法脫氧核糖核酸酶(Pulmozyme)，細胞因子(幹擾素a-2、IL-2)或細胞因子拮抗劑(英夫單抗(inflixamab))。合適的劑量是本領域眾所周知的。參見，例如Wells等人，eds.,PharmacotherapyHandbook,第2版，AppletonandLange,Stamford,CT(2000);PDRPharmacopoeia,TarasconPocketPharmacopoeia2000，DeluxeEdition,TarasconPublishing,LomaLinda,CA(2000)，所述參考文獻各自整體引入本文作為參考。agent)施用之前^同時和/或、之後共施用或組合治療^所述抗腫瘤藥例如烷化劑、氮芥、亞硝基脲(nitrosurea)、抗生素、抗代謝物、激素激動劑或拮抗劑、免疫調諧劑等。對於在轉移性黑素瘤和其他腫瘤性疾病中的使用，優選組合是抗體與氮烯米胺、幹擾素(X、白細胞介素-2、替莫唑胺、順鉑、長春鹼、曱磺酸伊馬替尼(ImatinibMesylate)、卡莫司汀、紫杉醇等共施用。對於轉移性黑素瘤，氮烯米胺是優選的。11.施用劑量和方法
技術領域：
：本發明的方法可以包括用於治療MCP-1介導的病症的方法，包括給需要此類調節、處理或治療的細胞、組織、器官、動物或患者施用有效量的、包含至少一種抗MCP-1抗體的組合物或藥物組合物。此類方法可以任選進一步包括用於治療此類疾病或病症的共施用或組合治療，其中所述至少一種抗MCP-1抗體、其特定部分或變體的施用進一步包含在選自下列的至少一種施用之前、同時和/或之後施用腎藥、皮膚病學(dermatogical)藥物、抗血管生成藥、抗感染藥，心血管(CV)系統藥物，中樞神經系統(CNS)藥物，自主神經系統(ANS)藥物，呼吸道藥物，胃腸(GI)道藥物，激素藥物，用於流體或電解質平衡的藥物，血液學藥物，抗癌藥，免疫調諧藥物，眼、耳或鼻藥物，局部藥物，營養藥物等，至少一種TNF拮抗劑(例如但不限於TNF抗體或片段，可溶性TNF受體或其片段、融合蛋白，或小分子TNF拮抗劑)，抗風溼藥(例如氨甲蝶呤、醋硫葡金、葡糖硫金、硫唑嘌呤、etanerc印t、硫代蘋果酸金鈉、硫酸羥氯p奎、來氟洛米、柳氮磺吡啶)，肌肉鬆弛藥，麻醉藥，非類固醇消炎藥(NSAID),止痛劑，麻醉劑，鎮靜劑，局部麻醉劑，神經肌肉阻斷劑，抗微生物劑(例如氨基糖苷類、抗真菌劑、抗寄生物劑、抗病毒劑、碳青黴烯、頭孢菌素、氟喹諾酮、大環內酯、青黴素、磺胺藥物、四環素、另一種抗微生物劑)，抗牛皮褲劑，皮質類固醇，促蛋白合成類固醇，糖尿病相關劑，礦物質，營養物，曱狀腺劑，維生素，釣相關激素，止瀉劑，止咳藥，止吐劑，抗潰瘍藥，緩瀉藥，抗凝劑，促紅細胞生成素(例如重組人類紅細胞生成素a),非格司亭(例如G-CSF，重組人粒細胞集落刺激因子)，沙格司亭(GM-CSF,白細胞素),免疫接種，免疫球蛋白，免疫抑制劑(例如basiliximab、環孢菌素、daclizumab),生長激素，激素替代藥物，雌激素受體調節劑，散瞳劑，睫狀肌麻痺藥，烷化劑，抗代謝物，有絲分裂抑制劑，防輻射藥物，抗抑鬱藥，抗躁狂劑，抗精神病藥，抗焦慮藥，催眠藥，擬交感神經藥，興奮劑，多奈哌齊，曱滿吖啶氨，哮喘藥，卩激動劑，吸入類固醇，白細胞三烯抑制劑，曱基黃噤呤，色甘酸，腎上腺素或類似物，阿法脫氧核糖核酸酶(Pulmozyme),細胞因子或細胞因子拮抗劑。此類藥物是本領域眾所周知的，包括關於本文提出的每一種的配製、適應症、給藥和施用(參見，例如Nursing2001HandbookofDrugs,第21版，SpringhouseCorp.,Springhouse,PA,2001;HealthProfessional'sDrugGuide2001,ed.,Shannon,Wilson,Stang,Prentice-Hall,Inc,UpperSaddleRiver,NJ;PharmcotherapyHandbook,Wells等人,ed.，Appleton&Lange,Stamford,CT，所述參考文獻各自整體引入本文作為參考)。一般地，病理性狀況的治療通過施用有效量或劑量的至少一種抗MCP-1抗體組合物來完成，取決於組合物中包含的比活性，所述組合物總計為平均至少約0.01-500毫克至少一種抗MCP-1抗體/千克患者/劑，且優選至少約0.1-100毫克抗體/千克患者/單次或多次施用。可替代地，有效血清濃度可以包含0.1-5000ng/ml血清濃度/單次或多次施用。合適的劑量是醫學從業者已知的，且當然將依賴具體疾病狀態、待施用組合物的比活性、以及接受治療的具體患者。在某些情況下，為了達到所需治療量，可能必須提供重複施用，即特定監控或計量劑量的重複個別施用，其中所述個別施用可以重複直至達到所需日劑量或作用。伊乙選劑量可以4壬選包才舌0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100-500mg/kg/施用，或其任何範圍、值或分數，或達到下列血清濃度:0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、6116、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000|ug/ml血清濃度/單次或多次施用，或其任何範圍、值或分數。可替代地，施用的劑量可以依已知因素而變，所述因素例如具體試劑的藥物動力學特徵，及其施用方式和途徑；受體年齡、健康和重量；症狀性質和程度、目前治療種類、治療頻率和所需作用。通常活性成分的劑量可以是約0.1-100毫克/千克體重。通常0.1-50,且優選0.1-10毫克/千克/施用或緩釋形式對於達到所需結果是有效的。作為非限制性例子，人或動物的治療可以在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或可替代地或另外地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周中至少一周，或可替代地或另外地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年中的至少一年，或其任何組合，使用單次、輸注或重複劑次，作為0.1-100mg/kg的一次或定期劑量的本發明至少一種抗體提供，例如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/天。適合於內部施用的劑型(組合物)一般包含約0.001毫克-約500毫克活性成分/單位或容器。在這些藥物組合物中，活性成分一般將以基於組合物總重量的約0.5-99.999重量％的量存在。對於腸胃外施用，抗體可以配製為溶液、懸浮液、乳劑、顆粒、粉末或冷凍乾燥粉末，它們與藥學可接受的腸胃外載體結合或分開提供。此類載體的例子是水、鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液、和1-10%的人血清清蛋白。也可以使用脂質體和非水性載體，例如固定化油。載體或冷凍乾燥粉末可以包含維持等滲性(例如氯化鈉、甘露醇)和化學穩定性(例如緩衝劑和防腐劑)的添加劑。製劑可以通過已知或合適技術進行滅菌。合適的藥學載體在Remington'sPharmaceuticalSciences,A.Osol的最近版本中得到描述，所述參考文獻是這個領域的標準參考文本。可替代的施用。許多已知和開發的方式可以依照本發明使用以施用藥學有效量的根據本發明的至少一種抗MCP-l抗體。儘管在下文說明書中使用肺施用，但其他施用方式也可以根據本發明使用，產生合適的結果。本發明的MCP-l抗體可以使用適合於通過本文描述的或本領域已知的吸入或其他方式施用的多種裝置和方法中的任何一種，在載體中作為溶液、乳劑、膠體或懸浮液、或作為乾粉進行遞送。腸胃外製劑和施用。用於腸胃外施用的製劑可以包含作為普通賦形劑的無菌水或鹽水、聚亞烷基二醇例如聚乙二醇、植物來源的油、氫化萘等。用於注射的水性或油性懸浮液可以通過使用合適的乳化劑或溼潤劑和懸浮劑根據已知方法進行製備。用於注射的試劑可以是無毒的、非經口施用的稀釋劑，例如溶於溶劑的水溶液或無菌注射液或懸浮液。作為可用的載體或溶劑，水、林格溶液、等滲鹽水等是允許的；作為普通溶劑或懸浮溶劑，可以使用無菌不揮發性油。為了這些目的，可以使用任何種類的不揮發性油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成甘油單酯、或甘油二酯、或甘油三酯。腸胃外施用是本領域已知的，且包括但不限於如本領域眾所周知的常規注射方法、氣壓無針注射裝置、或雷射穿孔裝置(例如但不限於美國專利號5,851,198和美國專利號5,839,446中公開的材料和方法，所述專利整體引入本文作為參考)。可替代的遞送。本發明進一步涉及通過下列方式施用至少一種抗MCP-l抗體腸胃外、皮下、肌內、靜脈內、關節內、支氣管內、腹內、嚢內、軟骨內、腔內、體腔內、小腦內、腦室內、結腸內、頸內、胃內、肝內、心肌內、骨內、骨盆內、心包內、腹膜內、胸膜內、前列腺內、肺內、直腸內、腎內、視網膜內、脊柱內、滑膜內、胸內、子宮內、膀胱內、病灶內、快速灌注、陰道、直腸、口腔、舌下、鼻內或經皮方式。至少一種抗MCP-l抗體組合物可以製備用於腸胃外(皮下、肌內或靜脈內)或特別是以液體溶液或懸浮液的形式的任何其他施用；用於以陰道或直腸施用特別是半固體形式使用，例如但不限於乳膏和栓劑；用於口腔或舌下施用例如但不限於片劑或膠嚢的形式；或鼻內，例如但不限於粉末、鼻滴劑或氣溶膠或某些試劑的形式；或經皮，例如但不限於，凝膠、軟膏、洗劑、懸浮液或貼劑遞送系統，其含化學增強劑例如二曱基亞碸以修飾皮膚結構或增加經皮貼劑中的藥物濃度(Junginger等人In"DrugPermeationEnhancement";Hsieh，D.S.,Eds.，第59-90頁(MarcelDekker,Inc.NewYork1994,整體引入本文作為參考)，或含氧化劑，其使得包含蛋白質和肽的製劑能夠應用在皮膚上(WO98/53847),或應用電場以產生瞬間轉運途徑，例如電穿孔，或增加帶電藥物通過皮膚的運動性，例如離子電滲療法，或應用超聲，例如超聲波導入術(sonophoresis)(美國專利號4,309,989和4,767,402)(上述出版物和專利整體引入本文作為參考)。