抗牛成熟疊朊蛋白的單克隆抗體mab-bomDpl-9及其應用的製作方法

2023-07-25 05:55:41

專利名稱：抗牛成熟疊朊蛋白的單克隆抗體mab-bomDpl-9及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及採用基因工程製備一種單克隆抗體(以下簡稱為單抗)及其制 備方法和用途，確切講是用基因工程製備的抗牛成熟疊朊蛋白(mature Dpl,mDpl)的單抗mab-bomDpl-9，以及這種單抗的製備方法和用途。
背景技術：
疊朊蛋白(Dopple,Dpl)是細胞型朊蛋白PrpC的一種"橫向同源物"，與瘋牛 病等海綿狀腦病的發生有一定的關係，但是目前除了能夠確定它與雄性的生殖 功能有關以及過量表達具有神經毒性作用外，還不清楚其它的生理功能。抗體， 尤其單抗是研究蛋白質結構與功能的有效工具。所以，製備針對Dpl的單抗具有 重要意義。Dpl是由/Vm/基因編碼的約由179個左右胺基酸殘基組成的糖蛋白，也是一 種糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定的膜蛋白，其前體形式是由氨基端的信號肽(牛 Dpl信號肽為l-26位胺基酸殘基)、中間的mDpl(牛mDpl為從第27位至第155位氨 基酸殘基組成)和羧基端的GPI結合區(牛Dpl該區從第156位至第179位胺基酸殘 基組成)組成。編碼Dpl的開放閱讀框(ORF)位於一個單一的外顯子內，其編 碼的Dpl前體在蛋白質的翻譯後修飾過程中切除了氨基端信號肽和羧基端GPI結 合區的胺基酸殘基，添加上GPI錨，形成mDpl。 Dpl主要分布在睪丸組織中，由 於直接製備來源於牛睪丸組織的Dpl，不僅受材料限制，而且獲得的量很少，不 易純化。所以，以牛睪丸組織為實驗材料不利於免疫原製備。在抗牛Dpi的單抗製備方面，國外學者製備出了系列的針對本土牛Dpi的 單抗，應用於Dpl的免疫印跡(WesternBlotting)和免疫組化等方面。研究表明， 中國黃牛Dpi的編碼基因5oZVw/(在GenBank中的登錄號為DQ408532)的ORF 為537bp，與Genbank登錄的國外其它牛的ORF的最高同源性為99% (534/537)，例如DQ205538, NM174158和BTA 278011序列，分別在第149、 395和438位發生G—A,G—A和C—G的改變，相應地引起胺基酸發生了 R(精 氨酸)50H (組氨酸)，H (組氨酸)146Q (穀氨醯胺)的改變。發生改變的這 兩個胺基酸位於牛mDpl內，這表明中國黃牛mDpl的胺基酸序列不同於國外本 土牛的mDpl胺基酸序列。所以，採用基因重組技術製備大腸桿菌表達的牛 mDpl，代替從牛睪丸組織中提取的mDpl，以此為免疫原，獲取針對中國黃牛 mDpl的單抗，對研究中國黃牛mDpl的結構與功能具有重要意義。此單抗能夠 為研究工作提供有力實驗工具，有助於進一步闡明狂牛症的發病機制。發明內容本發明的目的之一是提供一種抗中國黃牛成熟疊朊蛋白mDpl的單抗 bomDpl-9，同時給出單抗bomDpl-9的輕鏈和重鏈可變區編碼基因；本發明的目的之二是提供單抗bomDpl-9的一種製備方法；本發明的目的之三是提供單抗 bomDpl-9的用途。本發明所涉及的抗中國黃牛成熟疊朊蛋白mDpl的單抗bomDpl-9被命名為 "mab-bomDpl-9"，其輕鏈可變區基因見後附的序列表1 ，其重鏈可變區基 因見後附的序列表2。Mab-bomDpl-9的製備方法如下以純化的大腸桿菌表達的重組型中國黃牛 mDpl為免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出雜交 瘤細胞株，並克隆出陽性雜交瘤細胞株，在鼠體內接種雜交瘤細胞生產腹水抗 體，收集腹水進行親和層析純化，得到抗牛mDpl的單抗。本發明的mab-bomDpl-9的製備方法中還可以是下述方法在製備以大腸杆 菌表達的重組型中國黃牛mDpl為免疫原的過程中，採用了含有中國黃牛mDpl 編碼基因的重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl和含有該重組表達質粒的大腸桿菌 BL21(DE3)的表達菌株pET30a(+)-bomDpl-BL21(DE3)，並以異丙基硫代半乳糖 苷(IPTG)誘導表達菌株，表達重組牛mDpl，收集包涵體後，採用親和層析法和 切膠後的電洗脫法純化重組蛋白，以純化後的重組牛mDpl為免疫原，免疫 Balb/C小鼠，取免疫鼠脾細胞與鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，採用間接ELISA方 法篩選融合的雜交瘤細胞株，再用有限稀釋法克隆篩選的陽性雜交瘤細胞株， 獲得了能夠穩定分泌抗重組牛mDpl的陽性雜交瘤細胞株---csbomDpl-9，在鼠 體內接種雜交瘤細胞csbomDpl-9，生產腹水抗體，抽取腹水，離心收集上清液， 以葡萄球菌蛋白A親和純化，得到抗牛mDpl的mab-bomDpl-9。