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一種抑制鴨圓環病毒基因表達的shRNA

2023-08-13 18:33:27 4


一種抑制鴨圓環病毒基因表達的shrna
技術領域
1.本發明屬於基因工程及其應用領域,涉及一種抑制鴨圓環病毒基因表達的shrna。


背景技術:

2.鴨圓環病毒(duck circovirus,ducv)是圓環病毒科圓環病毒屬的成員,無囊膜,遺傳物質為單股環型dna結構。該病毒由hanemann於2003年在德國首次報導。在我國,姜世金等(2007)首次從2006年在福建省採集的鴨疫裡默氏菌病鴨樣品中檢測到ducv。劉少寧等(2008-2009)對來自山東、江蘇、四川、福建和廣東5個省份36個鴨群343份組織樣品進行檢測,發現ducv檢出率高達81.63%,鴨群陽性率達94.44%;其中山東18個肉鴨場陽性率為88.89%,12個種鴨場的陽性率為75%。這些數據說明十幾年前鴨圓環病毒已經在中國主要養鴨省市鴨群中普遍感染。從2018-2021年對全國各地發病鴨群的檢測數據來看,ducv的感染率仍然極高,是鴨群中感染率最高的病毒,並且多數與大腸桿菌、鴨疫裡默氏桿菌、腺病毒、鴨細小病毒、坦布蘇病毒、呼腸孤病毒、流感病毒等病原混感。對混感鴨群治療發現,只要混感有ducv的鴨群,都難以達到良好的治療效果。ducv感染過程緩慢,通常本身不造成明顯的臨床症狀,因此非常容易被忽視,由於它主要侵害鴨的免疫系統,導致鴨抵抗力下降,因此極易造成其它病原的繼發感染,嚴重影響治療效果,能夠造成巨大的經濟損失。
3.由於目前ducv在動物細胞和禽胚上難以增殖培養,因此目前尚無商品化疫苗。卵黃抗體是抗病毒常用的生物製劑,是從免疫禽蛋中提取出的針對特定抗原的抗體,由於卵黃中僅有特異性的igy類抗體,故稱其為卵黃免疫球蛋白igy。目前,實驗室研究表明抗鴨圓環病毒卵黃抗體對臨床治療鴨圓環病毒感染有效。發明人團隊也使用鴨圓環病毒感染雛鴨的肝臟組織製作組織滅活苗,並免疫蛋雞製備了抗鴨圓環病毒卵黃抗體並進行了臨床效果檢驗,結果表明單獨的抗鴨圓環病毒卵黃抗體確實能夠顯著降低感染率和發病率,但是抑制效果有限,仍需要進一步提高治療效果。因此,研製新型抗鴨圓環病毒感染藥物是一個亟待解決的課題。


技術實現要素:

4.針對現有技術中的上述情況,本發明的發明人提供了一種抑制鴨圓環病毒基因表達的shrna,上述shrna為人工合成,可以抑制鴨圓環病毒的rep和cap基因表達,從而起到抑制病毒在鴨體內複製的作用。通過實驗證實,注射含有shrna幹擾序列的重組質粒能夠顯著抑制病毒在鴨體內的複製,與對照組相比,病毒拷貝數最大降低了100倍,在鴨圓環病毒臨床防控方面具有重要意義。
5.本發明的具體原理如下:
6.rna幹擾(rnai)存在於各種真核生物細胞中,是一種進化保守的基因沉默機制,能夠以序列特異性方式降解相應的mrna,從而導致靶基因的沉默。rnai的抗病毒作用最先是在植物體內被發現的,是植物體內重要的抗病毒方式。這一機制發現為動物體內的抗病毒治療提供了一種新策略。目前,已經在動物體內實現了由小幹擾rna和短髮卡rna(sirna和
shrna)介導的病毒mrna降解,從而抑制病毒在體內的增殖。短髮卡rna是一種能夠克隆到表達載體並表達sirna的雙鏈dna分子。與使用合成的sirna相比,shrna在沉默靶基因方面具有多種優勢,例如穩定性高、遞送方式簡單、成本低等特點,能夠通過注射直接抑制動物體內的病毒複製,在治療動物病毒性疾病方面具有廣闊前景。因此,發明人設計了一種抑制ducv基因表達的shrna幹擾序列,直接注射含有幹擾序列的重組質粒能夠顯著抑制病毒在鴨體內的複製,若進一步與抗鴨圓環病毒卵黃抗體合同使用能夠取得更加優良的抗鴨圓環病毒感染的效果,值得臨床推廣應用。
7.本發明的具體技術方案如下:
8.一種抑制鴨圓環病毒基因表達的shrna,具體為rep-1、rep-2、cap-1、ca p-2中的任意一條,每條shrna幹擾序列包括正鏈和負鏈,其中:
9.rep-1正鏈:5
』‑
gatccgcaagaggtgggtctttaccattaat ctgtgaagccacagatg ggattaatggtaaagacccacctcttgctttttta-3』,如seq id no.1所示;
10.rep-1負鏈:5
』‑
agcttaaaaaagcaagaggtgggtctttaccattaat cccatctgtgg cttcacagattaatggtaaagacccacctcttgcg-3』,如seq id no.2所示;
11.rep-2正鏈:5
』‑
gatccgcctaatcgtcgagacgcaacgtgat ctgtgaagccacagatg ggatcacgttgcgtctcgacgattaggctttttta-3』,如seq id no.3所示;
12.rep-2負鏈:5
』‑
agcttaaaaaagcctaatcgtcgagacgcaacgtgat cccatctgtgg cttcacagatcacgttgcgtctcgacgattaggcg-3』,如seq id no.4所示;
13.cap-1正鏈:5
』‑
gatccgcgattcgtagccttcgtcttctgaa ctgtgaagccacagatg ggttcagaagacgaaggctacgaatcgctttttta-3』,如seq id no.5所示;
14.cap-1負鏈:5
』‑
agcttaaaaaagcgattcgtagccttcgtcttctgaa cccatctgtgg cttcacagttcagaagacgaaggctacgaatcgcg-3』,如seq id no.6所示;
15.cap-2正鏈:5
』‑
gatccgccactcctgttgtgttgtctggttt ctgtgaagccacagatg gg aaaccagacaacacaacaggagtggctttttta-3』,如seq id no.7所示;
16.cap-2負鏈:5
』‑
agcttaaaaaagccactcctgttgtgttgtctggttt cccatctgtgg cttcacagaaaccagacaacacaacaggagtggcg-3』,如seq id no.8所示;
17.除此之外,發明人還提供了陰性對照序列如下:
18.shrna對照正鏈:5
』‑
gatcctcccgttaatctgagggtaaagttag ctgtgaagccacag atgggctaactttaccctcagattaacgggatttttta-3』,如seq id no.9所示;
19.shrna對照負鏈:5
』‑
agcttaaaaaatcccgttaatctgagggtaaagttag cccatct gtggcttcacagctaactttaccctcagattaacgggag-3』,如seq id no.10所示;
20.上述序列中的loop序列為ctgtgaagccacagatggg,如seq id no.11所示;
21.其中shrna對照並不具備抗病毒作用,發明人設置該對照是為了證明是上述設計的序列發揮作用而非載體骨架發揮作用,發明人特此說明。
22.發明人進一步提供了上述shrna的表達載體構建方法,具體步驟如下:
23.(1)設計合成針對ducv rep和cap基因的有效sirna靶點(靶點在ducv基因組中的位置如圖1所示),得到靶向ducv rep和cap基因的有效靶點序列rep-1:5
』‑
caagaggtgggtctttaccattaat-3』,如seq id no.12所示;
24.rep-2:5
』‑
cctaatcgtcgagacgcaacgtgat-3』,如seq id no.13所示;
25.cap-1:5
』‑
cgattcgtagccttcgtcttctgaa-3』,如seq id no.14所示;
26.cap-2:5
』‑
ccactcctgttgtgttgtctggttt-3』,如seq id no.15所示;
