微小rna及其用途的製作方法

2024-04-01 08:19:05

專利名稱：微小rna及其用途的製作方法
技術領域：
本發明總的來說涉及微小RNA分子以及與其關聯或從其衍生的各種核酸分子。
背景技術：
微小RNA(miRNA)是參與基因調節的大約22個核苷酸的短RNA寡核苷酸。微小RNAs通過靶向mRNA以進行切割或翻譯抑制來調節基因表達。儘管miRNAs存在於廣泛的物種，包括秀麗隱杆線蟲(C. elegans)、果蜆(Drosophila)和人中，但只是最近才對其進行了鑑定。更重的是，miRNA在疾病的發展和進展中的作用直至最近才開始得到認識。由於其較小的大小的原因，一直以來，使用標準的方法學難以鑑定miRNAs。通過提取大量的RNA已鑑定了有限數目的miRNA。也已鑑定了對展示可通過視覺辨別的表型作出貢獻的miRNA。表達陣列數據顯示miRNA在不同發育階段或不同的組織中表達。miRNA在某些組織中或有限的發育階段上的限定表明迄今為止鑑定的miRNAs很可能只是總miRNA的小部分。近年來已發展了用於鑑定基因組中剩餘的miRNA的計算機方法。工具例如MiRscan和MiRseeker已鑑定了後來通過實驗確認的miRNA。基於這些計算機工具，已估計人基因組包含200-255個miRNA基因。然而，這些估計基於這樣的假設，即剩下待鑑定的miRNA具有和已鑑定的miRNA相同的性質。基於miRNA在哺乳動物生物學和疾病中的基本重要性，本領域需要鑑定未知的miRNA。本發明滿足了該需要並提供了相當大數目的miRNA和其用途。

發明內容
本發明涉及包含pr1-miRNA、pre-miRNA> miRNA、miRNA *、抗-miRNA 或 miRNA 結合位點、或其變體的序列的分離的核酸。所述核酸可包含表I中涉及的髮夾結構的序列、表10的序列標誌符(identifiers) 6757248-6894882的序列、表17的序列標誌符1-6318或18728-18960的序列、表I中涉及的miRNA的序列、表10的序列標誌符1-117750或6894883-10068177的序列、表17的序列標誌符6319-18727或18961-19401的序列、表4中涉及的靶基因結合位點的序列、表10的序列標誌符117751-6757247的序列、其互補物、或包含和其具有至少60%同一性的至少12個鄰接的核苷酸的序列。所述分離的核酸在長度上可以是5至250個核苷酸。本發明也涉及包含所述核酸的探針。探針可包含和表2中稱為在前列腺癌或肺癌中差異表達的miRNA互補的至少8至22個鄰接 的核苷酸。本發明也涉及多種探針。所述多種探針可包含和表2中稱為在前列腺癌中差異表達的各miRNA互補的至少一種探針。所述多種探針也可包含和表2中稱為在肺癌中差異表達的各miRNA互補的至少一種探針。本發明也涉及包含探針或多種探針的組合物。本發明也涉及包含固體基質的生物晶片，所述基質包含多種探針。將所述探針的每一種在空間確定的地址上附著至基質上。生物晶片可包含和表2中稱為在前列腺癌中差異表達的miRNA互補的探針。生物晶片也可包含和表2中稱為在肺癌中差異表達的miRNA互補的探針。本發明也涉及檢測疾病關聯的miRNA的差異表達的方法。可提供生物學樣品並測量與下述序列具有至少70%同一性的核酸的水平，所述序列是表I中涉及的miRNA的序列、表10的序列標誌符1-117750或6894883-10068177的序列、表17的序列標誌符6319-18727或18961-19401的序列、或其變體。和對照相比，核酸水平上的差異指示差異表達。本發明也涉及鑑定調節病理學狀況的化合物的方法。可提供能夠表達和下述序列具有至少70%的同一性的核酸的細胞，所述序列是表I中涉及的miRNA的序列、表10的序列標誌符1-117750或6894883-10068177的序列、表17的序列標誌符6319-18727或18961-19401的序列、或其變體。可將所述細胞和候選調節劑接觸，然後測量所述核酸的表達水平。和對照相比，核酸水平上的差異鑑定該化合物為和該核酸關聯的病理學狀況的調節劑。本發明也涉及抑制靶基因在細胞中表達的方法。可以以足以抑制靶基因表達的量向細胞中導入核酸。靶基因可包含基本上和表4中涉及的結合位點相同的結合位點、表10的序列標誌符117751-6757247的序列、或其變體。核酸可包SEQ ID NOS 1-760616的序列、表10的序列標誌符1-117750和6757248-10068177的序列、表17所示的序列、或其變體。可在體外或體內抑制靶基因的表達。

本發明也涉及在細胞中增加靶基因的表達的方法。可以以足以增加靶基因表達的量向細胞中導入核酸。靶基因可包含基本上和表4中涉及的結合位點相同的結合位點、表10的序列標誌符117751-6757247的序列、或其變體。核酸可包含和SEQ ID NOS :1_760616、表10的序列標誌符1-117750和6757248-10068177的序列、表17所示的序列、或其變體基本上互補的序列。可在體外或體內抑制靶基因的表達。可在體外或體內增加靶基因的表達。本發明也涉及治療患有表6中所示的病症的患者的方法,其包括給需要其的患者施用這樣的核酸，所述核酸包含SEQ ID NOS 1-760616的序列、表10所示的序列、表17所示的序列或其變體。


圖1展示miRNA的成熟化的模型。圖2顯示19ql3. 42上的MC19聚簇(cluster)的示意說明。小圖A顯示第19號染色體的大約500, OOObp的區域，從58，580，001至59，080，000 (根據2004年5月USCS的裝配)，其中該聚簇所處位置包括相鄰的編碼蛋白的基因。用矩形表示MC19-1聚簇。用線表示Mir-371、mir-372和mir-373。用大箭頭表示側翼連接該聚簇的編碼蛋白的基因。小圖B顯示MC19-lmiRNA聚簇的詳細結構。顯示了大約 102，OOObp的區域，從58，860，001至58，962，000 (根據2004年5月USCS的裝配)。用黑色條表示miRNA前體。應當注意所有miRNA都處於從左至右的相同方向。圍繞miRNA前體的陰影區域表示其中內嵌前體的重複單位。也顯示了 mir-371、mir-372和mir-373的位置。圖3是在大約690nt的不同大小上的35個人重複單位(A)和26個黑猩猩重複單位(B)的多重序列比對的圖解表示。