由前述內容可知，在重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl的製備過程中，用從 中國黃牛外周血中提取的總DNA為模板，根據Genbank上登錄的牛成熟疊朊蛋 白編碼基因設計一對表達用引物，進行聚合酶鏈式反應(PCR)。然後將PCR擴 增得到的中國黃牛mDpl編碼基因與商品化的原核表達載體pET-30a(+)連接，並 將中國黃牛mDpl的編碼基因插在pET-30a(+)載體的多克隆位點M/el和屈ol之 間，構建出重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl。構建重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl採用的引物序列如下上遊引物bo匿mDpl(27隱155) F:鵬aattccatatg,ggcat纖gcac郷atc下遊引物bo-mDpl(27-155) R: ccgctctectcccctttccaaccaaa注下劃線表示A^fel(上遊引物)^01 (下遊引物)識別位點，下畫線前面的鹼基表示 添加的酶切保護鹼基。由前述內容可知，在表達菌株pET30a(+)-bomDpl-BL21(DE3)的製備過程中， 將前述的重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl轉入常規氯化鈣法製備的大腸桿菌 BL21(DE3)中，將轉化菌液塗布在含有卡那黴素抗性的LB固體培養基上，待長 出單菌落以後，挑取單菌落接種入含有卡那黴素抗性的LB液體培養基中，37度， 200轉/分鐘，過夜培養，收集菌液，即獲得表達菌株 : 30&(+)-1501110 1-BL21(DE3)。本發明的mab-bomDpl-9可以作為研究中國黃牛mDpl結構與功能的試劑。 本發明獲得的mab-bomDpl-9的輕鏈和重鏈可變區編碼基因為製備相應的單鏈抗體提供了材料。具有免疫活性的單鏈抗體同樣起到單抗的功能，而且來源 更加便捷。


圖l為中國黃牛Dpl編碼基因的ORF的PCR擴增產物瓊脂糖電泳圖譜，圖中l 為DL-2000 Marker, 2為PCR擴增出的目的DNA條帶。圖2為重組克隆質粒boDpl-T的雙酶切鑑定瓊脂糖電泳圖譜，圖中為DL-2000 Marker, 2為￡^111和///^1111雙酶切重組克隆質粒1)00^-丁， 3為連接反應發生前 純化的PCR產物，4為XDNA/所^m Marker。圖3為重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl的PCR鑑定瓊脂糖電泳圖譜，圖中為 DL-2000 Marker, 2為PCR擴增出的目的DNA條帶。圖4為重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl的雙酶切鑑定瓊脂糖電泳圖譜，圖中 1為A^I和屈oI雙酶切重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl，2為連接反應發生前純化 的PCR產物，3為DL-2000 Marker。圖5為中國黃牛成熟Dpl重組表達產物的SDS-PAGE圖譜，圖巾l為純化的重 組牛成熟Dpl， 2為IPTG誘導表達的重組牛成熟Dpl超聲波破碎後的沉澱，3為 IPTG誘導的含有pET-30a ( + )載體的大腸桿菌BL21(DE3)對照菌液，4為蛋白質 分子量標準。圖6為葡萄球菌蛋白A親和層析法純化的腹水mab-bomDpl-9的SDS-PAGE圖 譜，l為離心收集的腹水上清夜，2為蛋白質分子質量標準，3為純化的腹水單抗。圖7為mab-bomDpl-9與重組牛mDpl、重組牛mPrP以及含有pET-30a ( + )空 載體的五.Co// BL21(DE3)菌體蛋白反應的Western blotting圖譜，1為IPTG誘導的 含有pET-30a ( + )空載體的五.Q "BL21(DE3)菌體蛋白，2為重組牛mDpl， 3為重 組牛mPrP。圖8為mab-bomDpl-9與重組牛mDpl 、重組羊mDpl和重組人mDpl反應的 Western blotting圖譜，l為重組牛mDpl， 2為重組羊mDpl， 3為重組人mDpl。圖9為mab-bomDpl-9與從牛和羊睪丸組織中提取的疊朊蛋白反應的Western blotting圖譜，l為牛睪丸組織裂解液上清，2為綿羊睪丸組織裂解液上清。
具體實施方式