肺/鼻施用。對於肺施用，優選至少一種抗MCP-1抗體組合物以有效用於達到肺或竇的下部氣道的顆粒大小遞送。根據本發明，至少一種抗MCP-1抗體可以通過本領域已知的用於通過吸入施用治療劑的多種吸入或鼻裝置中的任何一種遞送。能夠在患者的竇腔或肺泡中沉積氣溶膠化製劑的這些裝置包括計量劑量的吸入器、霧化器、乾粉產生器、噴霧器等。適合於指引抗體的肺或鼻施用的其他裝置也是本領域已知的。所有此類裝置都可以使用適合於以用於以氣溶膠形式分配抗體施用的製劑。此類氣溶膠可以包含溶液(水性或非水性)或固體顆粒。計量劑量吸入器如Ventolir^計量劑量吸入器，一般使用推進氣體且在吸氣期間需要啟動(參見，例如，WO94/16970，WO98/35888)。乾粉吸入器如TurbuhalerTM(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由InhaleTherapeutics銷售的裝置，和Spinhale^粉末吸入器(Fisons),使用混合粉末的呼吸-啟動(US4668218Astra,EP237507Astra,WO97/25086Glaxo,WO94/08552Dura,US5458135Inhale,WO94/06498Fisons,所述專利整體引入本文作為參考)。霧化器如AERxTMAradigm、Ultravent⑧霧化器(Mallinckrodt)、和AcornII霧化器(MarquestMedicalProducts)(US5404871Aradigm,WO97/22376),上述參考文獻整體引入本文作為參考，由溶液產生氣溶膠，而計量劑量吸入器、乾粉吸入器等產生小顆粒的氣溶膠。這些商購可得的吸入裝置的具體例子意在代表適合於本發明實踐的具體裝置，且不意在是本發明範圍的限制。優選地，包含至少一種抗MCP-1抗體的組合物由乾粉吸入器或噴霧器遞送。對於施用本發明的至少一種抗體，吸入裝置有幾個所需的特徵。例如，通過吸入裝置遞送有利地是可靠的、可再現的和精確的。為了良好的可呼吸性，吸入裝置可以任選遞送小的乾燥顆粒，例如小於約10ium,優選約l-5]iim。實施例1:作為非限制性例子使用噬菌體展示產生對MCP-1特異的MCP-1抗體申請人先前已顯示鼠抗人MCP-1抗體的有利的治療特徵，所述抗體命名為C775且在申請人共同未決的專利申請美國系列號11/170453(那個申請關於重和輕鏈可變區分別為SEQIDNO:7和8)和相關文件中描述。本次努力的目標是從HuCALGOIX^中鑑定至少一種人抗體，所述抗體中和人細胞因子MCP-1的生物學活性且顯示相似屬性。C775抗體，以及因此所需的人抗MCP-1抗體的屬性由下文扭無述的成功標準限定。至少一種治療抗體的成功標準以固相形式與人MCP-1結合；特異性限定為在100nM時缺乏與同源蛋白質人MCP-2、3、4以及人嗜酸性粒細胞趨化因子1、2和3的結合；抑制人MCP-1與其在Thp-l細胞上的人受體CCR2的結合，且IC50值小於參考FabC775;抑制人MCP-1介導的THP-1細胞的趨化性，且IC50值小於參考FabC775;在次級生物測定(例如Ca2+動員或CCL-2誘導的受體內在化)中抑制人MCP-1介導的活性，作為定性的是/非標準，或在定量測定中具有與參考FabC775可比較的效力；與人MCP-1結合的Kd<0.5nM;與短尾猴MCP-1結合的KD<20nM,且優選<10nM;以可比較的效力抑制天然人MCP-1和化學合成的人MCP-1的生物活性；在Fab再工程改造成IgG後、且在C775的全長IgG形式作為比較物(comparator)的基礎上保留標準1-8。選擇過程概述使用HuCALGOLD⑧進行了10次不同的淘選，且篩選了17856個克隆，從而產生1104個初步命中。最後在ELISA中鑑定了結合合成的人MCP-1的26個獨特Fabs。在那些中，才艮據親和力、生物活性、特異性以及與短尾猴和天然人MCP-1的結合選擇7個不同的Fabs用於親和力成熟。親本Fabs的親和力為10-400nM，且在放射性配體結合測定中的IC5o值為10-600nM。材津牛和方法DNA限制和修飾酶以及聚合酶購自Invi加gen(Carlsbad,CA,USA)、NewEnglandBiolabs(Beverly,MA,USA)、RocheDiagnostics(Mannheim,德國)和MBIF匿entas(Vilnius,立陶宛)。特異性POD綴合的山羊抗人IgGF(ab，)2片段由Jacksons(WestGrove,PN,USA)提供，綿羊抗人IgG、Fd片段特異性抗體由TheBindingSite(Birmingham,UK)提供，且與鹼性磷酸酶綴合的鏈黴抗生物素蛋白(ZyMAXTM級別)由ZymedLaboratories(SanFrancisco,CA,USA)提供。重組人細胞因子hMCP-1、2、3、4以及hEotaxin1、2和3(R&Dsystems)試劑、配體和抗體mAb279，對MCP-1特異(R&Dsystems);合成hMCP-1(Bachem);mAbl小鼠抗hCCR2生物素(R&Dsystems);人y球蛋白(JacksonImmunoResearch);小鼠y^求蛋白(JacksonImmunoResearch);mAbmlgG2b同種型對照生物素(R&Dsystems);鏈黴抗生物素蛋白-PE(BDPharmingen);Versene(Invitrogen;PBS(Invitrogen).FCS(PAN);V底孔板(Greiner);和U底孔板(Nunc)。MCP-1多肽和類似物的製備。如申請人的共同未決的申請美國系列號No.60/682620和Kruszynski等人2006，JPeptideSci.12:25-32中描述的，分步固相肽合成和親和純化以提供分離的、全長、成熟(76個胺基酸)以及正確摺疊和任選修飾的人MCP-1和變體，其具有生物學活性。設計成顯示天然表面拓樸學和肽主鏈結構的變體包括A40S、V41I和F43Y。化學合成也提供了使用K69和K75處的賴氨酸的s-氨基用於人MCP-1位點特異性生物素化的方法，所述賴氨酸不涉及受體結合或表面活性、在結構中是紊亂的(美國系列號60/682620和Kruszynski等人2006,JPeptideSd.12:354-360)。4個乙烯氧基單位(PEG4)的親水間隔基插入生物素和賴氨酸殘基的e-氨基之間。從生物素醯胺到末端羰基的鏈長是19.2A。選擇間隔基以增加溶解性且提供足夠的間隔基長度以用於結合鏈黴抗生物素蛋白綴合物。MCP-1和變體的序列在SEQIDNO:1中提供。測定變體保留在THP-1細胞中誘導Ca2+動員的能力。生物素-Lys69和生物素-Lys75MCP-1在篩選、固結和親和力測定中並排進行比較，且沒有觀察到顯著差異。使用Biacore，35個最優化的Fabs對鏈黴抗生物素蛋白晶片上固定的MCP-1lie41,Lys(生物素-PEG4)69和MCP-1lie41,Lys(生物素-PEG4)75平行進行分析。一般而言對MCP-1K69和K75測量的親和力是可比4支的。噬菌體Fab文庫。噬菌粒文庫基於HuCAL⑧概念(Knappik等人，2000),且使用CysDisplayTM技術用於在噬菌體表面上展示Fab(Ldhnmg,2001)。文庫編碼作為與小外殼蛋白pIII的融合物、在M13噬菌體上展示的大約101個獨特的Fabs。對於選擇，將HuCALGOLD⑧抗體-噬菌體分成包含不同VH主基因的3個庫。此外在1個庫(VH1-6)中使用完整文庫。對於每次淘選使用2X10"HuCALGOLD⑧輸入噬菌體。應用4種不同的淘選策略，包括分別對人MCP-1類似物-1(V41I,Ile")和類似物-2(F43Y,Tyr43)的3輪淘選，以及按照1-2-1和2-1-2的順序對類似物的2次交替淘選。固相淘選。在PBS,pH7.4中50貼/ml的100pl等分試樣的人MCP-1類似物-1(V41I)或類似物-2(F43Y)直接包^皮在Maxisorp⑧孔上(NalgenNunc,Rochester,NY)於4。C過夜。包^皮的孔進行洗滌且用5%MPBS(PBS,5%低脂乳粉)封閉。每孔加入100pl封閉的HuCALGOU^噬菌體於RT2小時。幾個洗滌步驟後，結合的噬菌體通過溶於10mMTris/HCl，pH8.0的100[il20mMDTT進行洗脫，於RT溫育10分鐘。洗脫物用於感染中期大腸桿菌TG1(Stratagene,Amsterdam,荷蘭)，且噬菌粒如所述的進行擴增(Krebs等人，2001)。針對人MCP-1類似物-1(V41I)和類似物-2(F43Y)的半溶液淘選產生中和Fab分子。半溶液淘選通過下列進行將2種生物素化的人MCP-1衍生物-V411,K69-PEG-生物素或V41I,K75-PEG-生物素(SEQIDNO:1)與HuCALGOLD⑧噬菌體在溶液中溫育，隨後使噬菌體抗原複合物捕獲至Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene微量滴定板條(PERBIO)。對於淘選，1.5mlEppendorf管於4°C用由PBSO/N1:1,希釋的Chemiblocker(ChemiconInternational)佳'於閉。下一天Reacti-BmdTMNeutrAvidinTM(Pierce,Rockford，IL，USA)微量滴定板條(結合能力25皮摩爾生物素/孔；PERBIO)用2x300|ulPBS漂洗，這是減少neutravidin結合劑的數目的2個預先吸附步驟所需的。每孔加入在10050%Chemiblocker(Chemicon),0.05%Tween20(Sigma)中來自HuCALGOLD文庫的2x1013個噬菌體，且於RT輕微振蕩封閉l小時。對於第2個預先吸附步驟，將噬菌體溶液轉移至新Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene微量滴定板條，且於RT輕微振蕩溫育1小時。