該圖表是通過在使用平均IOnt的滑動窗口(slidingwindow)的比對中計算各位置的相似性評分(最大評分-1，最小評分-O)產生的。通過ClustalW程序來比對重複單位序列。為所得比對的各位置賦予表示在該位置上的相似性程度的評分。包含miRNA前體的區域以豎線劃界。用豎線標示從前體的5』莖(5p)和3』莖(3p)產生的成熟miRNA的確切位置。圖4顯示MC19-1聚簇的43個A型pre-miRNA的序列比對。小圖A顯示使用框標示成熟miRNA位置的多重序列比對。底部顯示共有序列。如下用顏色標示保守核苷酸黑色100%、深灰色80%至99%和淺灰色(clear grey) 60%至79%。小圖B顯示共有成熟A型miRNA和mir-371、mir-372、miR-373的上遊人聚簇的序列比對。小圖C顯示共有成熟A型miRNA和hsa-mir-371-373小鼠直向同源聚簇的比對。圖5顯示MC19-lmiRNA的表達分析。小圖A顯示2個選擇的A型miRNA的RNA印跡分析。使用來自人腦(B)、肝臟(L)、胸腺⑴、胎盤⑵和HeLa細胞⑶的總RNA分析表達。mir-98的表達和tRNA條帶的溴化乙錠染色用作對照。小圖B顯示包含A型miRNA前體的mRNA轉錄物的RT-PCR分析。使用寡脫氧胸苷進行5 來自胎盤的總RNA的逆轉錄。之後使用指定的引物(由水平箭標標示的)進行PCR。所檢查的區域在上方進行了說明。垂直黑色條表示pre-miRNA ;圍繞pre-miRNA的陰影區域表示重複單位；在右側標示4個EST的位置；用豎箭標標示聚腺苷酸(poly-A)位點，如在EST中發現的和位於AATAAA共有序列下遊的位點。在聚簇區說明下方顯示使用3個引物組合預期從RT-PCR獲得的片段。在預期的片段下方顯示了 RT-PCR分析的結果。小圖C顯示FR2片段的測序策略。將該片段克隆入pTZ57R\T載體並使用外部(external)和內部(internal)引物進行測序。
具體實施例方式本發明提供了 mi RNA、其前體、其靶和相關序列的核苷酸序列。這些核酸用於診斷目的，且也用於修飾靶基因表達。通過下列本發明的描述，本發明的其他方面對於本領域技術人員而言將變得很明了。1.定義在公開和描述本化合物、產品和組合物以及方法之前，要理解此處所用的術語學只是用於描述特定實施方案的，而不是用於限定的。必須指出，如說明書和所附的權利要求中所用的，單數形式「一個(a)」、「一個(an)」和「該(the) 」，除非上下文另外清楚地指出，包括複數指示物(plural referent)。a.動物此處所用的「動物」可以指魚、兩棲動物、爬行動物、鳥和哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、貓、狗、母牛、猿和人。b.附著的如此處所用的「附著的」或「固定的」，當指探針和固體支持物時，可表示探針和固體支持物之間的結合在結合、洗滌、分析和除去(removal)的條件下足以保持穩定。結合可以是共價的或非共價的。可在探針和固體支持物之間直接形成共價鍵，或可通過交聯劑或將特異性的反應性基團包括在固體支持物或探針上或包括在兩個分子上來形成共價鍵。非共價結合可以是靜電、親水和疏水相互作用中的一種或多種。非共價結合包括分子例如鏈黴抗生物素蛋白至支持物的共價附著和生物素化的探針至鏈黴抗生物素蛋白的非共價結合。固定化也包括共價和非共價相互作用的組合。c.生物學樣品此處所用的「生物學樣品」可指包含核酸的生物學組織或流體樣品。這些樣品包括，但不限於，從動物分離的組織。生物學樣品也可包括組織的切片，例如活組織檢查和屍體解剖樣品、採集的用於組織學目的的冷凍切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、眼淚、粘液、毛髮和皮膚。生物學樣品也包括外植塊和來自患者組織的原代和/或轉化的細胞培養物。可通過從動物取出細胞樣品來提供生物學樣品，但也可通過使用以前分離的細胞(例如，由另一個人在另一個時間分離的，和/或用於另一種目的的)、或通過在體內進行本發明的方法來獲得生物學樣品。也可使用檔案組織(archival tissue)，例如具有治療或結果歷史的組織。d.互補 此處所用的「互補」或「互補的」可指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的Watson-Crick 或 Hoogsteen 喊基配對。e.差異表達「差異表達」可以指細胞和組織之內和之間在時間和/或細胞基因表達模式上的定性或定量差異。因此，差異表達的基因可定性地使其表達被改變，包括在例如正常組織對疾病組織中的激活或失活。相對於另一種狀態，基因可在特定狀態下打開或關閉，從而允許兩種或更多種狀態的比較。受定性調節的基因在狀態或細胞類型中展現可通過標準技術檢測的表達模式。一些基因將在一種狀態或細胞類型中表達，但不在兩種情況下都表達。可選擇地，表達上的差異在例如調節表達這一點上是定量的，所述調節為上調，從而導致增加的轉錄物的量，或者下調，從而導致減少的轉錄物的量。表達相異的程度只需要大到足以通過標準的表徵技術，例如表達陣列(expression arrays)、定量逆轉錄酶PCR、RNA印跡分析和RNA酶保護進行定量即可。f.基因此處所用的「基因」可以是包含轉錄和/或翻譯調節序列和/或編碼區和/或非翻譯序列(例如，內含子、5'-和3'-非翻譯序列)的基因組基因。基因的編碼區可以是編碼胺基酸序列或功能性RNA (例如tRNA、rRNA、催化性RNA、siRNA、miRNA和反義RNA)的核苷酸序列。基因也可以是對應於編碼區(例如，外顯子和miRNA)、任選地包含連接至其上的5』 -或3』 -非翻譯序列的mRNA或cDNA。基因也可以是在體外產生的經修飾的核酸分子，該核酸分子包含所有或部分編碼區和/或連接至其上的5』 -或3』 -非翻譯序列。g.宿主細胞此處所用的「宿主細胞」可以是天然發生的細胞或包含載體和支持所述載體複製的轉化的細胞。宿主細胞可以是培養的細胞、外植塊、體內細胞等。宿主細胞可以是原核細胞例如大腸桿菌(E. coli)，或真核細胞，例如酵母、昆蟲、兩棲動物或哺乳動物細胞，例如CHO、HeLa。h.同一性