根據本發明的目的和內容，實施例分成三部分完成。實施例一抗中國黃 牛mDpl的單抗mab-bomDpl-9的製備及其特性鑑定；實施例二 mab-bomDpl-9的輕、重鏈可變區編碼基因克隆與序列分析；實施例三mab-bomDpl-9及其輕、 重鏈可變區編碼基因的用途。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為 常規方法。實施例 抗中國黃牛mDp啲單抗mab-bomDpl-9的製備及其特性鑑定 1.重組型中國黃牛mDpl免疫原的製備1.1中國黃牛Dpl編碼基因開放閱讀框(ORF)的擴增及其序列分析 l丄l外周血液總DNA的提取無菌採集健康中國黃牛外周血液，加入適量肝素抗凝，然後參照血液基因 組DNA提取試劑盒(大連寶生物工程有限公司)的說明書提取外周血液的總 DNA。l丄2引物設計和牛Dpl編碼基因ORF的PCR擴增參照GenBank登錄的牛Dpl編碼基因屍md的ORF序列，設計一對引物。本發 明採用引物的序列如下上遊引物BoDpl-1:5， -ttggttttgacttaaccctat-3 ，；下、遊引物BoDpl-2: 5，-acttgggagtgctatttaaag-3，。 ' 以1丄1中提取的總DNA為模板，在20pL反應體系中加入用ddH2O按l:5倍稀 釋的總DNAlpL， 10jLimol/L上、下遊引物各lial， 2.5mmol/L dNTPs 2&， EXTaq DNA聚合酶0.2ial， 10xPCR緩衝液2(iL，力口ddH2O至20)aL。 PCR反應禾呈序如下 95。C5min，然後94°C 1 min， 55°C 1 min， 72°C 1 min， 30個循環，72。C再延伸 10 min。 PCR結束後取樣進行電泳檢測，結果在約800bp的位置出現一條特異性 DNA條帶,與預期PCR產物大小相等。見圖l。 l丄3中國黃牛Dpl編碼基因ORF的克隆將l丄2中獲得的PCR產物經8g/L瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒(大 連寶生物工程有限公司)純化切取的目的DNA片斷。將回收產物連接到pMD 18-T載體(大連寶生物工程有限公司)，CaCl2法將連接產物轉化至五.co/糹JM109 感受態細胞(購自大連寶生物工程有限公司)，並塗布在藍白斑篩選培養基平板 上，挑取白色菌落，接種到含100嗎/mL氨苄青黴素的LB培養基中，37°C、 220 r/min振搖過夜，用質粒DNA小量純化試劑盒提取質粒，用五coRI和i/^din進行 雙酶切鑑定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示釋放出與預期大小相一致的DNA片段， 見圖2。LB培養基酵母膏5克，胰蛋白腖10克，氯化鈉5克，調pH值至7.0左右， 然後蒸汽高壓滅菌，121°C， 30分鐘。藍白斑篩選培養基待高壓滅菌後的LB固體培養基(在LB培養基中添加2。/。 的瓊脂粉)溫度降至5(TC以下時(手能持住即可)分別加入無菌的IPTG、 5-溴-4-氯-3』引哚-P-D-半乳糖苷(X—gal)和氨苄青黴素(Amp)，使其終濃度分別為lmM, 40嗎/mL禾卩50jag/mL。l丄4克隆質粒序列測定用五"RI和77/"dlII雙酶切驗證重組克隆質粒，命名為boDp1-T，插入片斷的大 小同目的DNA片段大小一致後，將該些重組子送到大連寶生物工程有限公司進行序列測定，用Blast軟體進行分析比較。分析結果表明，實驗獲得/牛Dpl編碼 基因iV"c/的ORF(在GenBank中的登錄號為DQ408532)，獲得的基因沒有內含子， 位於一個單一的外顯子內，與相關報導一致。 1.2中國黃牛mDpl的大腸桿菌表達及表達產物純化1.2.1 構建中國黃牛mDpl重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl1.2丄1 PCR擴增中國黃牛mDpl編碼基因實驗以商品化的pET-30a(+)載體作為表達載體。中國黃牛mDpl的胺基酸殘基 序列是從第27位胺基酸殘基至第155位胺基酸殘基，根據其編碼基因序列設計表 達引物，並在上遊引物bo-m:Dpl(27-155)F引入iV血頂每切位點，在下遊引物 bo-mDpl(27- 155)R引人狄oI酶切位點，添加相應的酶切保護鹼基，引物由上海 生工生物工程技術服務有限公司合成。弓l物序列如下bo-mDpl (27-155) F: ggg aat tc|c ata tg|a gag gca taa age aca gaa tc (35 ) bo-mDpl(27-155) R: ccg |ctc gag [tgc tec cct ttc caa cca aa (29)注邊框線表示AWd(上遊引物)^01 (下遊引物)識別位點，下畫線前面的鹼基表示添加的酶切保護鹼基。利用前述的合成引物(引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)，以boDpl-T克隆質粒為模板，進行PCR擴增。反應體系同1.2。 PCR擴增程序如下 95。C預變性5min後，進行如下循環94°C 45s、 50°C 45s、 72°C 45s ， 30個循環 之後，72'C延伸10min結束。