隨後向預先封閉的1.5mlEppendorf管中加入預先吸附的噬菌體和生物素化的抗原(對於生物素化生物素與抗原的比率為3:1;終濃度為200nM),且於RT在旋轉輪上進行1小時溫育。平行地，進一步的Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene樣i量滴定4反條用2x300julPBS漂洗，用由PBS1:1稀釋的300plChemiblocker封閉1小時，且用1x30(^1PBS洗滌。100^1/孔的生物素-抗原-噬菌體複合物用移液管移液到微量滴定板條內，且於RT輕微振蕩溫育1小時。幾個洗滌步驟後，結合的噬菌體通過溶於10mMTris/HCl，pH8.0的110pi20mMDTT進行洗脫，於RT溫育10分鐘。洗脫物用於感染中期大腸桿菌TGI(Stratagene,Amsterdam,荷蘭)，且噬菌粒如所述的進行擴增(Krebs等人，2001)。所選Fab片段的亞克隆和微量表達(Microexpression)。為了促進可溶性Fab的快速表達，編碼所選HuCALGOLD噬菌體插入片段的Fab經由J^al和EcoRI亞克隆到表達載體pMORPH⑧X9—FH內。Fab片段攜帶C末端FLAG標記(Prickett等人，1989)和作為第二個C末端標記的6xHis標記(Chen等人，1994)。TG1-F轉化後，如先前所述進行包含HuCAL-Fab片段的周質提取物的單個克隆表達和製備(Rauchenberger等人，2003)。如上所述進行對人MCP-1類似物-1(V41I)的固相形式的結合測定法。封閉後加入周質提取物。通過與山羊抗人IgG，F(ab')2片段特異性抗體溫育進行Fab片段的檢測。對固定化的生物素化hMCP-1V411的篩選使用Reacti-BindTMNeutrAvidin384孔板(Pierce,Rockford，IL,USA)進行，所述384孔板用在PBS,pH7.4中稀釋的20pi0.5pl/ml生物素化的hMCP-1類似物-1(V41I)或類似物-2(F43Y)包被，於4。C進行16小時。用溶於TBS,0.05%Tween20(Sigma,St.Louis,MO,USA)中的1。/。BSA於RT封閉1小時後，加入周質提取物。通過與山羊抗人IgG,F(ab')2片段特異性抗體溫育進行Fab片段的檢測。對生物素化hMCP-l類似物-1(V41I)的固相篩選通過下列進行用在PBS,pH7.4中l:1000稀釋的20pl綿羊抗人IgG,Fd片段特異性抗體於4。C包被Maxisorp(Nunc,Rocheoter,NY,USA)384孔板16小時。用溶於TBS，0.05%Tween20(Sigma，St.Louis,MO,USA)中的3%BSA於RT封閉2小時後，加入周質提取物。隨後允許捕獲的HuCAL-Fab片段與溶於TBS中的0.2pg/ml生物素化的hMCP-1類似物-1(V41I)結合，所述結合通過與綴合至鹼性磷酸酶的鏈黴抗生物素蛋白溫育，隨後力口入AttoPhos螢光底物(RocheDiagnostics,Mannheim,德國)進行檢測。記錄用430nm處的激發在535nm處的螢光發射。生物活性測定細胞培養。所有細胞在標準化條件下於37"和5。/。C02在溼潤培養箱中進行培養。表達CCR2的細胞在標準培養基中生長。另外，THP-1細胞(人急性單核細胞性白血病細胞)在包含2mML-穀氨醯胺、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES和1.0mM丙酮酸鈉，90%;10%胎牛血清(FBS;VitacellRPMI20-2001,ATCC,Manassas,VA)的RPMI中以4-8x105細胞/mL的密度於37°C和5%C02進行培養放射性配體結合測定。竟爭測定在微孔過濾器板(Millipore,Bedford,MA)中進行。1x106THP曙1細胞/孔與125I-MCP-1(1ng/mL;PerkinElmerLifeScience,Boston,MA),連同不同濃度的重組人(rh)MCP-1(279-MC,R&DSystems,Minneapolis,MN)或合成蛋白質溫育。所有試劑都在由RPMIMedium1640(InvitrogenCorp.,GrandIsland,NY)和0.iyoBSA組成的結合緩沖液中進行稀釋。允許竟爭於RT進行1小時，且孔用150iuL/孔洗滌緩衝液(結合緩沖液+1MNaCl)洗滌3次。過濾器上的方丈射性4吏用WallacWizard1470AutomaticGammaCounter(PerkinElmerLifeSciencesInc.,Boston,MA)進行計數。計算可變劑量的重組或合成MCP-1對125I-MCP-1與CCR2結合的抑制百分比。隨後將抑制百分比值輸入GraphpadPrism程序中，且使用S形劑量應答曲線用可變斜率以及底部=0和頂端=100的常數進行作圖。鈣動員測定。Ca^動員測定以96孔的形式進行，其中使用the69FLEXstationTMCa2+PlusAssayKit(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)根據製造商關於非貼壁細胞的規程和FLEXstationTM(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)。將RFU峰值輸入GmphpadPrism中用於分析。MCP-1誘導的CCR2受體內在化FACS測定。最優化配體濃度(合成MCP-1的EC50~100ng/ml)和溫育時間(1小時後大多數內在化已發生)後，通過加入不同濃度的抗體測定IC50。培養的CCR2表達細胞用PBS洗滌，且於37。C用Versene(Invitrogen)分離約10分鐘。細胞的所有離心步驟為約200Xg。細胞用FACS緩沖液(PBS/3%FCS)洗滌2次，計數且檢測生存力(臺盼藍)。96V底孔板(Greiner)每孔裝滿在lOOpl中的2.5xls細胞且置於冰上。在96U底孔板(Nunc)中，抗體在細胞培養基(MEME)中進行稀釋以產生一式三份樣品中的約200^g/ml直到0,001pg/ml。不同濃度的抗體與終濃度為100ng/ml的合成MCP-l(Bachem)於RT預溫育10分鐘。細胞用預溫育的100piMCP-1/抗體混合物重懸浮且於37匸在培養箱中溫育1小時用於受體內在化。內在化後，細胞用180iliI冷FACS緩沖液洗滌1次，且對於所有後續步驟板必須維持在水上以阻止進一步的內在化。生物素化的小鼠抗hCCR2mAb(R&DSystems)在FACS緩沖液中1:10稀釋。作為對照，小鼠IgG2b同種型生物素(IsotypeBiotin)mAb(R&DSystems)同樣在FACS緩衝液中1:10稀釋。將終濃度為10pg/ml的人和小鼠y球蛋白(JacksonImmunoResearch)的1:1混合物加入抗hCCR2和對照mAb以封閉Fc受體。細胞在抗CCR2"球蛋白混合物(或對照IgG2b"球蛋白混合物)中重懸浮，且在水上溫育1小時。細胞用180plFACS緩衝液洗滌2次，在50pi1:400稀釋的鏈黴抗生物素蛋白-PE(BDPharmingen)中重懸浮，且在黑暗中在冰上於4。C溫育1小時。細胞用180piFACS緩衝液洗滌2次，在100^12%PFA/PBS中重懸浮，且於4。C貯存過夜用於固定(可替代地無需PFA固定的直接測定也是可能的)。對於FACS測量，細胞用200plFACS緩衝液重懸浮且各自計數至少5000個細胞。親和力測定關於Kd測定的溶液平^軒滴定(SET)法和使用BioVeds的交叉反應性研究。溶液中的親和力測定基本上如文獻(Friguet等人，1985)中所述的進行。為了改善SET法的靈敏性和精確性，它從經典ELISA轉移到基於ECL的BioVeris技術(Haenel等人，2005,被接受用於在爿w".(y〃ca/j5z'oc/zem/^7>7中出版)。lmg/ml山羊抗人(Fab)2或山羊抗小鼠IgG,Fc片段特異性抗體(JacksonImmunoResearch)用BV-tagTMNHS-Ester(BioverisEurope,Witney，Oxfordshire,UK)根據製造商的說明書進行標記。實-瞼在聚丙烯農t量滴定板中進行，且含0.5。/。BSA和0.02%Tween20的PBSpH7.4作為測定緩衝液。未標記的抗原以4n系列進行稀釋對於人和短尾猴MCP-1,選擇10pM-40nM的濃度範圍，且對於交叉反應性對照(嗜酸性粒細胞趨化因子和MCP-2)選擇40pM-160nM的濃度範圍。不含抗原的孔用於測定Sma;c值。加入100pMFab或IgG(在75終體積中的終濃度)後，混合物於RT溫育2小時。隨後每孔加入用0.25|ng/ml生物素化的MCP-1(K69)包被的25piDynabeads(0.4mg/mlM-280鏈黴抗生物素蛋白，DYNAL,Hamburg)、和對於抗人Fab終稀度為1:4000或對於抗小鼠IgG終稀度為1:2000的BV標籤標記的4企測抗體的混合物。於RT在Eppendorf搖動器(700rpm)上溫育30分鐘後，使用M-384SERIESWorkstation(BioverisEur叩e)檢測電化學發光信號。數據使用Origin5.0(Microcal)軟體應用定製的擬合模型進行評估(對於Fab:Haenel等人，2005，被接受用於在」冊(y〃ca/^oc/2e,'W/7中出版；對於IgG:根據Piehler等人，1997)。對直接包被的抗原的BiacoreK。測定。動力學常數k如和k。ff使用與共價固定化MCP-1結合的系列稀釋的各自Fab、使用BIAcore3000儀器(Biacore,Uppsala,瑞典)進行測定。對於共價抗原固定化，使用標準EDC-NHS胺偶聯化學。動力學測量在PBS(136mMNaCl,2.7mMKC1,10mMNa2HP04,1,76mMKH2P04pH7.4)中以20pl/分鐘的流速使用1.5-500nM的Fab濃度範圍進行。關於每種濃度的注射時間是1分鐘，隨後為3分鐘的解離相。對於再生使用5^10mMHC1。所有傳感圖(sensograms)都使用BIA評估軟體3.1(Biacore)進行擬合。