此處在兩個或更多個核酸或多肽序列的上下文中所用的「同一的」或「同一性」可以指在特定區域上具有特定百分比的相同的核苷酸或胺基酸的序列。通過如下方法來計算百分比，比較最優比對的兩個序列，在特定區域上比較兩個序列，確定在兩個序列上都出現相同殘基的位置的數目以產生匹配的位置的數目，用匹配的位置數目除以特定區域內總的位置數目，且將所得結果乘以100，以產生序列同一性的百分比。在兩個序列長度不同或比對產生交錯的末端和比較的特定區域只有單一序列的情況下，將單一序列的殘基包含在計算的分母中而不是分子中。當比較DNA和RNA時，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)被認為是等同的。可人工地或通過使用計算機序列算法例如BLAST或BLAST 2. O來計算同一性。1.標記此處所用的「標記」可以指可通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學、化學或其他物理學手段檢測的組合物。例如，有用的標記包括32P、螢光染料、電子密試劑、酶(例如，如在ELISA中普遍使用的酶)、生物素、洋地黃毒苷或半抗原和其他可被檢測的實體。可在任何位置將標記整合入核酸和蛋白。j.核酸此處所用的「核酸」或「寡核苷酸」或「多核苷酸」可以指至少兩個共價連接在一起的核苷酸。如本領域技術人員所理解的，單鏈的描述也確定了互補鏈的序列。因此，核酸也包括被描述的單鏈的互補鏈。也如本領域技術人員所理解的，核酸的許多變體可和給定的核酸一樣用於相同的目的。因此，核酸也包括其基本上相同的核酸和互補物。如本領域技術人員所認識到的，單鏈提供了可在嚴格雜交條件下和靶序列雜交的探針。因此，核酸也包含在嚴格雜交條件下雜交的探針。核酸可以是單鏈的或雙鏈的，或可包含雙鏈和單鏈序列的部分。核酸可以是DNA，即基因組DNA和cDNA兩者，RNA或雜交物，其中核酸可包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以及鹼基的組合，所述鹼基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、次黃苷、黃嘌呤次黃嘌呤、異胞卩密唳(isocytosine)和異鳥嘌呤。可通過化學合成的方法或通過重組方法獲得核酸。 核酸一般包含磷酸二酯鍵，儘管可包括這樣的核酸類似物，該類似物可具有至少一個不同的鍵，例如，氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亞磷醯胺鍵以及肽核酸主鏈和鍵。其他類似物核酸包括具有正主鏈、非離子主鏈和非核糖主鏈的那些，包括美國專利號5，235，033和5，034，506 (其在此引用作為參考)中描述的類似物核酸。核酸的一個定義也包括包含一個或多個非天然發生的或經修飾的核苷酸的核酸。經修飾的核苷酸類似物也可位於例如核酸分子的5』 -末端和/或3』 -末端。核苷酸類似物的代表性實例可選自糖或主鏈經修飾的核糖核苷酸。然而，應當指出，核鹼基(nucleobase)經修飾的核糖核苷酸，即這樣的核糖核苷酸也是合適的，該核糖核苷酸包含非天然發生的而不是天然發生的核鹼基，例如在5位置上經修飾的尿苷或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位置上經修飾的腺苷和鳥苷，例如8-溴鳥苷；脫氮核苷酸，例如7-脫氮-腺苷；O-和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷。2' -OH基可被選自H、OR、H SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基團取代，其中R是C1-C6的烷基、鏈烯基或炔基，且齒是F、Cl、Br或I。可因各種原因進行核糖磷酸主鏈的修飾，例如為了在生理學環境中增加這些分子的穩定性和半衰期或為了用作生物晶片上的探針。可製備天然發生的核酸和類似物的混合物；可選擇地，可製備不同核酸類似物的混合物和天然發生的核酸和類似物的混合物。k.可操作地連接此處所用的「可操作地連接」可以指基因的表達在空間上與其連接的啟動子的控制之下。啟動子可位於在其控制之下的基因的5』(上遊)或3'(下遊)。啟動子和基因之間的距離可以和在該啟動子來源的基因中該啟動子與其控制的基因之間的距離大致相同。如在本領域中已知的，可調節該距離中的變化而不喪失啟動子的功能。1.探針此處所用的「探針」可以指這樣的寡核苷酸，該寡核苷酸能夠通過一種或多種類型的化學鍵，通常通過互補鹼基配對，通常通過氫鍵的形成來結合互補序列的靶核酸。依賴於雜交條件的嚴格度，探針可以結合不完全和該探針序列互補的靶序列。可存在任何數目的鹼基對錯配，該鹼基對錯配幹擾靶序列和本發明的單鏈核酸之間的雜交。然而，如果突變的數目這樣大以致於即使在雜交條件的最低嚴格度下也不能發生雜交，那麼所述序列不是互補的靶序列。探針可以是單鏈的或部分單鏈和部分雙鏈的。靶序列的結構、組成和性質決定探針的鏈型(strandedness)。可直接標記探針或間接標記探針,例如用鏈黴抗生物素蛋白複合物可隨後結合的生物素標記探針。m.啟動子此處所用的「啟動子」可以指能夠在細胞中賦予、激活或增強核酸表達的合成的或天然衍生的分子。啟動子可包含一個或多個進一步增強表達和/或改變相同基因的空間表達和/或時間表達的特異性調節元件。啟動子也可包含遠端增強子或阻抑物元件，其可位於離轉錄的起始位點多達幾千鹼基對的位置。啟動子可來源於這樣的來源，該來源包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲和 動物。啟動子可組成型地調節基因組分的表達，或關於在其中發生表達的細胞、組織或器官，或關於在其中發生表達的發育階段，或在響應外界刺激，例如生理應激、病原體、金屬離子或誘導劑中差異地調節基因組分的表達。啟動子的代表性實例包括噬菌體T7啟動子、噬菌體T3啟動子、SP6啟動子、Iac操縱基因-啟動子、tac啟動子、SV40晚期啟動子、SV40早期啟動子、RSV-LTR啟動子、CMV IE啟動子、SV40早期啟動子或SV40晚期啟動子及CMV IE啟動子。η.選擇標記此處所用的「選擇標記」可以指任何這樣的基因，該基因為這樣的細胞賦予表型，在該細胞中，表達該基因以幫助鑑定和/或選擇用基因構建體轉染或轉化的細胞。選擇標記的代表性實例包括氨苄青黴素抗性基因(Amp1O、四環素抗性基因(IV)、細菌卡那黴素抗性基因(Kanlr)、zeocin抗性基因、賦予對抗生素aureobasidin A的抗性的AUR1-C基因、膦絲菌素抗性基因、新黴素磷酸轉移酶基因(nptll)、潮黴素抗性基因、β_葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因、氯黴素乙醯轉移酶(CAT)基因、編碼綠色螢光蛋白的基因和螢光素酶基因。