1.2.1.2重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl的構建將實施例中1.2.1.1的PCR產物用PCR清潔試劑盒純化後進行A^I和 屈ol雙酶切，同時也用這兩個酶雙切pET-30a(+)載體，然後用DNA凝膠回收試劑 盒回收雙酶切產物，之後在K DNA連接酶的作用下16'C過夜連接載體和牛成熟 Dpl的編碼基因。將連接產物電轉化入大連寶生物工程有限公司生產的大腸桿菌 JM109感受態細胞中，37。C震蕩培養50分鐘，然後將菌液塗布於含50ng/mL卡 那黴素的LA培養基平板上培養，37。C生長12-16小時。挑取單菌落培養，然後進 行PCR和質粒的A^/el和;^oI雙酶切鑑定，並進行測序分析。PCR鑑定結果如圖3 所示，結果表明PCR擴增得到的片段大小與預計DNA片段387bp相接近。雙酶切 鑑定結果如圖4所示，結果表明從單菌落提取的質粒經A^I和^zo I雙酶切後釋放 出同387bp大小相符的DNA片段，與預期結果相一致。進一步將該單菌落的質粒 進行測序，測序結果表明實驗獲得的質粒為含有牛成熟Dpl編碼基因的重組質 粒，測序結果見附的序列l。將該質粒命名為pET30a(+)-bomDpl，將含有該質粒 的JM109大腸桿菌菌株相應地命名為pET30a(+)-bomDp1- JM109，並將該菌種保 存至含有12y。甘油的LB培養基中，-2(TC凍存。LA培養基在LB培養基中添加2。/。的瓊脂粉，然後蒸汽高壓滅菌，121°C，30分鐘。卡那黴素LA平板在LA培養基溫度降至5(TC以下時(手能持住)，加入卡 那黴素，使其終濃度為50嗎/mL，然後倒入高壓過的平板，自然冷卻凝固。 1.2.2中國黃牛mDpl的大腸桿菌高效表達 1.2.2.1表達菌株卩￡丁30&(+)-1501110卩1- BL21(DE3)的篩選 將實施例〈一〉中1.2丄2獲得的質粒pET30a(+)-bomDpl轉化至大連寶生物工 程有限公司生產的大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，轉化後菌液均勻塗布於含 50pg/mL卡那黴素的LA平板，培養10小時以上，挑選生長良好的單菌落，提取 其質粒進行PCR鑑定以及Ndel和XhoI雙酶切鑑定，PCR鑑定結果與附圖3相一致， 雙酶切鑑定結果與附圖4相一致，這表明pET30a(+)-bomDpl質粒被成功地轉入大 腸桿菌BL21(DE3)中，將獲得該質粒的齒株命名為ET30a(十)-bomDpl-BL21(DE3)， 並將該菌種保存至含有12。/。甘油的LB培養基中，-20°0凍存。1.2.2.2表達菌株pET30a(+)-bomDp1- BL21(DE3)的誘導表達 將pET30a(+)-bomDpl-BL21(DE3)菌株和含有pET30a(+)空載體的BL21(DE3) 菌株分別同時接種至含有25嗎/mL卡那黴素的5mLLB培養基中，37。C振蕩過夜 培養。取過夜培養物5.0 mL接種到500mL的含有25嗎/mL卡那黴素的LB培養基， 37。C振蕩培養至OD柳nm值約0.6時，加入Amresco公司生產的IPTG，使其終濃度 為1.0mmol/L，繼續振搖，37。C誘導6h後，離心收穫菌體，用10mL去離子水懸浮 沉澱，冰浴超聲，條件為超聲5秒間隔5秒，時間15分鐘，功率200W。取少量(200nL 左右)超聲後的勻漿物離心，分別收集上清夜和沉澱，將沉澱再用200pL去離子 水懸浮，然後分別等體積加入2倍蛋白質上樣緩衝液，煮沸5分鐘後12000轉/分鐘 離心，然後進行12。/oSDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。結果如附 圖5所示，重組牛成熟Dpl被大腸桿菌BL21(DE3)在IPTG誘導下高效表達，表達 產物以包涵體的形式存在，其分子量大小為15KD，與預計大小相一致。 1.2.3中國黃牛mDpl大腸桿菌表達產物的純化 用Ni-NTA樹脂親和層析法和切膠後的電洗脫法純化目的蛋白。 1.2.3.1 Ni-NTA樹脂親和層析法Ni畫NTA樹脂購自Invitrogen公司，按照公司說明書關於大腸桿菌表達的以包 涵休形式存在的表達產物純化步驟純化。① 所需溶液Buffer B: 8 M尿素(Urea), 0.1 MNaH2P04, 0.01 M Tris-HCl pH8.0 Buffer C: 8 M尿素，0.1 MNaH2P04, 0.01 M Tris陽HCl pH6.3 Buffer E: 8 M尿素，0.1 M NaH2P04, 0.01 M Tris畫HCl pH4.5 再生緩衝液6M鹽酸胍(Gu-HCl)， 0.2 M乙酸，37 °C保存。 