對生物素-K69人MCP-1和短尾猴MCP-1的BiacoreKd測定。生物素-K69人MCP-1和生物素化的短尾猴MCP-1包被至鏈黴抗生物素蛋白晶片表面，且短尾猴MCP-1直接包被至CM5晶片。Fabs的結合使用標準方法進^f亍測試。在抗體捕獲才莫式中的BiacoreKo測定。Fabs在CM5晶片(流速5^1/分鐘)上用抗hFab(s.3.15)以500nM進行捕獲，注射每種類似物(MCPl、2、3、4以及嗜酸性粒細胞趨化因子、嗜酸性粒細胞趨化因子-2和-3)的溶液。所有細胞因子是無載體的且以15-500nM的濃度(對於親本Fabs在最優化前)用作分析物用於親和力測定。傳感圖使用BIAevaluation軟體進行分析。在抗體捕獲模式中對MCP-1的Biacore親和力測定對於最優化的結合劑是不可能的，因為達到了Biacore的檢測極限。對於Fabs的特異性分析，使用表面等離子體共振(Biacore3000,Uppsala,瑞典)，其中使用捕獲測定。Fabs被捕獲且各種蛋白質(MCP-2、-3、-4以及嗜酸性粒細胞趨化因子-1、-2和-3)用作分析物。在所有4個流動室上，CM5晶片(Biacore,瑞典)用6500-8000RU抗-F(ab)2(Dianova,AffipureF(ab)2片段山羊抗人IgG,F(ab)2片段特異性；10mM乙酸鹽緩沖液，pH4.5)包被，其中使用標準EDC-NHS胺偶聯化學。流動室2-4用特異性抗MCP-1Fabs(流速為10pl/ml的20pl500nMFab,產生300-400RU的捕獲密度)進行捕獲。Fabs捕獲後，注射濃度為100nM的趨化因子(20^1,流速20(il/分鐘，PBSpH7.4)。趨化因子以小等分試樣貯存，且對於測量只使用具有最多l個凍融循環的新解凍的材料。為了避免由MCP-1的解離率、Fab特異性相互作用和抗Fab/Fab相互作用引起的解離率組合，注射緩衝液以測定抗Fab/Fab相互作用的解離。達到的血清傳感圖從特異性1中減去。應答單位對在表面上的捕獲抗體量進行標準化。在抗體捕獲模式中與天然MCP-1的結合。方法如上所述使用。天然MCP-1從PANC1上清液中進行純化且用於結合分析。在Fab捕獲模式中與天然MCP-1的結合良好地在檢測極限上，然而，由於提取物中的雜質混淆了天然MCP-1的正確濃度，所以真正的親和力測量是不可能的。至IgG的轉化為了表達全長IgG,重鏈(VH)和輕鏈(VL)的可變結構域片段從Fab表達載體中亞克隆到合適的pMorphJiIg載體中用於人IgGl、人IgG4、嵌合人/小鼠IgGl和IgG2a。限制酶EcoRI、A^d、祝pl用於將VH結構域片段亞克隆到pMorph—WgGl.l、pMorph—WgG4.1、pMorph—mIgGl.l或pMorph—mlgG2a.1內，且EcoRV、5wWI用於將VL結構域片萃殳分別亞克隆到pMorph_hIgK_l、pMorph—hlg人J、72pMorph—mlgK—1或pMorph—mlg人—1內。所得到的IgG構建體在CNTO表達。結果固相淘選對直接包^皮至Maxisorp板的hMCP-1(411)和hMCP-1(43Y)進行。應用各包含3輪選擇的4種不同的淘選策略。亞克隆到表達載體pMORPHx9—Fab—FH內後，對直接包^L的hMCP-1(411)和生物素化的hMCP-1進行固相篩選。在初步篩選中總共分析了8832個克隆，且獲得了983個初步命中。最後鑑定了5個獨特的Fabs,但所有5個Fabs在細胞測定中都不中和MCP-1,從而表明直接包被至Maxisorp可能損害了中和表位的構象或至少可接近性。如所述的進行半溶液淘選，在溶液中溫育生物素化的人MCP-1類似物-1(V41I)和類似物-2(F43Y)與HuCALGOLD⑧噬菌體，隨後捕獲噬菌體抗原複合物。應用2種不同的主要淘選策略，包括分別對生物素化的人MCP-1蛋白質類似物-l(V41I)和類似物-2(F43Y)的3輪淘選(無交替淘選)。在初步篩選中總共分析了9024個克隆，且獲得了121個初步命中，最後揭示了18個獨特的結合劑。基於Luminex對來自對生物素化的人MCP-1蛋白質類似物-1(V41I)淘選的192個克隆的再篩選導致產生9個另外的初步命中和3個另外的獨特結合劑，從而顯示Lummex篩選是捕獲篩選的合適的可替代篩選方法。從半溶液淘選中鑑定總共21個獨特的結合劑，且這些結合劑中的14個顯示中和活性。來自HuCALGOLD⑧的所有中和Fabs都來源於這次淘選。HuCALGOLDFabs的表徵。獨特Fabs^皮表達且純化以用於進一步表徵。hMCP-l的結合親和力通過BIAcore測定且Fabs在下列測定中進行表徵1)125I-CCL-2與Thp-l細胞結合的抑制和2)在Thp-l細胞中hMCP-2誘導的Ca2+動員的抑制。在基於細胞的測定中顯示中和活性的Fabs進一步測試1)與合成短尾猴hMCP-2的結合；2)與hMCP-2家族相關人趨化因子的結合用於結合特異性(即MCP-2、3、4以及嗜酸性粒細胞趨化因子1、2、3);和3)與天然人hMCP-2的結合，以確保使用合成hMCP-2肽選擇的Fabs識別天然hMCP-2。選擇具有最佳特性的7個Fabs用於另外的親和力成熟。選擇用於親和力成熟的Fabs的特性在表2中概括。選擇用於親和力成熟的這7個Fabs分配到3個組用於文庫克隆和選擇。L-CDR3和H-CDR2最優化平行進行。輕和重可變鏈的平行最優化產生了經由交叉克隆組合改善的重和輕鏈以產生再進一步改善的抗體的可能性。表2.選擇用於親和力成熟的Fab候選物的概括。tableseeoriginaldocumentpage74實施例2:來自Fabs的高親和力、MCP-1特異性抗體的評估如指出的，用於親和力成熟的候選物選擇對游離Fab形式的候選物進行。選擇標準是在放射性配體結合測定中的活性，在Ca2+動員測定中的活性，通過Biacore測量的對人MCP-1的親和力，對人MCP-1的特異性，對短尾猴MCP-1的親和力以及在Biacore中檢測的與天然MCP-1的結合。關於親本Fabs分組的另外標準是在ELISA中的C775竟爭，且基於可變重和輕鏈的構架家族。成熟候選物作為IgG的表徵，特別是在趨化性測定中，與成熟選擇過程平行進行。選擇用於成熟的7個Fabs分成3個不同的序列種類。在1類(組1,表2)中，Fabs03336、03464、03468和03470具有V入3輕鏈構架與2個不同重鏈構架中的1個。Fabs03336和03464具有VH3重鏈構架，且Fabs03468和03470具有VH1B重鏈構架。第2類Fabs(組2,表2),03471和03473具有VH1A重鏈構架和Vk3輕鏈構架。Fab03548具有與第1類中的2個Fabs相同的重和輕鏈構架(VH3,VX3)但單獨維持(組3,表2),因為它具有特別有效的生物活性和與嗜酸性粒細胞趨化因子的結合交叉反應性。關於本文使用的可變區序列分類的完整描述，參見整體引入作為參考的美國專利號6828422。後來成熟的目標是在增加特異性的同時改善03548對CCL-2的親和力。成熟前，在BiacoreFab捕獲才莫式中只測定與短尾猴和天然人MCP-1的結合而不是親和力。所有7個親本Fabs都顯示與短尾猴和天然MCP-1結合，這是用於成熟的先決條件。親本IgGs的結合特異性。所有7個親本Fabs轉化成IgGl後，對IgG形式重複交叉反應性研究。嗜酸性粒細胞趨化因子3與傳感器晶片上的葡聚糖表面非特異性結合，且這種非特異性結合可以通過添加羧曱基葡聚糖竟爭失去。因為與其他趨化因子的葡聚糖表面的非特異性結合也是可能的，所以在所有Biacore特異性測定中添加羧曱基葡聚糖。與Fabs相反，2個IgGs沒有顯示與人MCP-1的顯著結合，有趣的是滿足所有成功標準的所有4個最後結合劑都來自l個親本Fab。MCP-1(應答單位)的結合信號通過表面上的捕獲抗體的量進行標準化摩爾結合比率=(結合抗原的RU/抗原的MW)X(mAb的MW/表面上捕獲的mAb的RU),且小於0.5的摩爾結合比率預期是不顯著的。4個IgGs顯示與MCP-1的標準化結合比率>0.5且與所有同源趨化因子的標準化結合比率<0.5,且因此在IgG水平上稱為特異性的。l個IgG也顯示與MCP-2和嗜酸性粒細胞趨化因子的某些結合，這在Fab水平上已得到4企測，但這種交叉反應性在IgG水平上減少。MOR03468IgG的數據未顯示。I125MCP-1與THP-1細胞結合的抑制(CNTO)。IgGl形式的親本結合劑的中和活性首先在放射性配體結合測定中進行測試。通過添加無關人IgGl封閉THP-1細胞上的Fc受體後，MCP-1結合的抑制對於所有親本IgGs都是可檢測的。4個IgGs顯示抑制放射性標記的人MCP-1與THP-1細胞的抑制，其IC5o值在參考IgGC775的範圍內。鈣動員的抑制(CNTO)。所有親本IgGs都抑制THP-1細胞中MCP-1誘導的鈣動員。4個IgGs顯示與參考IgGC775比較在較高的抗體濃度上抑制MCP-1誘導的鈣動員。MCP-1誘導的趨化性的抑制(CNTO)。因為親本Fabs在趨化性測定中無法測試，所以MCP-1誘導的趨化性的抑制以IgG形式測試。測試的所有親本IgGs在趨化性測定中都是有活性的，且4個IgGs顯示與參考IgGC775比較在較高的抗體濃度上抑制MCP-1誘導的趨化性。實施例3:所選Fab通過L=CDR3/H=CDR2盒平行交換的親和力成熟親和力成熟過程的扭無括在第1輪成熟中，L-CDR3最優化和H-CDR2最優化平行進行。來自每類Fabs的DNA匯集用於成熟文庫構建。來源重鏈CDR2和輕鏈CDR3序列對於每個DNA庫由隨機化序列置換，從而產生6個新文庫3個隨機化的H-CDR2和3個隨機化的L-CDR3文庫。6個文庫各自的多樣性超過108個獨特的Fabs。合成CCL-241I-生物素-K69肽用於溶液淘選或neutravidin包糹皮的塑料孔上捕獲的生物素-肽淘選。6個文庫各自在各種條件下淘選以富集具有緩慢解離率的Fabs(即延長的洗滌、減少的抗原濃度)。進行36次平4亍淘選，包括溶液和半溶液淘選。減少抗原濃度、選擇解離率以及延長的洗滌導致產生嚴格淘選條件。親和力篩選藉助於基於BioVeris(以前的IGEN)電化學發光(ELC)的平臺進行，從而允許高通量的親和力分等和鑑定具有改善親和力的Fab分子。