ο.嚴格雜交條件此處所用的「嚴格雜交條件」可指這樣的條件，在該條件下，在例如核酸的複雜混合物中，第一核酸序列(例如，探針)可和第二核酸序列(例如，靶)雜交，但不和其他序列雜交。嚴格條件是序列依賴性的，且在不同的環境中是不同的。一般地，選擇嚴格條件，使其比在確定的離子強度PH下的特定序列的熱解鏈溫度(Tm)低大約5-10°C。^可以是這樣的溫度(在確定的離子強度、PH和核酸濃度下)，在該溫度下，50%的和靶互補的探針在平衡狀態和靶序列雜交(因為靶序列過量存在，所以在Tni下，50%的探針在平衡狀態被佔據)。嚴格條件可以是這樣的條件，在該條件中，在PH7. O至8. 3下，鹽濃度低於大約1. OM鈉離子，通常為大約O. 01-1. OM鈉離子濃度(或其他鹽)，且對於短探針(例如，大約10至50個核苷酸)溫度為至少大約30°C，對於長探針(例如，多於大約50個核苷酸)溫度為至少大約60°C。也可通過加入去穩定劑例如甲醯胺來獲得嚴格條件。對於選擇性或特異性雜交，陽性信號可以是背景雜交的至少2至10倍。示例性嚴格雜交條件包括下列50%甲醯胺、5xSSC、和 1% SDS，在 42°C下溫育，或 5xSSC、l% SDS，在 65°C下溫育，在 65°C下在 O. 2xSSCJP O. 1% SDS 中洗滌。p.基本上互補此處所用的「基本上互補」可以指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多個核苷酸的區域上，第一序列和第二序列的互補物具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99% 的同一性，或兩個序列在嚴格雜交條件下雜交。q.基本上同一此處所用的「基本上同一」可以指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50或更多個核苷酸或胺基酸的區域上，第一序列和第二序列具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或 99% 的同一性，或者對於核酸，如果第一序列和第二序列的互補物基本上互補的話。r.革巴此處所用的「靶」可指在嚴格雜交條件下可被一個或多個探針結合的多核苷酸。s.終止子

此處所用的「終止子」可指位於轉錄單位末端、提供轉錄終止的信號的序列。終止子可以是包含多腺苷酸化信號的3』 -非翻譯DNA序列，該序列可幫助多腺苷酸序列加至初級轉錄物的3』 -末端。終止子可來自這樣的來源，該來源包括病毒、細菌、真菌、植物、昆蟲和動物。終止子的代表性實例包括SV40多腺苷酸化信號、HSV TK多腺苷酸化信號、CYCl終止子、ADH終止子、SPA終止子、根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefacien)的胭脂鹼合酶(NOS)基因終止子、花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S基因的終止子、來自玉蜀黍(Zea mays)的玉米醇溶蛋白基因終止子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的小亞基基因(SSU)的基因終止子序列、subclover stunt virus (SCSV)基因序列的終止子、不依賴於P的大腸桿菌終止子和IacZa終止子。t.載體此處所用的「載體」可指包含複製起始位點的核酸序列。載體可以是質粒、噬菌體、細菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RNA載體。載體可以是自我複製的染色體外載體或整合入宿主基因組的載體。2.微小 RNA不受理論束縛，圖1顯示哺乳動物miRNA的成熟化的目前的模型。可轉錄編碼miRNA的基因，從而導致稱為pr1-miRNA的miRNA前體的產生。pri_miRNA可以是包含多個pr1-miRNA的多順反子RNA的部分。pr1-miRNA可形成具有莖和環的髮夾結構。如圖1中所示，莖可包含錯配的鹼基。
pr1-miRNA的髮夾結構可被Drosha識別,其是RNA酶III內切核酸酶。Drosha可識另Ij pr1-miRNA的末端環和大致向莖內切割兩個螺旋轉角，以產生60_70nt的稱為pre-miRNA的前體。Drosha可切割pr1-miRNA，具有RNA酶III內切核酸酶的典型交錯切口，以產生具有5'磷酸和大約2個核苷酸的3'突出端的pre-miRNA莖環。大約一個延伸超過Drosha切割位點的莖的螺旋轉角(大約10個核苷酸)可能是有效加工所必需的。然後通過Ran-GTP和輸出受體(export receptor)Ex-portin-5可將pre-miRNA從細胞核主動轉運至胞質。Dicer,也是 RNA 酶 III 內切核酸酶，可識別 pre-miRNA。Dicer 可識別 pre-miRNA的雙鏈莖。Dicer也可識別莖環基部的5』磷酸和3』突出端。Dicer可在距離莖環基部兩個螺旋轉角處切除末端環，從而留下另外的5'磷酸和大約2個核苷酸的3』突出端。所得的可包含錯配的siRNA樣雙鏈體包含成熟的miRNA和稱為miRNA ★的相似大小的片段。miRNA和miRNA *可從pr1-miRNA和pre-miRNA的相反的臂衍生。可在克隆的miRNA的文庫中發現miRNA *序列,但其頻率一般低於miRNA。儘管最初以和miRNA *的雙鏈種類出現，但miRNA最終可以以單鏈RNA的形式整合入被稱為RNA誘導的沉默複合物(RISC)的核糖核蛋白複合體。各種蛋白可形成RISC，這可導致對於miRNA/miRNA *雙鏈體的特異性、靶基因的結合位點、miRNA的活性(抑制或激活)、miRNA/miRNA ±雙鏈體中的哪條鏈被裝載入RISC產生變化。當將miRNA :miRNA *雙鏈體的miRNA鏈裝載入RISC中時，可除去並降解miRNA*。被裝載入RISC中的miRNA miRNA *雙鏈體的鏈可以是其5』末端沒有緊密配對的鏈。在miRNA miRNA *的兩個末端都具有大致相等的5』配對的情況下，miRNA和miRNA *都可具有沉默基因的活性。RISC可基於miRNA和mRNA之間的高水平的互補性，特別是通過miRNA的核苷酸2-8，來鑑定靶核酸。