一種檢測蝴蝶蘭突變體的方法與流程

2023-05-19 20:28:06

本發明涉及植物品種監測技術領域，具體地，涉及一種檢測蝴蝶蘭突變體的方法。

背景技術：

蝴蝶蘭是原產於亞洲熱帶地區的一類蘭科植物，花形奇特，花色豐富，具有極高的觀賞價值和經濟價值。蝴蝶蘭的規模化生產目前主要通過組織培養的途徑繁殖種苗，這使得其生產成本較高，生長周期較長，從組培出瓶苗到開花售賣大概需要18個月。然後，由於組培過程中的諸多誘變因素，蝴蝶蘭在組培過程中會產生一定量的突變體，突變體並不符合商品生產的要求，又會加大生產成本，對大規模商品化生產非常不利。所以高效的蝴蝶蘭突變體檢測技術非常必要。

目前用於蝴蝶蘭突變體的檢測方法有RAPD檢測，如2013年肖文芳等公開幾種常見蝴蝶蘭組培突變體的RAPD檢測方法，利用7條隨機引物能夠將『紅彤』蝴蝶蘭及其花缺刻型突變體區分開，利用6條引物能夠將『滿天紅』蝴蝶蘭及其花色嵌合型突變體區分開，但是未能從50條隨機引物中找到相關引物將『紅彤』蝴蝶蘭與其花瓣唇瓣化突變體。雖然RAPD檢測方法同樣適用於突變體檢測，但是，該檢測方法具有不可克服的缺陷：（1）實驗重複性和穩定性極差；（2）凝膠電泳只能分開長度差異較大的DNA片段，而不能分開那些分子量相同或差異很小的樣品。

技術實現要素：

本發明的目的是為了克服現有技術的不足，提供一種檢測蝴蝶蘭突變體的方法，在瓶苗期就篩選掉不符合生產需求的突變體，節約大規模生產的生產成本。

為了實現上述目的，本發明是通過以下技術方案予以實現的。

由SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十對引物組成，SSR1引物序列如SEQ ID：1～2所示，SSR2引物序列如SEQ ID：3～4所示，SSR3引物序列如SEQ ID：5～6所示；SSR4引物序列如SEQ ID：7～8所示；SSR5引物序列如SEQ ID：9～10所示；SSR6引物序列如SEQ ID：11～12所示；SSR7引物序列如SEQ ID：13～14所示；SSR8引物序列如SEQ ID：15～16所示；SSR9引物序列如SEQ ID：17～18所示；SSR10引物序列如SEQ ID：19～20所示；所述蝴蝶蘭的品種為滿天紅、光芒四射、V31和紅珍珠。

本發明利用10對引物的組合就能夠完全將『滿天紅』、『光芒四射』、V31和『紅珍珠』4個品種及其突變體全部區分開。

本發明還要求保護如上所述的引物組合在SSR螢光標記毛細管電泳檢測蝴蝶蘭突變體中的應用。

一種檢測蝴蝶蘭突變體的方法，包括如下步驟：提取待測蝴蝶蘭的總DNA，以SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十對引物分別進行PCR，PCR產物分別進行SSR螢光標記毛細管電泳檢測，將待測蝴蝶蘭的檢測結果和正常蝴蝶蘭的結果進行對比，如果兩者的結果不相同，判定待測蝴蝶蘭為突變體。

優選地，所述PCR的反應體系為2.5×Buffer V 6.0 µL，上遊和下遊引物（5 µM）1.0 µL，Taq酶（5 U·µL-1）0.1 µL，DNA 1.0 µL，ddH2O補齊至15 µL。

優選地，所述PCR的反應程序為95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 sec，58 ℃ 35 sec 35個循環，72 ℃ 35 sec，60 ℃ 30 min。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

本發明利用SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十對引物的組合就能夠完全將『滿天紅』、『光芒四射』、V31和『紅珍珠』4個品種及其突變體全部區分開，SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十對引物的序列如SEQ：1～20所示。本發明的檢測方法可以在瓶苗期就篩選掉不符合生產需求的突變體，節約大規模生產的生產成本。

附圖說明

圖1為利用引物SSR8的檢測圖。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業途徑得到的試劑和材料。

『滿天紅』、『光芒四射』、V31和『紅珍珠』4個品種來源於市場購買。

實施例1

（1）總DNA的提取：分別取0.2 g『滿天紅』、『光芒四射』、V31和『紅珍珠』四種蝴蝶蘭根尖組織，按照本領域總DNA的常規提取方法或常規試劑盒提取『滿天紅』、『光芒四射』、V31和『紅珍珠』四種蝴蝶蘭的總DNA。

（2）PCR反應：以SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十對引物分別進行PCR。

PCR反應體系為2.5×Buffer V 6.0 µL，上遊和下遊引物（5 µM）1.0 µL，Taq酶（5 U·µL-1）0.1 µL，DNA 1.0 µL，ddH2O補齊至15 µL；

反應程序為95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 sec，58 ℃ 35 sec 35個循環，72 ℃ 35 sec，60 ℃ 30 min。

SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十對引物的序列見表1。

表1引物序列信息表

（3）3730XL測序儀檢測及分析：96孔板中每孔加入分子量內標和甲醯胺混合液(0.5:8.5) 9 μL，PCR產物1.0 μL，95 ℃變性3 min後，上機檢測。將檢測得到的原始數據文件導入到分析軟體中進行分析。

利用本發明提供的分子標記對4個不同品種的蝴蝶蘭（『滿天紅』、『光芒四射』、V31和『紅珍珠』）及其突變體（『滿天紅』、『光芒四射』和V31為花色突變體，『紅珍珠』為花期突變體）進行檢測，結果如表2所示。

表2 實驗用4個蝴蝶蘭品種及其突變體的檢測數據

由表2結果可知：10個SSR螢光標記對4個蝴蝶蘭品種及其突變體的檢測中只有SSR4沒有多態性，其餘引物均能在一定程度上將各個品種或者正常株與突變體之間區分開，利用其中3對引物SSR3+SSR8+SSR9的組合就能夠完全將4個品種及其突變體全部區分開。這10個SSR螢光標記引物是利用從市場搜集的400多個蝴蝶蘭品種及部分品種在組培過程中產生的突變體的DNA篩選出來普遍使用於蝴蝶蘭的SSR螢光標記引物，雖然未對更多類型的突變體進行檢測，但是從實例的4個突變體檢測效率來看，對蝴蝶蘭突變體的檢測較為適用，能夠區分一些生產上較為常見的蝴蝶蘭突變體。

（4）提取待測蝴蝶蘭的總DNA，以SSR1、SSR2、SSR3、SSR4、SSR5、SSR6、SSR7、SSR8、SSR9和SSR10 十對引物分別進行PCR，PCR產物分別進行SSR螢光標記毛細管電泳檢測，將待測蝴蝶蘭的檢測結果和正常蝴蝶蘭的結果進行對比，如果兩者的結果不相同，判定待測蝴蝶蘭為突變體。