27.(2)在sirna靶點添加限制性酶切位點以及loop序列,shrna幹擾序列結構如圖2所示,shrna加工後生成sirna如圖3所示;
28.(3)分別合成抑制ducv rep和cap基因表達的shrna幹擾序列的正鏈和負鏈;
29.(4)將正鏈和負鏈混合後進行退火,形成具有粘性末端的互補雙鏈dna片段;
30.(5)將shrna空表達載體進行雙酶切並回收,形成具有粘性末端的線性shrna表達載體;
31.(6)將上述線性化載體與雙鏈dna使用t4-dna連接酶連接,轉入大腸桿菌感受態中。根據質粒上抗生素的抗性基因種類,使用含有相應抗生素的培養皿進行初篩,然後經pcr、測序鑑定後得到陽性克隆。
32.上述shrna表達載體的構建方法,所述空表達載體為pbasi-hu6;
33.上述最終獲得的shrna表達載體在抑制ducv rep和cap基因表達中的應用。
34.綜上,本發明設計了抑制ducv rep和cap基因表達的shrna並構建了相應的shrna表達載體,通過與卵黃抗體混合後注射的方式將shrna表達載體導入鴨體內,從而有效抑制ducv在體內的複製。該方法能夠降低抗體的使用量並提高了抗體的治療效果,操作簡便,工藝穩定且具有良好的適用性。
附圖說明
35.圖1為ducv基因組shrna沉默位點示意圖,
36.圖中1993bp為鴨圓環環狀基因組大小,其中箭頭所指方向為相應基因的轉錄方向,shrna-cap-1/sharna-cap-2/shrna-rep-1/shrna-rep-2的黑色方塊為shrna序列在鴨圓環基因組中的位置;
37.圖2為shrna幹擾序列結構示意圖,
38.bamhⅰ與hindⅲ為限制性酶切位點,位點處5』和3』末端為目的序列雙鏈合成後產生的粘性末端,經t4-dna連接酶連接後與載體上的粘性末端互補結合,目的序列所在黑色方框中的n可以代表a/t/c/g中的任意一種,具體含義與目的序列有關,terminator序列為rna聚合酶轉錄終止信號,含有loop序列的shrna可被細胞內dicer酶所切割,隨後形成相應的sirna;
39.圖3為sirna序列的加工生成過程示意圖,
40.細胞內rna聚合酶識別u6 promoter(一種啟動子,啟動轉錄),隨後啟動轉錄,將dna序列轉錄為含有目的序列和loop序列的發卡型rna,發卡型rna會被細胞內dicer酶切割,形成不含有loop序列的sirna,nn為a/t/c/g任意一種(具體取決於目的序列),u為尿嘧啶,在rna中的作用與t在dna中相似;
41.圖4為5種shrna重組表達載體純度的瓊脂糖凝膠電泳檢測示意圖,
42.左側條帶為marker,具有指示所檢測dna序列大小的作用;右側5個孔分別為相應的shrna重組表達載體質粒電泳圖,由於質粒具有多種構象,因此其電泳速率與marker所用線性dna不同;與marker所指示大小存在一定差異,屬於正常現象;
43.圖5為shrna表達載體pbasi-hu6圖譜示意圖,
44.ori為載體在大腸桿菌中的複製起點,amp為質粒所攜帶的抗性基因,為質粒在大腸桿菌內長期存在所必須的;u6 promoter為轉錄啟動子,bamhⅰ、hindⅲ為酶切位點;
45.圖6為shrna對pbmc中ducv的抑制作用柱狀圖,
46.relative virus content為相對病毒濃度,柱狀圖上方星號*表示各shrna治療組與pbs組病毒拷貝數相比差異顯著(p《0.05),**表示差異極顯著(p《0.01),ns表示差異不顯著(p》0.05);
47.圖7為shrna對鴨體內ducv的抑制作用柱狀圖
48.relative virus content為相對病毒濃度,柱狀圖上方星號*表示各shrna治療組與pbs組病毒拷貝數相比差異顯著(p《0.05),**表示差異極顯著(p《0.01),ns表示差異不顯著(p》0.05),48、72和96為治療後的時間(h)。
具體實施方式