2%SDS; 0.1 MEDTApH8.0; 0.1MNiSO4② 蛋白純化將實施例中1.2.2.2超聲波破碎後的沉澱按每100mL菌液所收集的沉澱加入2mL的BufferB溶液，吹打均勻，放搖床上220轉/分鐘，60 分鐘；然後吸入1.5mL離心管中，多次重複離心，取上清，直至無沉澱為止；將 離心所收集的上清吸入25mL血清瓶中，按Ni-NTA樹脂與上清(以下簡稱樹脂) 之比為1:4的比例加樹脂，在37t:下，220轉/分鐘，作用60分鐘，使目的蛋白與 樹脂充分結合；將混合物豎直加入柱內，使液體自然流出；待柱內無液體流出 時，向柱內加入BufferC，按照lmL樹脂洗2次4， 2mL樹脂洗4次，每次4mL， 隨時用考馬斯亮蘭染色液檢測流出的液體，直至液體滴入染色液後不再變藍色 為至，這表明未被樹脂結合的雜蛋白大部分被洗去；然後加入BufferE洗脫目的 蛋白，收集流出的液體，隨時用考馬斯亮蘭染色液檢測流出的液體，直至液體 滴入染色液後不再變藍色為至，這表明與樹脂結合的目的蛋白大部分被洗脫下 來；取收集的少量液體進行12% SDS-PAGE分析。考馬斯亮蘭染色液稱100mg考馬斯亮蘭G—250，溶於50mL 95%的乙醇後， 再加入120mL85。/。的磷酸，用水稀釋至l升。1.2.3.2切膠電洗脫法由於採用Ni-NTA樹脂親和層析法純化得到的目的蛋白純度只有70%左右 (軟體分析SDS-PAGE膠)，所以進一步採用切取SDS-PAGE後的S的蛋白條帶再 用電洗脫法純化重組蛋白。將樹脂純化後的蛋白進行12。/。SDS-PAGE，電泳結朿 後採用常規的考馬斯亮藍染色，IO分鐘左右肉眼下可以看見較粗的目的蛋白條 帶，切取此目的蛋白帶後裝入BioRad公司生產的電洗脫儀中，160mA，電泳4小 時。此外，採用適宜分子量的透析袋代替電洗脫儀也可以，將切取的膠條裝入 透析袋中，倒入蛋白電泳緩衝液，排除氣泡後紮緊兩端，放入裝滿蛋白電泳緩 衝液的水平電泳槽中電泳， 一般恆壓120伏，電泳5小時左右即可。結束後吸出 蛋白溶液，用超濾管離心濃縮，並更換為生理鹽水或者PBS緩衝液，調整體積為 2mL左右，進一步進行12。/。SDS-PAGE分析，並用分光光度法測定濃縮後的目的 蛋白濃度。結果如附圖5所示，電泳掃描分析結果表明經進-- 步切膠電洗脫純化 的目的蛋白純度可達95%左右。圖5中的35KDa左右的條帶是重組牛成熟Dpl的二 聚體形式。通過親和層析富集了目的蛋白，利於進一步的切膠純化。切膠能夠根據需 要準確地切取目的蛋白條帶，充分保障/目的蛋白的純度，再通過電泳將目的 蛋白從膠條中跑出，吸出含有目的蛋白的緩衝液並進-歩超濾濃縮即可獲得高 純度和高濃度的目的蛋白。該方法簡單，不用摸索實驗條件，而且成本較低， 尤其是用透析袋進行電洗脫。此外，最重要的一點是能夠保障目的蛋白的純度。 所以，本實驗通過該些簡單實用的方法獲得了高純度的中國黃牛重組mDpl，保障了免疫原的純度。2. mab-bomDpl-9的製備與純化2.1動物免疫、細胞融合及陽性雜交瘤細胞株的間接ELISA篩選實驗組是以前述親和層析和膠洗脫純化的重組型中國黃牛mDpl蛋白為免 疫原，免疫Balb/C小鼠，80-100ng/只。首次以弗氏完全佐劑(Sigma公司)乳化， 背部皮下3-4點注射，分別間隔15天以後進行第二、三次免疫，此時採用弗氏不 完全佐劑(Sigma公司)乳化，第三次免疫結束15天後進行加強免疫，直接腹腔 注射重組牛mDpl蛋白。同時設立對照組，即將免疫原由重組牛mDpl改換為 pET-30a(+)空載體菌體蛋白，免疫程序同實驗組。加強免疫三天後，收集實驗組 Balb/C鼠的脾細胞，在50%聚乙二醇1500 (Rodii公司)的作用下與鼠骨髓瘤細 胞SP2/0以5: l進行室溫融合。以間接ELISA方法篩選出能夠穩定分泌針對重組 牛mDpl的單抗的陽性雜交瘤細胞株。間接ELISA方法的建立如下分別以純化 的重組牛mDpl蛋白(A)禾npET-30a(+)空載體菌體蛋白(B:i包被酶標板孔，進行 平行反應。以免疫了B蛋白的對照鼠血清C(1:480)和SP2/0細胞上清液D為陰性對 照，以免疫了A蛋白的融合鼠血清E (1:480)和抗中國黃牛成熟Dpl兔源多抗F (l:2xl04) CF多抗血清由本發明申請單位製備保存)為陽性對照，用抗體稀釋液 稀釋血清C、 E和F，分別測定OD柳nm值。篩選方法建立當C對A、 D對A、 D對 B、 E對B、 F對B的值均〈0.2，而E對A和F對A的值均^0.8時，表明間接ELISA檢 測方法成立。陽性雜交瘤判斷標準I .待檢細胞上清對A/待檢細胞上清對B23; 11.待檢細胞上清對A/C對A^3; 111.待檢細胞上清對A/D對A^3; I、 II和m二個條 件均成立時，則可判為陽性雜交瘤。通過三次有限稀釋法的亞克隆和間接ELISA 篩選，獲得了能夠穩定分泌抗重組牛mDpl的陽性雜交瘤細胞株——csbomDpl-9， 在第三次亞克隆結束後擴大體積培養。抗體稀釋液製備如下5%蔗糖(60g) + 5%脫脂奶粉(60g) + 10%馬血 清(120mL) + 1%大腸桿菌裂解液(12mL)，用PBST定容至1200mL。大腸 桿菌裂解液收集500mL含有pET-30a(+)空載體的Eco/z'BL21(DE3)菌體，用 TE緩衝液洗滌兩次，加入50mLPBS緩衝液懸浮，超聲波破碎即可。 2.2 Mab-bomDpl-9的大量生產及純化採用腹水製備法大量生產mab-bomDpl-9,採用葡萄球菌蛋白A親和層析法 純化腹水抗體。