用於親和力成熟的文庫。因為H1A和H1B的重鏈H-CDR2文庫分別進行克隆，所以克隆了7個不同的可變區文庫。2個H1A和H1B文庫隨後在選擇之前匯集，從而產生6個選擇文庫。文庫大小為108-8xl09。除了MOR03548X3L-CDR3文庫外，對於所有文庫覆蓋了所有理論多樣性，在所述MOR03548L-CDR3文庫中只覆蓋了0.625x的理論多樣性。文庫的質量控制通過隨機挑選的克隆的測序來進行。75個序列中的71個(95%)是正確和多樣的，而對於75個序列中的4個檢測出移碼。所有親本Fabs的衍生物都在其各自的文庫中找到。為了增加所選抗體片,殳的親和力和生物學活性，L-CDR3和H-CDR2區域通過盒誘變使用三核苷酸指導的誘變進行平行最優化(VirneMs等人，1994),而構架區保持恆定。克隆用於親和力成熟之前，所有親本Fab片段都經由ZMI/五coRI從相應的表達載體(pMORPH⑤X9—FH)轉移到CysDisplay載體MORPH25—LHC內。pMORPH25—LHC由HuCALGOLD⑧展示載體pMORPH23—LHC通過去除幹擾文庫克隆進行H-CDR2最優化的1個AwHII位點來製備。對於親本Fab片l殳庫的L-CDR3最優化，結合劑庫的輕鏈的L-CDR3、構架4和恆定區(405bp)通過Sp/I/Sp/zI去除，且用多樣化的L-CDR3s譜連同構架4和恆定結構域置換。這種L-CDR3盒的設計、合成和克隆將在其他地方描述(準備中的原稿)。5ng結合劑庫載體與3倍摩爾過量、攜帶多樣化的L-CDR3s的插入片段連接。在第2個文庫組中，H-CDR2(Z/7oI/^^//II)是多樣化的，而連接構架區保持恆定。為了監控克隆效率，在多樣化的H-CDR2盒克隆進去之前，親本H-CDR2用虛設物置換。7個不同文庫的連接混合物在4ml大腸桿菌TOP10F細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)中進行電穿孔，從而產生1x108-8x109個獨立克隆。這個文庫大小確保了理論多樣性的覆蓋度。文庫擴增如先前所述(Rauchenberger等人，2003)進行。對於質量控制，隨機挑選單個克隆並進行測序(SequiServe,Vaterstetten，德國)。針對人生物素-K69MCP-l(V41I)的半溶液淘選用於親和力成熟。從最優化文庫中杏S救出的1x1013個噬菌體在Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene微量滴定板條上預先吸附2次，且隨後用ChemiBLOCKER(Chemicon,Temecula,CA,USA)去t閉。預先吸附的噬菌體和不同濃度的生物素-K69MCP-l(0.02-50nM)在溶液中於22。C溫育1.5小時，隨後使噬菌體-抗原複合物捕獲至Reacti-BindNeutravidinCoatedPolystyrene微量滴定板條(PERBIO)。於22。C的洗滌步驟延伸至最多12小時。通過溶於10mMTris/HCl，pH8.0的20mMDTT的洗脫、以及每輪淘選之間的噬菌粒擴增如上所述進行。針對人生物素-K69MCP-l(V41I)的溶液淘選用於親和力成熟。如上所述從親和力成熟文庫中拯救出的1x1013個噬菌體用ChemiBLOCKER(Chemicon,Temecula,CA,USA)，0.05%Tween20(Sigma,St.Louis,MO,USA)封閉，且在通過不含Tween20的ChemiBLOCKER封閉的DynabeadsM-280Streptavidin(DynalBiotech,Oslo,挪威)上預先吸附2次。在3輪淘選期間應用抗原減少，且生物素-K69MCP-1的濃度為0.01至最高5nM。封閉的Dynabeads和磁性顆粒分離器MPC-E(DynalBiotech,Oslo,挪威)用於捕獲與生物素化抗原結合的噬菌體。洗滌步驟(Rauchenberger等人，2003)、通過溶於10mMTris/HCl,pH8.0的20mMDTT的洗脫、以及每4侖淘選之間的噬菌粒擴增如上所述進行。此外淘選嚴格性通過選擇解離率(Hawkins等人，1992)和通過延長的洗滌步驟(最高達6小時)進一步增加。篩選了3312個克隆，且鑑定了來自7個親本Fabs中的4個的85個最優化Fabs。鑑定在L-CDR3和H-CDR2中最優化的Fabs,且對於2個不同親本克隆的衍生物進行改良輕和重鏈的交叉克隆，從而導致產生親和力(Kd)最高達100倍的進一步改善。Kd估計為~l-10nM的最高級別的結合劑(約100)進行測序，從而導致鑑定了41個獨特的改善Fabs。大多數改善的結合劑來源於組III(03548)。在組I和II中進行的I和II類結合劑。總之，在成熟過程中鑑定了來源於7個親本Fabs中的5個的87個獨特Fabs。表3概括了成熟淘選結果。表3.選擇具有與MCP-1的改善結合的Fab的概括。tableseeoriginaldocumentpage78成熟Fabs中的胺基酸變化位於親本克隆03741和03548的H-CDR2或L-CDR3中。隨後進行Fabs最佳改善的重鏈CDR2與最佳輕鏈CDR3的交叉克隆，以設法產生具有甚至更高的親和力的Fabs。產生了大約36個交叉克隆。同樣篩選所有獨特Fab序列的預測N連接的糖基化位點。鑑定了對於重鏈CDR2中的糖基化具有NIS共有序列的少數Fabs。這些Fabs一皮從進一步表徵排除。總共84個Fabs在Morphosys^皮表達和純化，且轉移至Centocor用於生物學表徵。利用最優化Fabs達到了關於使用Biacore的親和力測量的靈敏性極限。因此親和力值通過基於ECL的溶液平衡滴定(SET)(Haenel等人，2004,被提交用於在J""(y"^/S,oc/^鹿:份少中出版)進行測定。親和力成熟後，達到約10pM的Ko且使用KinexA證實所述值。在放射性配體測定中的Fab結合達到110pM的IC50。因此，與親本Fabs比較MCP-1親和力和結合動力學改善最高達1000倍。4個最優化Fabs滿足所有9個成功標準。2個是L-CDR3最優化的Fabs,且2個是由L-CDR3和H-CDR2最優化鏈組成的交叉克隆。所有4個都被轉化成IgGl,且在所有測試測定中保留活性，其在放射性配體結合測定中最佳KD為10pM和最佳IC5Q為20pM。1個另外的交叉克隆MOR03899作為IgGl滿足所有成功標準，但作為Fab則不是。滿足成功標準的所有結合劑都來源於MOR03471親本Fab(SEQIDNos.2,4)。獨特的Fab-MOR03790選才奪用於IgG生產，按比例擴大的製備開發，和基於MOR03471在動物^t型中的體內評估，且包含表4D中給出的重和輕鏈可變區序列以及SEQIDNos.6、7、9、13、14和16。在親和力成熟期間的BioVeris篩選。親和力改善的Fab克隆通過基於ECL的高通量親和力篩選BioVeris測定進行鑑定。命中後，選擇4個亞克隆通過相同方法進行鞏固。關於親和力成熟的淘選策略。總共進行了36次不同的淘選。18次溶液淘選針對具有噬菌體-抗原複合物捕獲至鏈黴抗生物素蛋白珠的生物素-K69MCP-l(V41I)。選擇過程中的嚴格性通過減少抗原濃度、選一奪解離率和延長的洗滌來增加。此外，進行針對生物素-K69MCP-1的18次半溶液淘選，使噬菌體-抗原複合物捕獲至Neutravidin板。在這些淘選中，嚴格性通過減少抗原和延長洗滌來增加。關於親和力成熟的BioVeris篩選。抗原生物素-K69MCP-1411在成熟淘選中且同樣對於基於BioVeris的篩選使用。篩選對鑑定改善的結合劑非常有效地發揮作用。對於36種淘選條件中的每一種，篩選92個克隆，從而導致產生3312個篩選的克隆。總共鑑定了85個不同的獨特最優化結合劑。發現了來自3個組的最優化Fabs。此外，可以鑑定在L-CDR3和H-CDR2中最優化的Fabs,從而使得命名為MOR03471和MOR03548的Fabs衍生物能夠交叉克隆。46個最優化的Fabs來源於MOR03548,與11個L-CDR3最優化的Fabs比較，來自H-CRD2最優化的35個Fabs顯示了較高的親和力和活性。而且親本MOR03471在這種成熟中非常成功地最優化，具有在L-CDR3中最優化的23個Fabs和在H-CDR2中最優化的l個Fabs。改善的Fabs來源於7個親本Fabs中的4個，/人而表明每個親本結合劑都具有被最優化的不同潛力。滿足所有成功標準的最後4個Fabs來源於MOR03471,2個只在L-CDR3中最優化且來自交叉克隆的2個在L-CDR3和H-CDR2中最優化。最優化Fab分子的交叉克隆。HuCAI^技術的模塊結構允許簡單地通過在克隆步驟中組合2條最優化鏈快速交叉克隆來源於相同親本克隆的最優化Fabs的最優化輕和重鏈。交叉克隆是可能獲得進一步改善的抗體的快速方法，無需另外的成熟循環。一方面2個L-CDR3最優化的MOR03548衍生物與6個H-CDR2最優化的MOR03548進行交叉克隆，從而導致產生12個交叉克隆。另一方面22個L-CDR3最優化的MOR03471與1個可用的H-CDR2最優化的MOR03471克隆進行交叉克隆。在這個計劃中，交叉克隆是成功的，從而導致產生2個不同的MOR03471衍生的交叉克隆-MOR03850和MOR03878，它們最終符合所有成功標準。16個預先選4奪的抗體的詳細表徵從親和力篩選中鑑定的85個最優化Fabs和另外34個交叉克隆(參見上文)產生總共119個不同的獨特最優化Fabs,所述獨特最優化Fabs沒有全部通過所有可用測定進行表徵。因此，16個最優化Fabs根據其在放射性配體結合抑制中的IC50、在《丐釋放測定中的活性、在CDRs中缺乏N糖基化位點(表4A和B)和親和力進行預先選擇。進一步的詳細表徵包括特異性測試、與天然MCP-1的結合和中和、對人和短尾猴MCP-1的親和力、在趨化性測定中的活性以及所有轉化的IgGl的表徵。代表最優化Fabs的克隆由表4A-C中給出的序列表示，其中克隆MOR03471親本Fab具有VH3xk3構架且MOR03548具有VH1Ax人3構架。