只有一個例子已在動物中進行了報導，在該例子中，miRNA和其靶之間的相互作用沿著miRNA的整個長度。在mir-196和Hox B8中顯示了該情況，且還顯示mir-196 介導 Hox B8 mRNA 的切割(Yekta 等人 2004, Science 304-594)。在其他方面，已知這些相互作用只存在於植物中(Bartel & Bartel 2003，Plant Physiol 132-709)。許多研究已考察了為獲得足夠的翻譯抑制，miRNA和其mRNA靶之間的鹼基配對要求(Bartel 2004, Cell 116-281的綜述)。在哺乳動物細胞中，miRNA的前8個核苷酸可能是重要的(Doench & Sharp 2004GenesDev 2004-504)。然而，微小RNA的其他部分也可參與mRNA結合。此外,在3'處的充分的鹼基配對可補償在5』處的不充分配對(Brennecke等人，2005 PLoS 3-e85)。在整個基因組上分析miRNA結合的計算研究已提示miRNA的5』的鹼基2-7在靶結合中的特殊作用，但也承認通常被發現為「A」的第I個核苷酸的作用(Lewis 等人 2005 Celll20_15)。類似地，Krek 等人(2005, Nat Genet 37-495)使用核苷酸1-7或2-8鑑定和驗證靶。mRNA中的靶位點可以在Y UTR^i UTR或在編碼區中。有趣地，多種miRNA可通過識別相同的或多個位點來調節相同的mRNA靶。在絕大部分遺傳鑑定的靶中存在多個miRNA互補性位點可表明，多個RISC的協同作用提供了最有效的翻譯抑制作用。miRNA可通過兩種機制mRNA切割或翻譯抑制中的任一種機制指導RISC下調基因表達。如果mRNA和miRNA具有某種程度的互補性，那麼該miRNA可特異性地切割該mRNA。當miRNA指導切割時，切口可在和miRNA的殘基10和11配對的核苷酸之間。可選擇地，如果miRNA不具有所要求的程度的和miRNA的互補性,那麼miRNA可抑制翻譯。翻譯抑制在動物中可能更普遍，因為動物可具有更低程度的互補性。應當指出，在任一對miRNA和miRNA *的Y和:V末端中可存在可變性。該可變性可能是由於Drosha和Dicer針對切割位點的酶促加工中存在的可變性造成的。miRNA和miRNA *的5'和3'末端的可變性也可以是由於pr1-miRNA和pre-miRNA的莖結構中的錯配造成的。莖鏈的錯配可導致許多不同的髮夾結構。莖結構中的可變性也可導致通過Drosha和Dicer切割產生的產物中的可變性。3.核酸本發明涉及分離的核酸，所述分離的核酸包含SEQ ID NOS =1-760616中涉及的核苷酸序列、表10中所示的序列和表17中所示的序列、或其變體。變體可以是參照的核苷酸序列的互補物。變體也可以是基本上與參照核苷酸序列或其互補物同一的核苷酸序列。變體也可以是在嚴格條件下和參照核苷酸序列、其互補物或基本上和其同一的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。核酸可具有10至100個核苷酸的長度。核酸可具有至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80 或 90 個核苷
酸的長度。可合成核酸或使用下面描述的合成的基因在細胞中(在體外或體內)表達核酸。可以以單鏈分子的形式合成核酸並將其和基本上互補的核酸雜交以形成雙鏈體，該雙鏈體被當作本發明的核酸。可以以單鏈或雙鏈的形式將核酸導入細胞、組織或器官，或能夠通過使用本領域技術人員熟知的方法由合成的基因進行表達，所述方法包括美國專利號6，506，559 (在此引用作為參考 )中所描述的方法。a. Pr1-miRNA本發明的核酸可包含pr1-miRNA或其變體的序列。pr1-miRNA序列可包含45至250,55至200、70至150或80至100個核苷酸。pr1-miRNA的序列可包含下面所示的pre-miRNA> miRNA和miRNA *。pr1-miRNA也可包含miRNA或miRNA *和其互補物以及其變體。pr1-miRNA可包含至少19%的腺苷核苷酸、至少16 %的胞嘧啶核苷酸、至少23 %的胸腺嘧啶核苷酸和至少19%的鳥嘌呤核苷酸。pr1-miRNA可形成髮夾結構。髮夾結構可包含基本上互補的第一和第二核酸序列。第一和第二核酸序列可具有37至50個核苷酸。可通過8至12個核苷酸的第三序列分隔第一和第二核酸序列。如通過使用Hofacker等人，Monatshefte f. Chemie 125 167-188(1994)(其內容在此引用作為參考)中所描述的Vienna算法，利用預設參數所計算的，髮夾結構可具有少於-25千卡/摩爾的自由能。髮夾結構可包含4-20、8-12或10個核苷酸的末端環。pr1-miRNA的序列可包含表I中涉及的髮夾結構的序列、表10的序列標誌符6757248-6894882的序列、表17的序列標誌符1-6318或18728-18960的序列、或其變體。b. Pre-miRNA本發明的核酸也可包含pre-miRNA或其變體的序列。pre-miRNA序列可包含45至90、60至80或60至70個核苷酸。pre-miRNA的序列可包含下面所不的miRNA和miRNA *。pre-miRNA也可包含miRNA或miRNA *和其互補物以及其變體。pre-miRNA的序列也可以是除去pr1-miRNA的5』和3』末端的0-160個核苷酸的pr1-miRNA的序列。
pre-miRNA的序列可包含表I中涉及的髮夾的序列、表10的序列標誌符6757248-6894882的序列、表17的序列標誌符1-6318或18728-18960的序列、或其變體。c. miRNA本發明的核酸也可包含miRNA、miRNA *或其變體的序列。miRNA序列可包含13至33、18至24或21至23個核苷酸。miRNA的序列可以是pre-miRNA的前13至33個核苷酸。miRNA的序列可以是pre-miRNA的最後13至33個核苷酸。miRNA的序列可包含表I中涉及的miRNA的序列、表10的序列標誌符1-117750或6894883-10068177的序列、表17的序列標誌符6319-18727或18961-19401的序列、或其變體。d.抗-miRNA本發明的核酸也可包含能夠阻斷miRNA或miRNA *的活性的抗-miRNA的序列。抗-miRNA可包含總共5至100或10至60個核苷酸。抗-miRNA也可包含總共至少5、6、7、