49.以下結合附圖對本發明的上述發明內容作進一步的詳細描述。應理解,這些實施例僅為了說明本發明而不是為了限制本發明的保護範圍。實施例中所採用的具體技術均為本領域的常規技術,所採用的生物材料均為發明人在研究過程中從正規途徑和合法渠道獲得的已知生物材料,發明人列舉相關技術如下:但是其他未被列入的具體技術也均為已知技術,發明人不再贅述。
50.實施例1
51.shrna載體的構建與驗證
52.(1)幹擾序列設計
53.根據genbank中ducv基因組信息(genbank:on227548.1)設計幹擾序列併合成,幹擾序列信息如表1所示;
54.表1shrna插入序列
55.[0056][0057]
(2)shrna表達載體的限制性酶切
[0058]
shrna表達載體pbasi-hu6圖譜如圖5所示
[0059]
按表2所示各組分配製60μl酶切反應體系,移液器吹打混勻後瞬離,置於pcr儀中37℃反應40min。酶切後的產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離,對目的條帶進行膠回收。
[0060]
表2 shrna表達質粒酶切體系
[0061]
成分體積(μl)ddh2o4210
×
fast digest buffer6pbasi-hu6(500ng/μl)6bamh
ꢀⅰ
3hind
ꢀⅲ
3total60
[0062]
(3)雙鏈dna合成
[0063]
將合成的單鏈dna使用oligo稀釋液溶解至終濃度為20μm,置於pcr儀中90℃加熱15min,加熱完成後冷卻至室溫,形成具有粘性末端的雙鏈dna,雙鏈dna與線性化載體兩端酶切位點相同。
[0064]
(4)雙鏈dna與載體連接
[0065]
使用t4 dna ligase v2將回收後的線性化載體與上述5種合成的雙鏈dna在25℃條件下連接1h,連接反應體系如表3所示。
[0066]
表3 t4連接反應體系
[0067]
成分體積(μl)線性化載體(100ng/μl)1雙鏈dna(100ng/μl)1t4 dna ligase buffer2t4 dna ligase v20.2ddh2o15.8total20
[0068]
(5)連接產物轉化
[0069]
取10μl連接產物加入到100μl商品化jm109大腸桿菌感受態細胞中,輕輕吹打混勻,冰浴5min,42℃熱擊45s,冰浴3min,隨後均勻塗布於amp抗生素lb平板上,37℃溫箱倒置培養12h。
[0070]
(5)陽性菌落鑑定
[0071]
無菌槍頭挑取平板上的單菌落並使用含有amp的lb培養基擴增,12h後將擴增後的
菌液進行測序驗證。
[0072]
(6)質粒抽提
[0073]
將測序正確的菌液接種至含有amp的15ml lb培養基中,37℃,220rpm擴增12h,使用無內毒素質粒小提試劑盒抽提質粒。步驟如下所述:
[0074]
1.收集擴增後的菌液於5ml離心管中,13000rpm離心2min;
[0075]
2.倒盡上清,加入250μl菌體重懸液並渦旋震蕩,徹底懸浮菌體沉澱;
[0076]
3.加入250μl裂解緩衝液,上下顛倒混勻4-6次,室溫靜置3min,使菌體充分裂解;
[0077]
4.加入250μl終止液,上下顛倒混勻8-10次,室溫靜置5min,使細菌基因組被沉澱充分包裹,13000rpm離心5min;
[0078]
5.取上清液至一新離心管內,加入225μl異丙醇,上下顛倒混勻;
[0079]
6.向已裝入收集管的吸附柱內加入200μl平衡液,13000rpm離心1min,棄收集管中液體;
[0080]
7.將步驟5中的混合液體加入吸附柱內,13000rpm離心1min,棄掉收集管中的廢液;
[0081]
8.向吸附柱內加入750μl漂洗液,13000rmp離心1min;倒掉收集管中的廢液;
[0082]
9.吸附柱及收集管離心13000rpm離心1min;
[0083]
10.將吸附柱置於新的無菌離心管中,加入50μl洗脫液,室溫靜置5min,13000rpm離心2min,收集液體並測定質粒純度,結果如圖4所示。
[0084]
實施例2shrna在體外細胞培養中抗病毒效果