2.2.1腹水製備法大量生產mab-bomDpl-9先腹腔注射0.5mL無菌礦物油於Fl代小鼠，1周後向其腹腔注射1"06個 csbomDpl-9雜交瘤細胞，接種雜交瘤細胞7 10天後，Fl代小鼠產生腹水，當 小鼠頻於死亡之前，拉頸處死小鼠，打開腹腔，吸取腹水，離心收集上清夜， 即獲得腹水抗體。2.2.2葡萄球菌蛋白A親和層析法純化腹水抗體採用美國Calbiochem公司生產的葡萄球菌蛋白A純化收集腹水抗體，操作 過程按照公司提供的說明書進行。最後將洗脫的蛋白液合併在一起，超濾濃縮 至一定體積後，再用磷酸鹽緩衝液調整。取樣進行SDS-PAGE，檢測純化抗體的純度。mab-bomDpl-9純化後的SDS-PAGE結果如附圖6第3泳道所示，結果 表明採用葡萄球菌蛋白A純化的腹水mab-bomDpl-9效果理想，獲得了單抗的輕、 重鏈蛋白，其純度可以達到90%左右。 3.Mab-bomDpl-9的生物學特性鑑定Mab-bomDpl-9的生物學特性鑑定包括免疫球蛋白(Ig)類與亞類、效價、 特異性、交叉反應以及與牛和羊睪丸組織中mDpl發生Western-Blotting分析。3.1 Ig類與亞類的鑑定採用Sigma公司鼠源單抗亞類鑑定試劑盒對腹水 mab-bomDpl-9進行測定,測定方法採用抗體雙夾心ELISA法，操作按說明書進行。 結果顯示mab-bomDpI-9屬於IgG2a。3.2效價測定採用間接ELISA法測定腹水mab-bomDpl-9的效價。以純化 的重組牛mDpl為包被抗原，將腹水抗體從1:10倍開始用抗體稀釋液做系列稀 釋，然後加入辣根過氧化物酶標記的IgG，讀取OD492,光吸收值，當OD492nm 值接近0.8時的稀釋倍數為此單抗的效價。結果表明腹水mab-bomDpl-9的效價 為lxl(T4。3.3特異性分析因為本專利申請的mab-bomDp1-9製備的免疫原是E Co// 表達的重組蛋G，所以，首先考慮是否與含有pET-30a(+)空載體的五.CO//BL21 (DE3)菌體蛋白發生反應。此外，由於疊朊Dpl與朊蛋白PrP的結構接近，而 且兩者關係密切，所以本實驗還檢測了獲得的mab-bomDpl-9與重組牛成熟朊蛋 白bomPrP的反應性。檢測方法採用Western Blotting。 Western Blotting的操作過 程如《分子克隆實驗指南》所述(這裡這樣寫可以嗎)，首先將含有pET-30a(+) 空載體的￡.0 //菌體蛋白、重組牛mDpl、重組牛mPrP進行SDS-PAGE後轉印 至硝酸纖維素膜上，以純化的腹水mab-bomDpl-9為檢測抗體進行Western Blotting分析，結果如附圖7所示。分析結果表明，mab-bomDpl-9僅與重組牛mDpl 的單體和二聚體發生反應，而不與重組牛成熟朊蛋白和空載體菌體蛋白反應， 這顯示本發明獲得的mab-bomDpl-9能夠特異地識別和結合牛疊朊蛋白Dpl。3.4交叉反應性通過Western Blotting確定mab-bomDpl-9與重組羊或者人 的mDpl(由本專利申請單位的實驗室製備保存，這裡這樣寫可以嗎)的反應性， 以確定獲得單抗的交叉反應性。Western Blotting的操作過程基本如前所述，實 驗結果如附圖8所示，結果表明mab-bomDpl-9能夠識別和結合重組羊或者人的 mDpl (包括單體和二聚體)，與其發生了交叉反應，這為擴大mab-bomDpl-9的應用範圍奠定了基礎。3.5 Mab-bomDpl-9與牛和羊睪丸組織中mDpl發生的Western Blotting牛和羊睪丸組織中Dpl提取物電泳樣品的製備參見《中國專利公報》第23巻 第41期的《中國黃牛成熟疊朊蛋白及多克隆抗體的製備方法》的4.1和4.2節的有 關內容。經15% SDS-PAGE後進行Western Blotting,結果如附圖9所示。圖譜顯 示，mab-bomDpl-9與牛、羊睪丸組織提取物中的mDpl發牛了反應。這表明本發明獲得的單抗mab-bomDpl-9能夠識別和結合哺乳動物組織中的mDpl，這拓寬了 本發明單抗的應用範圍。3.5.1牛、羊睪丸組織Dpl提取物電泳樣品的製備稱取正常牛、羊睪丸組織2.0g，放入勻漿器屮，加入8mL勻漿緩衝液(150mM NaC丄，10mMTris陽HCl， pH7.5， 1.0%脫氧膽酸鈉，1.0%SDS， 1.0%NP-40， 10mM EDTA)，在冰上將該組織手動勻漿，分別得到牛或羊睪丸組織的勻漿樣品。將 該些樣品分別超聲處理後，4°C， 10000轉/分鐘，離心10分鐘，收集上清液，-70°C 凍存。3.5.2 Western blotting檢測牛、羊睪丸組織Dpl取-7(TC凍存的牛或者羊睪丸組織裂解上清液，加入等體積的2倍蛋白電泳上 樣緩衝液，混勻，煮沸10分鐘，進行SDS-PAGE後轉印至硝酸纖維素膜上，以純 化的腹水mab-bomDpl-9為檢測抗體進行WesternBlotting分析，結果如附圖2所示。 Western Blotting實驗結果表明，本發明製備的mab-bomDpl-9能夠特異地識別和結合牛或者羊睪丸組織中存在的Dpl，而且與睪丸組織Dpl的二聚體形式發生了較 強反應。