具有所需物理化學屬性(在CDRs中沒有N糖基化位點)以及親和力和生物活性的最優化特性的17個所選Fabs,顯示在使用的構架(VH3和VH1A)內在HC-CDR2和LCCDR3序列中的某些交替的獨特CDR序列和代表性共有序列，以及更一般地在所有HC-CDR1中的共有序列。這些共有序列顯示於表4C-4E以及SEQINNos:2-26中。表4A:17個所選結合劑的重鏈CDR序列tableseeoriginaldocumentpage814C.關於抗MCP-1V區的共有序列sEqia臉且CPR1EE2CDR^膽CDR3￡&42VH1ASGAEVKKP。SSVKVSCKASGISQGX)BWMGXIXPXXGRVTITADESTRSEDTAVYYCARWGQGTLVTVSS3W3CVQLVELVQPGGSLRLSCAASGFTFRSY鵬WVRQAPQWVSNIRSD3SRFTIS咖SKNTIiYLOMWSLRAEDTJWTYCAR4K3DIVLTGSPATliSCRASQSVSWYQQKPGlitilYDASSRAGVPARFS(沾GSGTDFTIOTSYCFTFGOGTKVEIK工5入3DIELTQPPSVSVAPGQT磁SCWYQQKPG0APVSGNTATIiTISYCFGGGTKI/TVL82tableseeoriginaldocumentpage83tableseeoriginaldocumentpage84通過Biacore測量的與天然MCP-1的結合。與天然MCP-1的結合在BmcoreFab捕獲模式中進行測試，且所有選擇的Fabs都顯示與天然MCP-1結合。尤其是因為對於最優化Fabs達到了在Biacore中關於KD測定的檢測極限，所以必須使用用於親和力測定和特異性證實的可替代方法。IgG轉化。選擇用於詳細表徵的所有最優化Fabs都^C轉化成IgGl形式，另外將4個Fabs亞克隆成IgG4形式。測試的人IgG4的表達數據和在不同測定中的活性與各自的IgGl—樣良好。使用BioVeris的溶液平衡滴定。作為用於靈敏KD測定的可替代方法，進行使用BioVeris技術的溶液平衡滴定(SET)。單價解離常數通過關於Fab和IgG的合適擬合模型進行計算。這種方法適合於親和力測量和交叉反應性研究。所有選擇的16個結合劑都通過使用BioVeris的溶液平tf滴定(SET)進行分析(表5和表6),且這些親和力值被視為最終親和力值。幾個結合劑包括作為Fab和IgG的MOR03757、MOR03781、MOR03790、MOR03850、MOR03878以及作為IgG的MOR03899，滿足4十對人MCP-1<0.5nM和4十對短尾猴MCP-1<20nM的親和力成功標準。對人MCP-1的最佳親和力是在Fab水平上20-40pM，和在IgG水平上10-20pM(表5)。對短尾猴MCP-1的最佳親和力是在Fab水平上10-40pM,和在IgG水平上20pM(表6)。使用BioVeris的特異性測試。除親和力之外，還在使用BioVeris的溶液平衡滴定(SET)中分析特異性，尤其是與嗜酸性粒細胞趨化因子和MCP-2的交叉反應性。對於所選的16個Fabs和15個測試的IgGs(16個所選IgGs中有1個是不可用的)中的任何一個沒有檢測到與人MCP-2的交叉反應性。因為人MCP-1、人MCP-2主要與CCR2受體結合，而人嗜酸性粒細胞趨化因子佔優勢地與CCR3受體結合。對於MOR03744,MOR03747、MOR03790和MOR03781Fab和IgG在BioVeris中沒有檢測到與人嗜酸性粒細胞趨化因子的交叉反應性，而12個所選結合劑包括MOR03850以Fab或IgG形式顯示與嗜酸性粒細胞趨化因子的某些交叉反應性(數據未顯示)。最優化抗體在Biacore抗體結合模式(CNTO)中的特異性。對於所選IgGs進行特異性評估。在Biacore中，向捕獲的最優化抗體中加入100nM人MCP-l、人MCP-2、3、4以及人嗜酸性粒細胞趨化因子1、2和3。MOR03790、MOR03791、MOR03747、MOR03850、MOR03744、MOR03849、MOR03878、MOR03885、MOR3899和MOR03781IgG沒有顯示與同源物趨化因子的明顯結合信號，且滿足特異性成功標準(表6)。Fabs與MCP-2的結合不抑制125iMCP-2與Thp-l細胞的結合(CNTO)。為了分析在Biacore中檢測到的Fab與MCP-2和嗜酸性粒細胞趨化因子的結合活性是否轉變成中和活性，在Centocor開發了放射性配體全細胞結合測定。I125MCP-2顯示與Thp-l細胞的良好結合，且結合被未標記的MCP-2的添加抑制，而不被MCP-1特異性的參考抗體C775的添加抑制。結果提供了用於測試結合/中和特異性的重要功能測定。在受體結合測定中使用1ng/mlMCP-l,而在這種測定法中需要約100ng/mlMCP-2，因為MCP-2的標記可能已引起活性的喪失。MOR03754顯示沒有顯著抑制1251標記的MCP-2與Thp-l細胞上的CCR2受體的結合(IC5o^2^iM)。成熟的Fabs有效抑制I125MCP-1與Thp-l細胞的結合(CNTO)。由於需要低量的1ng/mlMCP-1，所以這種測定是這個計劃中最靈敏的測定，測定的IC5Q極限對於Fab為約100pM,且對於IgG甚至為20pM(表5)。最優化後，Fabs必須以低於參考FabC775的IC5。抑制人MCP-1與其在Thp-l細胞上的人受體CCR2的結合。親本MOR03471Fab顯示180nM的IC5o,且最優化的MOR03471Fab衍生物(MOR03781為180pM、MOR03790為260pM、MOR03850為160pM、MOR03878為110pM和MOR03899為130pM)顯示在最優化期間最高達1000倍的活性總體改善。儘管這種測定是這個計劃中可用的最靈敏的測定，但即使在這種測定中最優化的結合劑似乎也已達到測定的極限。成熟的IgGs有效抑制I125MCP-1與Thp-l細胞的結合(CNTO)。通過添加無關的人IgGl封閉Fc受體結合位點對於放射性配體結合和鉤動員測定是重要的。所有測試的IgGl在放射性配體結合測定中保留活性。最優化MOR03781的ICso值是20pM,對於MOR03790是30pM，對於MOR03850是50pM,對於MOR03878是30pM,且對於MOR03899是50pM。MCP-1誘導的CCR2受體內在化的抑制FACS測定開發。受體內在化測定使用表達CCR-2的細胞進行，所述表達CCR-2的細胞顯示比THP-1細胞更高的CCR2的表達，從而導致產生更佳的信噪比。首86先，合成的人MCP-1在該測定中進行滴定以確定EC5o值。發現對於MCP-1的EC5。值是116ng/ml。因此，對於進一步的FACS測定，選擇100ng/ml(~11nM)MCP-1。此外，獲得完全內在化的最佳溫育時間於37。C進行評估。大多數內在化在最初30分鐘內發生。因此在所有後續測定中使用l小時的溫育時間。該測定被成功開發以允許測定IC50。測量用於抑制MCP-1誘導的受體內在化的0.001-200pg/ml的Fab或IgG的活性和分等。所選的最優化結合劑顯示良好抑制MCP-1誘導的受體內在化(數據未顯示)。2批不同的Fabs進行平行測試，顯示了可再現性。對於使用Fabs的內在化測定，對於MOR03790檢測到5nM的IC50,對於MOR03850是4nM,對於MOR03781是7nM,對於MOR03878是5.3nM，且對於MOR03899是3.3nM(表6)。MOR03781IgGl也顯示7nM,從而表明活性在IgG轉化後^皮保留。鈣動員的抑制(CNTO)。MCP-1在THP-1細胞中誘導鈣動員，這可以藉助於螢光團(flur叩hore)進行檢測。最優化的抗體顯示有效抑制鈣動員，4個最終候選物MOR03781、MOR03790、MOR03850和MOR03878Fab顯示18-28nM的1。5值。各自的IgGs再次保留活性，且由於每個IgG中和2個MCP-1分子的能力，顯示甚至略微更佳的約6-10nM的IC5o值。再次在約10nM時似乎達到測定的極限。天然MCP-1誘導的鈣動員的抑制。天然MCP-1從PANC1上清液中進行純化且用於誘導釣釋放。與參考抗體C775比較，最優化Fabs顯示以更高的活性抑制天然MCP-1-秀導的鈣動員。再次在約10-20nM天然MCP-1時似乎達到測定的極限。趨化性的抑制。由於潛在的非特異性作用，親本Fabs無法在趨化性測定中進行測試，但成熟後所有測試的最優化Fabs都特異性抑制趨化性，這可能是由於活性增加。測試的所有最優化IgGs在趨化性測定中都是有活性的。因為測定是半定量的，所以無法測定正確的IC5。值。與參考抗體C775的結合竟爭。所有MOR03548衍生的預先選擇的Fabs在竟爭固相形式中完全抑制C775與MCP1的結合。所有7個MOR03471衍生的預先選擇的Fabs在這個測定中顯示部分(~60%)竟爭。總結數據表6:滿足成功標準的Abs的概況MOR37卯kMOR3850kMOR3781kMOR3878kMOR3899k成功標準FabIgGFabIgGFabIgGFabIgGFabIgGFabIgG#1,6MCP-lKd<0.5nMIGEN65,-0.12,0.070.04,0.010.03，0.020.320.27(0.81)0.34#2MCP-l特異性BIAcore(IgG)無，無(MCP-2/Eo),無(MCP-2/Eo),無(MCP-2/Eo)，無(MCP-2/Eo),無(MCP-2/Eo),無#3125IMCP-l抑制IC50<C77535.6，25.60.26,0.030.16,0.050.18,0.020.11,0.030.13,0.05#4趨化性的抑制是，是是，ND是，ND是，ND是，ND是，ND#5Ca2+動員的抑制IC50<C77571.5,62.325.02,4.2628.42,9.4721.8'10.920.24,6.717.54，5.85#7短尾猴MCP-lKd<10nMND，ND0.06,0.060.04,0.010.01，0.020.32,0.230.49,0.36#8天然MCP-l誘導的Ca2+的抑制是，ND是，ND是，ND是，ND是，ND是，ND延伸的測量-lC775竟爭是，是部分，ND部分，ND部分，ND部分，ND部分，ND延伸的測量-2CCR2內在化的抑制65，ND5,ND4,ND7,75.3，ND3.3，ND88實施例4:治療候選物的選擇最終治療候選物CNTQ888的選擇和產生。