[0085]
採用qrt-pcr方法檢測shrna對鴨外周血淋巴細胞中ducv複製的抑制作用。
[0086]
1.鴨外周血淋巴細胞分離
[0087]
選取10日齡雛鴨(qrt-pcr檢測鴨圓環病毒為陰性且無其他病原體感染)心臟採血並對外周血淋巴細胞進分離,操作如下:
[0088]
(1)對心臟無菌採血並收集於抗凝管中。按照1:1的比例將抗凝血與pbs均勻混合稀釋;
[0089]
(2)使用巴氏吸管將稀釋後的抗凝血平鋪至pbmc分離液上方,於水平離心機中3000rpm離心10min;
[0090]
(3)離心後,吸取淋巴細胞層液體並與細胞洗滌液輕輕混勻,1500rpm離心10min;
[0091]
(4)棄上清,加入含有10%fbs的rpmi1640重懸細胞,調整細胞密度為2
×
106cells/ml,均勻鋪於6孔板中培養。
[0092]
2.鴨外周血淋巴細胞的ducv體外感染及shrna電轉染
[0093]
(1)將製備的鴨圓環病毒液(利用菌種保藏編號為cgmcc no.19296毒株及其記載的培養方法獲得)稀釋至2
×
106copies/ml。將稀釋後的鴨圓環病毒液接種至6孔板中,每孔200μl,對照組加入200μl pbs,輕輕震蕩混勻後置於37℃,5%co2培養箱中培養12h,pbmc分組如下:
[0094]
a組為pbmc單獨感染+pbs對照組,
[0095]
b組為pbmc單獨感染+pbasi-hu6-shrna-rep-1治療組,
[0096]
c組為pbmc單獨感染+pbasi-hu6-shrna-rep-2治療組,
[0097]
d組為pbmc單獨感染+pbasi-hu6-shrna-cap-1治療組,
[0098]
e組為pbmc單獨感染+pbasi-hu6-shrna-cap-2治療組,
[0099]
f組為pbmc單獨感染+pbasi-hu6-shrna對照治療組。
[0100]
(2)收取上述細胞,1000g離心8min,棄上清,使用opti-mem洗滌細胞兩次並將細胞密度調整至2
×
107/ml。
[0101]
(3)電轉染:參數設置為200v,5ms,每組加入2μg對應質粒,輕柔混勻避免產生氣泡,電轉結束後立即向電轉杯中加入500μl完全培養基,輕柔吹打混勻後轉移至12孔細胞培養板中,於37℃含5%co2細胞培養箱中培養48h。
[0102]
(4)收取細胞並用dna提取試劑盒提取總dna,使用qrt-pcr技術檢測各組細胞中病毒拷貝數。
[0103]
結果:通過qrt-pcr實驗測定了轉染後48h各組shrna對pbmc中ducv增殖的抑制作用。如圖6所示,治療組的4種shrna對ducv在pbmc中的複製均有抑制作用,各組之間存在差異,其中以shrna-rep-1的抑制效果最為顯著(p《0.01),與pbs對照組相比病毒量降低30倍以上;shrna-cap-2效果次之。結果表明,shrna-rep-1和shrna-cap-2能夠顯著抑制ducv在pbmc中的複製。
[0104]
實施例3shrna重組質粒對實驗室飼養的鴨體內ducv的抑制作用
[0105]
採用qrt-pcr方法檢測shrna對鴨體內ducv複製的抑制作用
[0106]
實驗分組:
[0107]
選取實驗室孵化的1日齡櫻桃谷鴨60隻(qrt-pcr檢測鴨圓環病毒為陰性且無其他病原體感染),肌肉注射圓環病毒(菌種保藏編號為cgmcc no.19296,具體來源同實施例2)感染1日齡雛鴨,感染量不低於1
×
107copies。60隻感染雛鴨每組10隻,分為以下幾組:
[0108]
a組為ducv單獨感染+pbs對照組,
[0109]
b組為ducv單獨感染+pbasi-hu6-shrna-rep-1治療組,
[0110]
c組為ducv單獨感染+pbasi-hu6-shrna-rep-2治療組,
[0111]
d組為ducv單獨感染+pbasi-hu6-shrna-cap-1治療組,
[0112]
e組為ducv單獨感染+pbasi-hu6-shrna-cap-2治療組,
[0113]