實施例〈二〉Mab-bomDpl-9輕、重鏈可變區編碼基因克隆、測序與分析本發明通過對GenbanK登錄的鼠源單抗輕、重鏈可變區編碼基因序列的分析 和比較，設計了兩對克隆引物，通過PCR擴增獲得了mab-bomDpl-9輕鏈和重鏈 可變區編碼基因。具體操作過程如下1. RNA提取細胞RNA的提取採用Qiagen公司的RNA提取試劑盒進行提取。首先培養 分泌mab-bomDpl-9的雜交瘤細胞csbomDpl-9，採用1640培養基〔日水公司)， 20%胎牛血清(杭州四季青公司產品)，在5%C02， 37。C條件下培養。離心收 集細胞，用PBS緩衝液洗滌細胞沉澱2次，之後按照RNA提取試劑盒操作說明 書進行。2. 合成cDNA第一鏈採用Qiagen公司的cDNA第一鏈合成試劑盒進行。在上述提取的RNA基 礎上，以oligadT(15)為引物，在反轉錄酶的作用下合成了 cDNA第一鏈，具體 操作按照說明書進行(這裡這樣寫可以嗎)。3. PCR擴增輕鏈和重鏈可變區編碼基因以合成的cDNA第一鏈為模板，擴增輕鏈可變區編碼基因時以VKLfor3和 VKLbackl為上、下遊引物，擴增重鏈可變區編碼基因時以VH1F0R和VH1BACK 為上、下遊引物，在7^DNA聚合酶(Takara公司)的作用進行PCR擴增。擴 增程序為95。C變性5min;之後進行如下循環94°C 45sec， 50°C 30sec， 72°C 50sec,30個循環；最後72'C延伸8分鐘。PCR結束後進行瓊脂糖凝膠電泳檢測， 結果見圖5。圖5顯示，通過PCR擴增獲得了預計大小的DNA片段，輕鏈大小為360bp左右，重鏈大小為380bp左右。VKLfor3: 5-GACATTGTGATGACCCAGTC-3 VKLbackl: 5-GATGGATACAGTTGGTGCAG-3VH1F0R: 5-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG-3 ■BACK: 5-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG畫3S = C or G, M = A or C, R= A or G, and W = A or T4.測序PCR擴增的輕鏈和重鏈可變區編碼基因分別採用凝膠回收試劑盒純化PCR擴增的mab-bomDpl-9輕鏈和重鏈的 DNA片段，然後與Takara公司的pMD-18T載體連接，Cacl2法將連接產物轉入 E Co/ZJM109感受態細胞中，轉化結束後37t:震搖1小時，然後取適量菌液均 勻地塗布在含有200嗎/mL氨苄青黴素的LB瓊脂粉T板上，37。C過夜培養，挑 取單菌落進行PCR鑑定並擴大培養，提取相應質粒，送至公司進行測序，測序 結果的輕鏈可變區基因見後附的序列表2，重鏈可變區基因見後附的序列 表 3。對測定序列運用Blast軟體進行分析比對，結果表明，通過設計的 引物，採用PCR擴增法獲得了 mab-bomDpl-9輕、重鏈可變區編碼基因，其中 mab-bomDpl-9的輕鏈可變區編碼基因與Genbank登錄的鼠源單抗輕鏈可變區序 列最高同源性為99%， mab-bomDpl-9的重鏈可變區編碼基丙與Genbank登錄的 單抗重鏈可變區序列最高同源性為94%。實施例 Mab-PrP102-6及其輕、重鏈可變區編碼基因的用途本發明製備的抗屮國黃牛mDpl的mab-bomDpl-9可以作為檢測牛、羊和人 等哺乳動物疊朊蛋白被大腸桿菌、酵母菌或者其它真核細胞表達的檢測試劑； 可以作為研究哺乳動物Dpl與PrP、 PrPSe、受體以及其它因素相互作用關係的 試齊U;可以作為檢測和研究牛、羊等一些哺乳動物體內mDpl存在和分布情況的 試劑；通過以抗Dpl的單抗為實驗工具，可以研究Dpl的結構與功能，可以深 入研究Dpl在狂牛症和癢病等海綿狀腦病發病中的作用。總之，mab-bomDpl-9 可以作為檢測和研究mDpl存在和分布試劑，可以應用於Western Blotting、 ELISA、免疫組化等免疫學研究方法中。在本發明獲得的mab-bomDpl-9輕、重鏈可變區編碼基因基礎上，通過添加 合適的酶切位點和短的連接肽，可以將兩者連接起來，插入表達載體，導入大 腸桿菌、酵母菌或者其它真核細胞中，進行誘導表達，從而獲得相應的單鏈抗 體。這些單鏈抗體不僅可以代替mab-bomDpl-9作為上述研究和檢測的試劑，而 且來源更加便捷，利於大量生產。