僅在其輕鏈CDR3序列方面不同的2個mAbs-3781和3790(表4B和D,SEQIDNos:15和16)在測定中顯示出幾乎等同的生物學活性。進行計算機(/"w7/co)免疫原性分析。以鑑定潛在的HLAII類結合肽且確定候選物在HLA結合表位方面是否顯著不同。分析預測mAb3790呈現比mAb3781更低的免疫原性可能性。基於這點以及表6中顯示的其他生物化學和生物學分析，包含重鏈VH1A構架區(SEQIDNO.2)和重鏈CDR區SEQIDNO.6、7和9;以及輕鏈k3構架(SEQIDNO:4)和CDR區SEQIDNO:13、14和16的3790被選擇作為最終的治療mAb。由於在克隆過程中引入的胺基酸變化，mAb3790的N末端序列包含來自人種系序列的變異。此外，胺基酸密碼子(即DNA序列)偏向在原核細菌細胞中的最大表達。重新合成MAbDNA以校正與種系序列的有缺點的N末端比對，且使密碼子偏倚改變成在高度表達的人蛋白質中有利的那些。序列修飾的3790mAb命名為CNTO888,其分別包含SEQIDNO:27和28以及下文(有下劃線的是CDRs)的重和輕鏈可變區序列，其中重鏈的N末端殘基是QVQ(Gln-Val-Gln)和或輕鏈的是EIV(Glu-Ile-Val)。CNT0888重鏈可變序列(SEQIDNO:27)ANYAOKFOGRVnTADBSTSTAYMBLSSLRSEDTAVYYCARYDGIYGBLDFWGOGTLVTVSSCNT0888輕鏈可變(SEQIDNO:28)P皿TfjSPATLSLSPGERATLSCRASOSVSDAYlAWYOOKPGOAPRLLIYDASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQXIQUiSFTFGQGTKVEIKCNT0888的生物化學和生物物理學表徵。CNTO888是全長人IgGlk抗體。在該序列中沒有預測的N連接的糖基化位點。CNTO888(在HEK293細胞中瞬時表達且通過A蛋白親和層析進行純化)的生物化學和生物物理學特性在SDS-PAGE、大小排阻層析(SEC)、質譜(MS)和BIAcore中對於結合親和力(Kd)和特異性進行表徵。在SDS-PAGE中，天然CNTO888作為大約150kDa處的單一條帶遷移。還原的/alkalyatedIgG作為大約60kDa和33kDa處的2個條帶遷移。CNTO888的大小排阻層析證明IgG以與對於RemicadeIgG對照測量的那種相同的洗脫體積(數據未顯示)作為單個峰洗脫。最後，MS分析證明CNT0888具有147,000Da的質量(數據未顯示)。BIAcore分析證明CNTO888與人和短尾猴CCL-2的結合親和力(Kd)分別是30和0pM。CNT0888在BIAcore中沒有顯示與CCL-2相關趨化因子，即MCP-2、3、4以及嗜酸性粒細胞趨化因子1、2和3的可才t測結合。CNTO888的體外表徵。CNTO888的生物學活性在多種基於細胞的測定中進行評估。在所有成功標準測定中評估的瞬時表達的CNTO888具有與親本mAb3790不能區別的活性(表5)。實施例5:抗MCP-1抗體的克隆和表達具有CNTO888質粒p2844和p2882的等分試樣的大腸桿菌分別包含抗體的重和輕4連。質粒p2844包含在抗CD4重鏈啟動子下的CNT0888編碼區的最優化重鏈編碼序列，且質粒p2882包含在抗CD4輕鏈啟動子下的CNTO888編碼區的最優化輕鏈。2個構建體都包括gpt選擇基因以給予針對MHX(黴酚酸、次黃。票呤和黃噪呤)的化學抗性。對每個質粒進行純化、表徵、定量和測序。來自C463A宿主細胞系的指數培養的細胞與線性化的p2844和p2882共電穿孔，所述C463A宿主細胞系是適合在化學成分確知培養基中生長的Sp2/0衍生物(CD-雜交瘤)。48小時後，將細胞暴露於1xMHX(0.5mg/L黴酚酸、2.5mg/L次黃嘌呤和50mg/L黃噤呤)。選擇後3天，細胞生存力已減少到小於13%，在這時將-90,000個有生活力的細胞在曱基纖維素中進行鋪平板。細胞不受千擾地培養8到13天，隨後使用Halo操作進行篩選且挑取到24孔板內。擴大培養且獲得24孔過度生長滴度。最高的親本細胞系(1C4)具有70mg/L的24孔過度生長滴度，和在搖瓶中108.5mg/L的滴度(在CD-雜交瘤培養基中)。選擇這個親本細胞系C1262A用於在搖瓶中的進一步評估。將C1262A提交給細胞庫組(CellBankingGroup)用於產生開發細胞庫(DevelopmentCellBank)(DCB)。來自DCB、命名為C1262A:DCB;02SEP04的細胞對於支原體和無菌性測試陰性。為了支持進一步的調查研究，從搖瓶(添加大豆蛋白腖)中的C1262A細胞生產CNTO888達到230mg/L的滴度且由2L培養物產生366mg純化CNTO888。平行地，C1262A細胞的另外9L培養物產生~2g粗CNTO888材料用於早期純化和製劑開發。親本細胞系C1262A使用Halo操作進行亞克隆且產生5個高生產的亞克隆細胞系。最佳亞克隆細胞系(4D5)具有150.5mg/L的24孔過度生長滴度，和在搖瓶中167mg/L的滴度(在CD-雜交瘤中)。這個亞克隆細胞系編碼為C1262B。實施例6:用CNT0888治療人胰肝瘤這個研究調查腫瘤MCP-1(由人腫瘤衍生的細胞產生)的封閉是否抑制鼠異種移植物中的腫瘤生長。為了測量腫瘤以及宿主MCP-1同源物JE在惡性疾病的生長和進展中的作用，測試抗人MCP-1和抗小鼠JE抗體在體內抑制人胰肺瘤生長的能力。荷有BxPC-3胰腫瘤的小鼠用命名為CNT0888的人抗人MCP-1抗體進行治療，所述抗體包含與人IgGl恆定區融合的可變區序列(SEQIDNos:27和28)。為了比較CNT0888與其中發現最有效抑制宿主作用的先前測試的鼠抗體的體內活性，CNT0888和鼠抗人MCP-1(C775)與抗muJE(Cl142)組合施用。基於最終的胂瘤重量測量，人(CNT0888)和鼠(C775)抗人MCP-1Mabs都顯著抑制腫瘤生長。才才4牛和方法BxPC-3是人胰腺癌衍生的細胞。由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)胂瘤製備的MatrigelTM從BectonDickinson獲得(0.2EU/mg,Bedford,MA)。C775是小鼠抗人MCP-1Mab,且Cl142是大鼠/鼠嵌合抗小鼠JE抗體，其具有在申請人共同未決的專利申請美國系列號11/170453和相關文件中描述的大鼠可變和小鼠恆定區。對照抗體cVaM是由大鼠可變和小鼠恆定區組成的大鼠/鼠嵌合IgG^k,它充當C1142和C775的同種型對照。臨床級別的人IgG從BeckettApothecaryandHomeHealthCare，Inc,SharonHill,PA獲得，且充當CNT0888的對照。在本研究中使用從CharlesRiver(Raleigh,NC)獲得的雌性SCID小鼠(6-8周大)。小鼠在過濾器居於頂部的塑料籠中分組祠養且供應91高壓滅菌的食物和水。BxPC-3細胞在包含10%FBS的RPMI1640培養基(完全培養基)中進行培養。細胞在研究開始前48小時1:3分開。在研究當天，細胞用胰蛋白酶處理以產生單細胞懸浮液，且細胞懸浮液用IO體積的完全培養基洗滌以中和胰蛋白酶。將細胞離心且重懸浮於無血清RPMI中。MatngelTMf4。C過夜解凍。Matrigel-腫瘤細胞懸浮液通過將等體積的MatrigelTM溶液和BxPC-3細胞混合進4亍製備。癌細胞懸浮液的最終濃度是在5mg/mlMatrigel中5xl06細胞/ml。在第0天，80隻雌性SCID小鼠皮下(s.c.)植入0.2mlBxPC-3細胞懸浮液。0.2ml細胞懸浮液包含lx106BxPC-3細胞和1.0mgMatrigelTM。使用冷注射器以避免MatrigelTM聚合。表7.抗腫瘤研究設計。tableseeoriginaldocumentpage92所有動物在研究開始時和在研究過程中每周一次進行稱重。一旦觀察到腫瘤生長(3.0mm3),就用卡尺在2個維度(長度和寬度)測量腫瘤，單位為毫米(mm)。監控小鼠的腫瘤生長，且基於式[長度x寬度x寬度]/2計算腫瘤體積(mm3)。在胂瘤細胞植入後第14天，具有約50mn^的平均腫瘤體積的小鼠隨機分成5組(11=10/組)。治療(表7)在第14天開始，且對於剩餘部分的研究(第14天治療開始後52天)每周施用2次治療。對於剩餘部分的研究每周測量一次腫瘤。在研究結束時，小鼠通過C02窒息實施安死術。腫瘤被解剖、在數字天平上稱重、且固定。腫瘤使用數位相機進行拍照。在第50天，組3中的1隻小鼠具有超過在研究指導下可接受極限的腫瘤，且被處死。這個動物的體積和重量被包括在最終分析中。對於腫瘤重量，數據經由標準線性模型和方差分析(ANOVA)進行分析。除非另有說明，對於所有檢驗和比較小於0.05的P值視為顯著的。使用對數尺度，因為更好地滿足相等方差和正態分布型的根本假設。對於沒有腫瘤的小鼠的6個零值由樣條插入值(0.007240538)替換，所;對於腫瘤體積,'重複6^測量模型對假定一階自相關協方差結構的數據進行擬合。使用天然樣條以靈活模擬時間曲線中的趨勢曲率。在每個時間點上進行組內的成對比較。通過R軟體環境進行計算。結果PBS和cVam/huIgG陰性對照組顯示出相似的腫瘤生長，在51天後達到~350mm3。這表明用無關抗體的抗體治療不抑制肺瘤生長。3個測試組(C775/C1142和CNT0888/C1142)中的腫瘤生長比陰性對照組中更慢，從而表明抗CCL2/抗JE治療對腫瘤生長有影響。如從第18天到研究結束時通過腫瘤體積測量的，與PBS對照組比較，C775/C1142和CNT0888/C1142(2mg/kg)組顯示出明顯的肺瘤抑制。與PBS對照組比較，CNT0888/C1142(20mg/kg)組顯示出從第18天到笫39天的顯著抑制。在第51天研究結束時獲得腫瘤重量(表8)。