f組為ducv單獨感染+pbasi-hu6-shrna對照治療組。
[0114]
共6組,各實驗組日齡及飼養方式均相同。14日齡時採用肌肉注射法,除a組外,其餘各組均注射含有20μg(溶於500μlpbs)對應重組質粒的pbs進行治療。
[0115]
dna提取及病毒載量qrt-pcr檢測:
[0116]
注射shrna重組質粒48h、72h和96h後每組隨機抽取3隻鴨進行剖殺,取肝臟並用dna提取試劑盒提取總dna,使用qrt-pcr技術檢測各組肝組織中病毒拷貝數。
[0117]
結果:通過qrt-pcr測定各組在shrna治療48h、72h、96後肝臟病毒載量的變化。如圖7所示,使用shrna治療後,四個治療組在48h即可表現出明顯的對ducv複製的抑制作用,且在注射96h仍保持良好的抑制效果,其中以shrna-rep-1治療組在各時間段最為顯著(p《0.01),抑制倍數約100倍;shrna-cap-2的抑制效果略低。這些結果說明shrna-rep-1和shrna-cap-2在臨床上治療ducv感染中具有顯著的抑制病毒複製的效果。
[0118]
實施例4 shrna在臨床治療中的效果
[0119]
選擇60隻孵化場孵化的1日齡健康雛鴨於一小型養殖場隔離飼養,同時人工肌肉注射感染鴨圓環病毒(菌種保藏編號為cgmcc no.19296,具體來源同實施例2),感染量不低
於1
×
107copies,飼養方式與大群同等飼養。5日齡時通過採血並用pcr技術確定感染陽性,隨機分為a、b、c 3個組,每組20隻,隔離飼養。10日齡時,a組注射生理鹽水1.0ml+pbasi-hu6-shrna-rep-1 20μg,b組注射生理鹽水1.0ml,c組注射生理鹽水+pbasi-hu6-shrna-對照20μg。觀察14d,記錄每組鴨的病情和死亡情況,然後剖殺並用pcr技術檢測肝臟中病毒的陽性率。
[0120]
結果:a組注射2d後,患病雛鴨的採食量開始增加,精神狀態明顯好轉,14d內未有雛鴨死亡。14d後將鴨撲殺並解剖,大部分鴨剖檢病變輕微或無症狀,用pcr技術檢測肝臟中鴨圓環病毒的陽性率6/20。b組注射後,患病鴨的採食量和精神狀態未有顯著好轉,從注射後第2日開始有患病鴨死亡,14d內患病鴨的死亡率為30%。觀察期到14d將存活的鴨撲殺,發現大部分鴨有肝臟發黃、局部腫大、有出血點等症狀,用pcr技術檢測肝臟(包括死亡鴨凍存的肝臟)中鴨圓環病毒的陽性率20/20。c組注射後,患病鴨的採食量和精神狀態未有顯著好轉,從注射後第2日開始有患病鴨死亡,14d內患病鴨的死亡率為35%。觀察期到14d將存活的鴨撲殺,大部分病鴨有肝臟發黃、局部腫大、有出血點等症狀,用pcr技術檢測肝臟(包括死亡鴨凍存的肝臟)中鴨圓環病毒的陽性率20/20。結果表明,注射pbasi-hu6-shrna-rep-1能夠顯著減輕臨床症狀,並降低鴨圓環病毒的陽性率。
[0121]
分組pcr陽性率死亡率a30%0%b100%30%c100%35%
[0122]
實施例5抗鴨圓環病毒卵黃抗體的製作
[0123]
(1)用實驗室製備的鴨圓環病毒組織滅活苗(菌種保藏編號為cgmccno.19296,具體來源同實施例2)分4次對開產前1個月的蛋雞進行免疫,接種劑量為1.5ml/只,每次免疫間隔2周。
[0124]
鴨圓環病毒組織滅活苗製備方法如下:鴨圓環病毒抗原是通過將病毒腹腔注射感染1日齡雛鴨,此後每隔7天用靜脈注射方式加強感染一次,每次感染病毒量不低於1
×
107copies,於25日齡採集感染鴨整個肝臟組織,通過螢光定量pcr技術檢測肝臟中的病毒含量≥1
×
108copies/g,即可作為原始抗原組織。抗原組織添加5倍水後勻漿製備成組織抗原液。抗原液添加3

濃度甲醛於37℃滅活48h,然後添加10%甘油混勻,製作組織滅活苗。
[0125]
(2)第4次免疫後兩周開始收集免疫蛋,持續收蛋過程中保持每隔1-2個月免疫一次;用蛋黃分離器將卵黃與蛋清分離,卵黃與預熱到35℃的純淨水按體積3.5:1稀釋蛋黃液,攪拌均勻後得到卵黃稀釋液,於35℃條件下預溫1h。