8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或 26 個核苷酸。抗-miRNA 的序列可包含(a)基本上和miRNA的5』同一的至少5個核苷酸和基本上和所述miRNA的5』末端的靶位點的側翼區互補的至少5-12個核苷酸，或(b)基本上和miRNA的3』同一的至少5至12個核苷酸和基本上和所述miRNA的3』末端的靶位點的側翼區互補的至少5個核苷酸。抗-miRNA的序列可包含表I中涉及的miRNA的序列、表10的序列標誌符1-117750或6894883-10068177的序列、表17的序列標誌符6319-18727或18961-19401的序列、或其變體的互補物。e.靶的結合位點本發明的核酸也可包含靶miRNA結合位點或其變體的序列。靶位點序列可包含總共5至100或10至60個核苷酸。靶位點序列可包含表4中涉及的靶基因結合位點的序列、表10的序列標誌符117751-6757247的序列、或其變體的至少5個核苷酸。4.合成的基因本發明也涉及包含可操作地連接至轉錄和/或翻譯調節序列的本發明的核酸的合成的基因。所述合成的基因能夠修飾具有本發明的核酸的結合位點的靶基因的表達。可在細胞、組織或器官中修飾靶基因的表達。可合成合成的基因或通過標準的重組技術從天然發生的基因中衍生合成的基因。合成的基因也可在合成的基因序列的轉錄單位的3』-末端包含終止子。合成的基因也可包含選擇標記。5.載體本發明也涉及包含本發明的合成的基因的載體。載體可以是表達載體。表達載體可以包含另外的元件。例如，表達載體可具有兩種這樣的複製系統，所述複製系統能夠使其在兩種生物中得以維持，例如在用於表達的哺乳動物或昆蟲細胞和用於克隆和擴增的原核細胞中。對於整合表達載體，表達載體可包含至少一個和宿主細胞基因組同源的序列，和優選地兩個側翼連接該表達構建體的同源序列。通過選擇適當的同源序列用於包括入載體可將整合性載體導向宿主細胞中的特定基因座。載體也可包含使得能夠選擇轉化的宿主細胞的選擇標記基因。 6.宿主細胞
本發明也涉及包含本發明的載體的宿主細胞。所述細胞可以是細菌、真菌、植物、昆蟲或動物細胞。7.探針本發明也涉及包含本發明的核酸的探針。探針可用於篩選和診斷方法，如下面所概述的方法。可將探針附著至或固定在固體基質例如生物晶片上。探針可具有8至500、10至100或20至60個核苷酸的長度。探針也可具有至少8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280 或 300 個核苷酸的長度。探針還可包含10至60個核苷酸的接頭序列。8.生物晶片

本發明也涉及生物晶片。生物晶片可包含這樣的固體基質，所述固體基質包含附著的本發明的探針或多個探針。所述探針可能能夠在嚴格雜交條件下和靶序列雜交。可在空間上確定的地址將探針附著在基質。可使用每個靶序列超過I個探針，其中使用交疊的探針或針對特定靶序列的不同部分的探針。探針可能能夠與和單一病症關聯的靶序列雜交。可以許多方法，如本領域技術人員所理解的方法將探針附著至生物晶片。可先合成探針，然後將其附著至生物晶片，或可直接在生物晶片上合成探針。固體基質可以是這樣的材料，該材料可被修飾以包含適合用於探針的附著或結合的分離的單個位點，且可按至少一種檢測方法處理。基質的代表性實例包括玻璃和修飾或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸類塑料、聚苯乙烯以及苯乙烯與其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonJ等)、多糖、尼龍或硝酸纖維素、樹脂、矽石或基於矽石的材料(包括矽和經修飾的矽)、碳、金屬、無機玻璃和塑料。所述基質可允許光學檢測而不發一點突光。基質可以是平面的，儘管也可使用其他構型的基質。例如，對於流通樣品分析(flow-through sample analysis),可將探針置於管的內側表面以將樣品體積最小化。類似地，基質可以是能變形的，例如能變形的泡沫，包括由特殊塑料製成的閉合小室泡沫。可用化學官能團衍生化生物晶片和探針，以用於隨後的兩者的附著。例如，可用化學官能團(包括，但不限於，氨基、羧基、橋氧基或硫醇基)衍生化生物晶片。使用這些官能團，可直接或間接地使用接頭，利用探針上的官能團附著所述探針。可通過5'末端、3'末端或通過內部核苷酸將探針附著至固體支持物。也可非共價地將探針附著至固體支持物。例如，可製備生物素化的寡核苷酸，其可結合用鏈黴抗生物素蛋白共價包被的表面，從而產生附著。可選擇地，可使用技術例如光聚合和光刻法在表面合成探針。9. miRNA 表達分析本發明也涉及鑑定和疾病或病理狀況關聯的miRNA的方法，其包括將生物學樣品和本發明的探針或生物晶片接觸並檢測雜交的量。可使用PCR擴增樣品中的核酸，這可以提供更高的靈敏度。鑑定這樣的miRNA的能力可提供高解析度、高靈敏度的數據集(datasets),所述miRNA，和對照相比，在病理細胞中超表達或表達不足，所述數據集可用於診斷、治療、藥物開發、藥物遺傳學、生物傳感器開發領域和其他相關領域。由本方法產生的表達概況可以是關於許多miRNA的樣品的狀態的「指紋圖譜」。儘管兩種狀態可具有相似表達的任何特定的miRNA，但同時估量許多miRNA使得能夠產生表徵細胞的狀態的基因表達概況。即，可將正常組織和患病的組織區分開。通過比較處於已知的不同疾病狀態的組織的表達概況，可獲得關於哪種miRNA和這些狀態中的每一個關聯的信息。從而，可進行或確認診斷以確定組織樣品是否具有正常或疾病組織的表達概況。這可以提供相關狀況的分子診斷。10.確定表達水平本發明也涉及確定病症關聯性miRNA的表達水平的方法，其包括將生物學樣品和本發明的探針或生物晶片接觸並測量雜交的量。疾病關聯性miRNA的表達水平是多種方式的信息。例如，可將和對照相比的疾病關聯性miRNA的差異表達用作對患者患有該疾病的診斷。病症關聯性miRNA的表達水平也可用於監控患者的治療和疾病狀態。此外，疾病關聯性miRNA的表達水平可允許篩選用於改變特定的表達概況或抑制和疾病關聯的表達概況的藥物候選物。可通過將包含靶核酸的樣品和生物晶片(該生物晶片包含附著的充分和靶核酸互補的探針)接觸並檢測高於對照水平的和探針的雜交來檢測該靶核酸。