附基因序列表重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl的測序序列<400〉 1catatgagaggcataaagca cagaatcaagtgg犯ccgg已已ggtcttgcc50aagttcctcccaggtcacgg aggcccacactgcggaaatccgcccagggg100ccttcatx肌gc肌ggccga皿gctggatatcgactttgg150aataggtact3tg3ggCC犯Ct3ttggC兆tttcctgacggcatccatta200caacggctgctCC犯ggCC3 atgtcscc肌atcaccagct250gcattaatgccaccca_ggcg gcg犯tca^gaggaactgtcccgtgagaaa300caagac犯c3agctttacca gcaggtcctgtggcagctgeitc鄉gagct350ctgctccacc朋gcagtgtg acttttggttgcactcg兆399mab-bomDpl-9的輕鏈可變區編碼基因序列 2Lgacccag L c 〔:c Lgc L Lc(.:c〔c丄g'gggca50gagggccacca^tctc3tac8 gggcc3gc犯aagtgtc兆tacatctggct100atagttatatgcsctggaac C3已ca^犯ccagg3ca^gccacccagactc150ctcatctatcttgtatcc犯cctagaatctggggtccctgccaggttcag200tggc兆tgggtctgggacag acttxaccctcaacatccatcctgtggagg250tgcaacctat tactgtcagcacattagggagcttacacgt300tcgg鄉ggggeiccaBgctg g肌Eitaa犯cgggctgatgctgcaccaact350gtatccatc359mab-bomDpl-9的重鏈可變區編碼基因序列<400〉 3tgcgg卿cgatgaccgtgg tcccttggccccagtagtcggtcccctctc50ttgcacagtaatagaccgca gagtcctcaggctg郷tgc100atgtaggctgtgttggaggs ttcgtctsctgtc組gtggccttgcgctt150gaacttttgattgtagtttc cataattatcagaagt已tcaatcgctccga200tccactcaaggccttgtcca ggcctctggttcacccagtgC3tCC￡Lgt8g250tC3gtg肌tgtgtagccaga agccttgcaggacatcttcactgcagcccc300aggcatcacaacctcagccc cagactgctgcagctagacct34權利要求
1、抗中國黃牛成熟疊朊蛋白mDpl的單抗「mab-bomDpl-9」，其特徵是輕鏈可變區基因為基因序列表4001，其重鏈可變區基因為基因序列表4002。
2、 權利要求1所述的抗中國黃牛成熟疊朊蛋白mDpl的單抗"mab-bomDpl-9" 製備方法，其特徵是以純化的大腸桿菌表達的重組牛mDpl為免疫原免疫小鼠， 取免疫鼠的脾細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出雜交瘤細胞株，並克隆出陽性 雜交瘤細胞株，在鼠體內接種雜交瘤細胞生產腹水抗體，收集腹水進行親和層 析純化，得到單抗。
3、 根據權利要求2所述的方法其特徵是採用含有中國黃牛mDpl編碼基 因的重組表達質粒pET30a(+)-bomDpl和含有該重組表達質粒的大腸桿菌 BL21(DE3)plys表達菌株pET30a(+)-bomDpl-BL21(DE3)plys，以異丙基硫代半乳 糖苷(IPTG)誘導表達菌株，表達重組牛mDpl，收集包涵體後，採用親和層析法 和切膠後的電洗脫法純化重組蛋白，以純化後的重組牛mDpl為免疫原免疫 Balb/C小鼠，取免疫鼠脾細胞與鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，採用間接ELISA方 法篩選融合的雜交瘤細胞株，再用有限稀釋法克隆篩選的陽性雜交瘤細胞株， 獲得了能夠穩定分泌抗重組牛mDpl的陽性雜交瘤細胞株---csbomDpl-9，在鼠 體內接種雜交瘤細胞csbomDpl-9，生產腹水抗體，抽取腹水，離心收集上清液， 以葡萄球菌蛋白A親和純化，得到抗牛mDpl的mab-bomDpl-9。
4、 權利要求1所述的單抗用於製備供研究使用的試劑。
5、 權利要求1所述的單抗用於製備相應的單鏈抗體。
全文摘要
本發明公開採用基因工程製備抗牛成熟疊朊蛋白(mature Dpl，mDpl)的單抗mab-bomDpl-9，以及這種單抗的製備方法和用途。其中Mab-bomDpl-9的製備方法是以純化的大腸桿菌表達的重組型中國黃牛mDpl為免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾細胞與鼠骨髓瘤細胞融合，篩選出雜交瘤細胞株，並克隆出陽性雜交瘤細胞株，在鼠體內接種雜交瘤細胞生產腹水抗體，收集腹水進行親和層析純化，得到抗牛mDpl的單抗。
文檔編號C07K14/47GK101402684SQ200810176229
公開日2009年4月8日 申請日期2008年11月14日 優先權日2008年11月14日
發明者劉永生, 傑 張, 陳豪泰, 馬麗娜 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所