[0126]
(3)向蛋黃稀釋液中加入終濃度為3.5%的peg6000,與蛋黃混合後充分攪拌均勻,靜置4h,充分反應。
[0127]
(4)將反應後的上清液抽出,先用100目,再用200目濾網過濾。
[0128]
(5)將過濾的上清液裝入無菌桶進行二次沉澱,沉澱時間為48h。
[0129]
(6)將二次沉澱的上清液抽出,先用200目濾網粗濾一遍,然後用0.22μm濾膜過濾除菌。
[0130]
(7)除菌後的上清中加入一定量的防腐劑或千分之一濃度的甲醛,即精製卵黃抗體。
[0131]
(8)瓊脂擴散試驗檢測抗鴨圓環病毒和腺病毒抗體的瓊擴試驗效價≥1:64。
[0132]
(9)分裝貯存。在無菌條件下將濾液分裝於無菌疫苗瓶中,蓋好膠塞,軋鋁蓋,貼上標籤,保存備用,保存溫度為4-8℃。
[0133]
(10)卵黃抗體的質量檢驗
[0134]

安全性檢驗
[0135]
用1日齡健康櫻桃谷雛鴨20隻,肌肉多點注射本發明實施例4製備的卵黃抗體2.0ml,觀察14日,易感雛鴨全部健康存活,說明本發明的卵黃抗體的安全性好。
[0136]

無菌檢驗
[0137]
按照《中華人民共和國獸藥典》(2015版)執行,結果本發明的卵黃抗體無細菌、支原體和外源病毒汙染。
[0138]

病毒中和效力檢驗
[0139]
1日齡健康櫻桃谷雛鴨40隻(血清檢查為鴨圓環病毒抗原、抗體陰性),隨機分為a、b 2個組,每組20隻。a組用0.5ml實施例4製備的卵黃抗體與含鴨圓環病毒的肝臟勻漿上清液0.5ml(》1
×
107copies)混合,4℃冰箱中作用4h;b組為對照組,0.5ml生理鹽水與含鴨圓環病毒的肝臟勻漿上清液0.5ml(》1
×
107copies)混合,4℃冰箱中作用4h。將兩種處理液分別肌肉注射20隻雛鴨。攻毒後3d,剖殺10隻,採集肝臟用pcr技術檢測病毒陽性情況,剩餘10隻觀察到14日齡,記錄臨床症狀,然後剖殺檢測病毒陽性情況。
[0140]
結果顯示,卵黃抗體組(a組)所有20隻鴨肝臟中鴨圓環病毒全部為陰性,對照組(b組)所有20隻鴨圓環病毒全部為陽性。此外,a組在觀察期內無任何臨床症狀,b組部分鴨表現為精神沉鬱、食慾不佳、不願走動等症狀。結果表明,該卵黃抗體有效,可中和病毒感染。
[0141]
實施例6shrna和卵黃抗體合用在臨床治療中的效果
[0142]
選擇60隻1日齡健康雛鴨並人工感染鴨圓環病毒,5日齡時通過採血並用pcr技術確定感染陽性,隨機分為a、b、c 3個組,每組20隻,隔離飼養。10日齡時,a組注射實施例5製備的卵黃抗體2.0ml+pbasi-hu6-shrna-rep-1 20μg,b組注射卵黃抗體2.0ml,c組注射生理鹽水2.0ml。觀察14d,記錄每組鴨的病情和死亡情況,然後剖殺並用pcr技術檢測肝臟中病毒的陽性率。
[0143]
結果:a組注射2d後,患病雛鴨的採食量開始增加,精神狀態明顯好轉,治療後14d內未有雛鴨死亡。治療14d後將鴨撲殺並解剖,大部分鴨剖檢病變輕微或無症狀,用pcr技術檢測肝臟中鴨圓環病毒的陽性率2/20。b組注射2d後,患病雛鴨的採食量也開始增加,精神狀態明顯好轉,治療14d內有1隻雛鴨死亡。治療14d後將鴨撲殺並解剖,大部分鴨剖檢病變輕微或無症狀,用pcr技術檢測肝臟中鴨圓環病毒的陽性率5/20。c組注射後,,患病鴨的採食量和精神狀態未有顯著好轉,從注射後第2日開始有患病鴨死亡,治療14d內患病鴨的死亡率為25%。觀察期到治療14d時將存活的鴨的撲殺,發現大部分鴨有肝臟發黃、局部腫大、有出血點等症狀,用pcr技術檢測肝臟(包括死亡鴨凍存的肝臟)中鴨圓環病毒的陽性率20/20。
[0144]
以上試驗結果表明,本發明的shrna-rep-1與卵黃抗體合用安全性好、預防效果好、治癒率高,20μg shrna和卵黃抗體合用效果明顯優於單獨卵黃抗體治療,可以用於鴨圓環病毒感染的預防和治療,具有重大的經濟和社會效益。

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