也可通過將待檢查的核酸固定化在固體支持物例如尼龍膜上，並使標記的探針和該樣品雜交來檢測靶核酸。類似地，也可通過將標記的探針固定化在固體支持物上，並雜交包含標記的靶核酸的樣品來檢測靶核酸。在洗滌以除去非特異性的雜交後，可檢測標記。也可通過將透化的細胞或組織樣品和標記的探針接觸以允許和靶核酸雜交來在原位檢測靶核酸。在洗滌以除去非特異性結合的探針後，可檢測標記。這些測定法可以是直接的雜交測定或可包含夾心測定，其包括使用多個探針，如在美國專利號 5，681，702,5, 597，909,5, 545，730,5, 594，117,5, 591，584,5, 571，670、5，580，731、5，5 71，670、5，591，584、5，624，802、5，635，352、5，594，118、5，359，100、5，124，246和5，681，697中所概述的，各專利在此引用作為參考。可使用各種雜交條件，包括上述的高嚴格條件、中等嚴格條件和低嚴格條件。可在只允許探針和靶雜交的嚴格條件下進行測定。可通過改變這樣的步驟參數來控制嚴格度，所述步驟參數是熱力學變量，包括，但不限於溫度、甲醯胺濃度、鹽濃度、離液鹽濃度PH或有機溶劑濃度。可以各種方法進行雜交反應。可同時或以不同順序依次加入反應的組分。此外，反應可包括許多種其他試劑。這些試劑包括鹽、緩衝液、中性蛋白例如清蛋白、去汙劑等，所述試劑可用於幫助最佳雜交和檢測，和/或減少非特異性相互作用或背景相互作用。依賴於樣品的製備方法和靶的純度，適當時，也可使用在其他方面提高測定的功效的試劑，例如蛋白酶的抑制劑、核酸酶的抑制劑和抗微生物劑。a.診斷本發明也涉及診斷的方法，其包括檢測疾病關聯性miRNA在生物學樣品中的差異表達水平。樣品可來源於患者。患者的疾病狀態的診斷使得能夠預後和選擇治療策略。此夕卜，可通過確定臨時(temporarily)表達的miRNA分子來對細胞的發育階段進行分類。可進行標記的探針和組織陣列的原位雜交。當比較個體和標準之間的指紋圖譜時，本領域技術人員可基於發現作出診斷、預後或預測。還要理解，指示診斷的基因可以和指示預後的基因不同，且細胞狀況的分子特徵分析(molecular profiling)可區分易起反應的狀況或難治的狀況或可預測結果。b.藥物篩選本發明也涉及篩選治療劑的方法，其包括將能夠表達疾病關聯性miRNA的病理細胞和候選治療劑接觸並評價藥物候選物對疾病關聯性miRNA的表達概況的作用。在已鑑定差異表達的miRNA後，可進行各種測定。可就調節疾病關聯性miRNA的基因表達的能力篩選受試化合物。調節包括基因表達上的增加和減少。受試化合物或藥物候選物可以是就直接或間接地改變疾病表型或疾病關聯性miRNA的表達的能力受檢驗的任何分子，例如，蛋白、寡肽、小有機分子、多糖、多核苷酸等。藥物候選物包括許多化學種類，例如具有超過100和低於大約500、1，000、1，500、2，000或2，500道爾頓的分子量的小有機分子。候選化合物可包含和蛋白發生結構相互作用特別是形成氫鍵所必需的官能團，且一般包括至少胺基、羰基、羥基或羧基，優選地包含至少兩個化學官能基團。候選試劑可包含用一個或多個上述官能團取代的環狀碳(cyclicalcarbon)或雜環結構和/或芳族或多環芳族(poIyaromatic)結構。也在生物分子(包括肽、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤·、嘧啶、其衍生物、結構類似物或組合)中發現了候選試劑。可就結合疾病關聯性miRNA的能力或調節其活性的能力篩選潛在的調節劑的組合文庫。組合文庫可以是多種化合物的集合，所述化合物是通過組合許多化學結構單元例如試劑進行的化學合成或生物合成產生的。組合化學文庫的製備和篩選對本領域技術人員來說是熟知的。這些組合化學文庫包括，但不限於，編碼的肽的肽文庫、苯二氮革類、diversomers例如乙內醯脲類、苯二氮革類和二肽、vinylogous多肽、小化合物文庫的類似有機綜合體、寡氨基甲酸酯(oligocarbamates)、和/或肽基磷酸酯、核酸文庫、肽核酸文庫、抗體文庫、糖類文庫和小有機分子文庫。11.基因沉默本發明也涉及使用本發明的核酸來減少靶基因在細胞、組織或器官中的表達的方法。可通過表達本發明的核酸(其包含基本上和靶mRNA的一個或多個結合位點互補的序列)來減少靶基因的表達。所述核酸可以是miRNA或其變體。核酸也可以是可經加工以產生miRNA的pr1-miRNA、pre-miRNA或其變體。表達的miRNA可和祀mRNA上的基本上互補的結合位點雜交，這可導致RISC介導的基因沉默的激活。利用miRNA的超表達的研究的實例是Yekta等人2004，Science304-594，其在此引用作為參考。本領域技術人員認識到通過使用本領域熟知的反義方法以及美國專利號6，506，559和6，573，099 (其在此引用作為參考)中描述的RNAi方法，可將本發明的核酸用於抑制靶基因的表達。基因沉默的靶可以是導致第二蛋白沉默的蛋白。通過抑制靶基因的表達，可增加第二蛋白的表達。miRNA表達的有效抑制的實例是Esau等人2004 JBC 275-52361 JPCheng等人2005 Nucleic Acids Res. 33-1290 (其在此引用作為參考)進行的研究。12.基因增強本發明也涉及使用本發明的核酸增加細胞、組織或器官中的靶基因的表達的方法。可通過表達本發明核酸(其包含基本上和pr1-miRNA、pre-miRNA、miRNA或其變體互補的序列)來增加祀基因的表達。所述核酸可以是抗-miRNA。抗-miRNA可和pr1-miRNA、pre-miRNA或miRNA雜交，從而減少其基因表達活性。也可通過表達本發明的核酸來增加革巴基因的表達，所述本發明的核酸基本上和靶基因中的結合位點的部分互補，這樣所述核酸與結合位點的結合可防止miRNA結合。13.治療本發明也涉及這樣的方法，該方法將本發明的核酸用作和發育功能異常例如癌症關聯的疾病或病症的調節劑或靶。一般地，所述請求保護的核酸分子可用作至少部分地和所述核酸互補的基因表達的調節劑。此外，miRNA分子可用作篩選治療劑的方法的靶，例如miRNA分子的抑制或激活可調節細胞分化過程，例如編程性細胞死亡。此外，可將現有的miRNA分子用作原材料，以生產序列經修飾的miRNA分子以修飾其對例如癌基因、廣譜抗藥基因或另一種治療性靶基因的靶特異性。此外，可修飾miRNA分子，目的在於對其進行加工，然後將其產生為又能抗治療關聯性靶的雙鏈siRNA。