在PBS組1(1隻小鼠)、C775/C1142組3(3隻小鼠)和CNT0888/C1142組4(2隻小鼠)中存在無腫瘤小鼠。當比較腫瘤重量時，與PBS對照組比較，CNT0888測試組各自顯示肺瘤重量中的顯著減少(表8)。以2mg/kg給藥的CNT0888/C1142組中的抑制百分比是80%(P=0.006),而對於以20mg/kg給藥的CNT0888/C1142組抑制是68。/o(P二0.046)。C775/C1142組也顯示腫瘤生長的顯著抑制(P=0.004)。腫瘤體積對腫瘤重量結果的統計學解釋中可見的差異最可能是由於與從動物中切除的腫瘤稱重的精密度比較，用卡尺測量腫瘤體積中的不精確。表8.最終的腫瘤重量tableseeoriginaldocumentpage94總之，這些結果表明在確立的BxPC-3模型中，MCP-1和小鼠JE的封閉明顯抑制腫瘤生長，且CNT0888具有抗肺瘤活性。顯而易見的是本發明可以以與前述說明書和實施例中先前所述不同的其他方式進行實踐。本發明的眾多修改和變化依據上述教導是可能的，且因此在附加權利要求的範圍內。參考文獻f胸T5ii^':ffotQ'她lii—淑6-暴'胸^￥^'.沐識加]^'喊阪^5g^(2曙.彌,ote:f顯,;5535^"j^謬^li^^i5^iiro3^T溫溪i^g:S5^,:編5F函W流W狙彌imageseeoriginaldocumentpage95^^^5^^^;M"iain^;，n汰fi^SShg，^i^5jr5i^AiBhaktkS^3竭^3^fere3idti"^S5"p[ioriocyfeclSmotac'tic^5tjfei"l廟ataffectsignalingthrpiikhthe]Tcc印^r:CCR2^ni^-SaiozFastB，J^ayofFJr，Ar在i^AJ^T(20i[)ltTr§ii^alingpathw"for咖no6^:cfi5tnqatfrkc^1^proteinl一加6idiat^5^xir^cenm151signah:efflifatedkinas6actjyation.MolPharinaco〗jlKnappik,A*，Ge,L.,Hon戰ger,A,，Pack，P,，Fiseher，M,,^ellnfaofer，(3.'Hoess,A.，JjHuckthun,^，andVirnekas，B.(2000)，Fullysynthetichumancombinatorialantibodylityari"jjgt^C^L):edonModularyoqso加tisft^tnworksandgDRs卿JQm^5，ithtrjggcl一ide尹.j^oj蹈oJ296,57，86J^,.,M.:,'HoUi^ri.'j>,:,:''W1uiteiyG，.(l々9|6)vMifaaicldp:g—6mfttfc''hy^^pBjitetiop::,^￡fiiA^qt^uration'blf1Bg西:S5S5gSiE範^7備;脂l^r!g5^TS5^mi^涵gSli(M^iSi|^5^'!1碌喊11^^"^沐邁5^咖$|6^78'$就:端15戰￡23^莉jg^liigiiSrgv:MJM51^;雄爐，蔬《raoi^n:W織維S，'歸^]gMil^^^'A'蹄^巡,^!BHg^^lS巡Sg！jiuitibodies6伍oi^tlyinduce'飢ograiiiiii^i<fea^ofmaiimUntlympfiQJdcdls.NatMed,8(8)i861，7jfo;^aid:N,rfoof),tiTBRT-proitnd&rJbas^rtiimor-sipe^i^expj1—sS^noJEJ^^^-Ie設ecitiveiygeqsi&^jccjj"vic^[cancerccil3t0alowdpseofoispl雄tin，CancerGeneThe^11(l上4r刃jmammaiyt咖ora:M^!P-l-TNPalphao卿"柳labry:(pathway助dclo礎柳ressionofpromali幼an^j^adantimalig^^yiactors,IntJCan—,106(6):^9-86J兩^"gj^notoS,Ishib^shiM，UsuT&，InoueS，Hiasa^fe^^，l^hidaK'T^ShlgA'Ega^JJi^(2004),Monocytechemoattractantprotein-1isanessentialinflammatorymediatorinangiotensinILJgnducedfrogjgggjgqj[fgs扭blishgdatherosclerQsisinhyi)ercholestei:olen)icmice'Ai1ejlQsg[gtT^IQ^y!VascBJol.24(3):534-9—〗j^i^i^l^"^iiji^—￡^"g，NishiokaY,Y肌oS,MukaidaN，MatsushimaK，gopeS,(2000)*Natural^HIercell-dependedsuppressioiTofsysteiiilcspreadofhumanhmgadenocarcinomacellsbymonocyte)^KemoattractantgenetransfectioiainseverecombipedimmunodefidentmFce,5ancerRes〗Mon。cytech柳oat加ctaiUprotein-1Sxpr"ssioncorrelateswithcmcrophageiDfiliratkmand嫌3I^SSn^Sinhuman卿ftipcarcinbm^.IntJQl^5i,—22(4)加，gjHehler,'J,,M^^'A,，:Giefsch,《;jHpS,B'，.G叫grJJ5T5.(1997)'Asse闢m油t.of礎qitycQnst^te.by!j^id鄰iid、pji扭《dete"t^)nof^J5IS^m5^dii^扭.a對ow.s;y鄉m.J:;Inmyi^l,-^fii::.20i[rf的-^)6〕一———抽g—Si"tu^6(pi^^辨Qn!f^H)^f^激34^！Geicm^Sie^role'otche聊kinesineejlfunctioiyJPiiafeiacolExplfer.283(l):4T'i>8〕jS扭lipyP,LosiS5iFf!3》,畫(2003),Moniop^tecii;md^;tract幼ttM:ol^in1inpb^i1y幼di站uUttresist加cj]l^cl^^r^^SciUSA.1(J5HI")—:7265隱70jjSchier，R，，Bye，J.,Apell，H^^11,Cj鵬，G,Pja^;ist,M.,Weiner,L.M7W^er〗Maito,J，D.(1996a),Iaolarionofhigh-affinitymonomerichumananti-c-erf>B-2singlech—Fvtisin^J^"inity-jrW^Vsekctioj^J.Mol,Biol.25S,28-431jSchier，R"A^CaH,A，Ad咖s，G,P"Marshal,K，W,，Merritt，H"Yim,M，Crawford,R>g.t，el^ET.M,,Marks,C,,Marks,Ef,.(19—96b).Isolationofpicomolaraffinityanti々erbB-2single-chainPvb><^TokcularevolutionofthecomplementarUydeterminingregionsinthecenteroftheantibodybinding^chmidtT,G.M.，Koepke，J,tFrank,R.andSkerryA.(199ft,MoleculariQtgracrionbet^^JTffi3gtr印-t^gaM5typ印tideanditsco幼atetargetstr印tavidin,i^lol.嶽olJZ5虧,預-^jSlftr5^啦Jl^i:M卿吸絲』&傻—6二地:J^fl汲，^rf^SP^i^斑1^瓦^gr(^5疏陽^^ip^T^^);"^H^長scheaiia^einfaisiQqiijitryisbiedj^^5^yo;^lAttvestiffs^ndNfirkap'ftqtS:^i3ineyiHT》2(4)!lT60-70〕3za^:Kp蛐GT'W敏A,Bpis汰oA，KrikoV^D,Szab6.T,'Falus:Av(2001).Tolymorthhni'W隨:級磁,iii彌gertte^M^:^jtei:i^^姊bt^pi'Qfenril私:^)'站eSi"^^pft^^S^fe;i遞ctiyu"t^lfeaS.ci^i"^^p^^io."F^莉lyr^fl^a鄉i^Vt^lii"5Si^5S溢磁^fe;iiibie^^^1Ski賦ASri^ffi5P國,sIhieSttei-togIIpeptide:and.inff^57ediaifbirmaivctein.recombinant:'proteiii.pprificatitm.'Protein.Eng.!5]P75-頓JY咖ada化KimS,feas^KTakeyaM,DcedaT;'Mim卿O,IyaoH".(20.53),j^le!culyqiegtianis^ij抑dof加"ilothelieilmQao6y^cl^irioaiirdaritbroteiq，lfaidMctipnbyvascujairendo"lial柳^i^tSE7^r5i^r^T^"iii^^eney,S,,BrioiK^人7TTBurton，D.R.,Barb貼邁，5T^7]^^gj^Iwalkingmuta抑n切isfortheaffinitymaturationofapotenthumananti-HIV-1antibodyj幽，—@^icomolarr^i，ge.J二M9j，.Bio，.g44,g—g2-403|j^DShimumT,LeonardEJ,(1999).IdentificationofhighaffinityTe卿t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