此外，可將miRNA分子用於組織重編程方法(tissue reprogramming procedures),例如,可通過向不同的細胞類型或幹細胞中表達miRNA分子來轉化分化的細胞系。14.組合物本發明也涉及包含本發明的核酸和任選地藥物可接受載體的藥物組合物。該組合物可用於診斷或治療用途。可通過已知的方法施用藥物組合物，在所述方法中，在體外或體內將核酸導入想要的靶細胞。通常使用的基因轉移技術包括磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法、電穿孔法、顯微注射法、病毒法和陽離子脂質體。15.試劑盒本發明也涉及這樣的試劑盒，該試劑盒包含本發明的核酸和任一種或所有下列物質測定試劑、緩衝液、探針和/或引物以及無菌鹽水或另一種藥物可接受的乳劑和懸浮液基底(suspension base )。此外,試劑盒可包括包含用於實施本發明的方法的指導(例如，規程)的說明材料。實施例1miRNA 的預測我們使用兩種和美國專利申請號60/522，459、10/709，577和10/709，572 (其內容在此引用作為參考)中描述的用於預測miRNA的方法相似的計算機方法就潛在的編碼miRNA的基因對整個人基因組進行了考察。簡而言之，就髮夾結構掃描整個人基因組的非蛋白編碼區。根據熱力學穩定性以及結構和上下文特徵給預測的髮夾結構和潛在的miRNA評分。使用Sanger資料庫中的已被驗證的miRNA校準算法。1.第一次篩選表11A-11C顯示來自第一次計算機篩選的各預測的髮夾結構的序列(「前體序列」)、序列標誌符(「PRECUR SEQ-1D」)和來源的生物(「GAM生物」)以及預測的miRNA (「GAM名稱」)。表12顯示各miRNA (「GAM名稱」)的序列(「GAM RNA序列」)和序列標誌符(「GAMSEQ-1D」)以及來源的生物(「GAM生物」)和Dicer切割位置(「GAM P0S」)。預測的髮夾結構和miRNA的序列也列於表10中。2.第二次篩選表I列出了第二次計算機篩選的各預測的髮夾結構的SEQ ID N0( 「HID」)。表I也列出了各髮夾結構的基因組位置(「髮夾結構位置」)。基因組位置的格式是串聯的<鏈X起始位置〉。例如，19+135460000是指第19號染色體、+鏈、起始位置135460000。染色體23-25是指X染色體、Y染色體和線粒體DNA。染色體的定位基於由UCSC(http//genome, ucsc. edu)講彳丁的人基因組的hgl7裝配，hgl7裝配基於NCBI Build 35第I版且由國際人類基因測序聯盟(International Human Genome Sequencing Consortium)產生。表I也列出了髮夾結構是否在進化中保守(「C」)。存在這樣的選項，即存在紙件基因組版本。通過使用PhastCons數據鑑定髮夾結構為保守的(「Y」)或非保守的(「N」)。phastCons數據是人基因組對黑猩猩、小鼠、大鼠、狗、雞、蛙和斑馬魚的基因組中各核苷酸的進化保守性的量度，其基於phylo-HMM，phylo-HMM使用基於BlastZ的各物種的基因組內最佳的(best-1n-genome)成對比對(pair wise alignment),然後進行8個基因組的 multiZ 比對(Siepel 等人，J. Comput. Biol 11,413-428, 2004 和 Schwartz 等人，Genome Res. 13，103-107，2003)。如果7個物種在髮夾結構莖內的任何15個核苷酸序列上的平均phastCons保守評分是至少O. 9,那麼髮夾結構被列為保守的(Berezikov, E.等人 Phylogenetic Shadowing and Computational Identification of Human microRNAGenes. Cell 120，21-24，2005)。表I也將各髮夾結構的基因組類型(「T」)列為基因間的(「G」)、內含子(「I」)或外顯子(「E」)。表I也列出了各預測的miRNA和miRNA *的SEQ ID N0( 「MID」)。表I也列出了各髮夾結構在0-1(1表示髮夾結構最可靠)的數值範圍內的預測評分級別(「P」)，如 Hofacker 等人，Monatshefte f. Chemie 125 :167-188,1994 中所描述的。如果級別是 O或空，則將其變換成更小的其P-值外顯子> lntron_c > Exon_c >基因間的。表9顯示靶序列(「基因名稱」)和疾病(「疾病代碼」)之間的關係。實施例3
miRNA 的驗證1.表達分析-第I組為確定在O上預測的髮夾結構和miRNA，我們使用和美國專利申請號60/522，459、10/709, 577和10/709，572 (其內容在此引用作為參考)中描述的方法相似的高通量微陣列在各種組織中檢測表達。對於各預測的前體miRNA，檢驗從髮夾結構的兩個莖衍生的成熟miRNA。表2顯示通過檢測相關的miRNA( 「MID」)的表達驗證的第2預測組的髮夾結構(「HID」)，和在其中檢測表達的組織的代碼(「組織」)。表2的組織和疾病的代碼列於表7中。受試組織中的一些組織是細胞系。具有/不具有P53:H1299的肺癌細胞系(H1299)具有突變的P53。用具有P53的這樣的構建體轉染細胞系，該構建體是溫度敏感型的(在32°C下具有活性)。在32°C下進行實驗。表2也顯示晶片表達評分級別(500至65000的範圍)。使用500的閾值消除非顯著信號，且通過來自不同實驗的MirChip探針信號來規格化評分。實驗之間的螢光材料強度中的變化可能是由於RNA製劑或標記功效中的差異造成的。我們基於這樣的假設進行規格化，即各樣品中的miRNA的總量是相對恆定的。首先我們從各探針的原始信號中減去背景信號，其中將背景信號定義為400。接著，我們將各miRNA探針信號除以所有miRNA的平均信號，將所得結果乘以10000，再加回400的背景信號。因此，根據定義，各實驗中所有miRNA的探針信號的總和是10400。表2也顯示了根據規格化的評分計算的規格化的信號的統計分析(「Spval」)。對於各miRNA，我們使用了來自完全的預測的miRNA列表的相關對照組。各miRNA具有包含錯配的探針的內對照。相關對照組包含這樣的探針，該探針具有相似的C和G百分比(absdiff <5%)以具有相似的Tm。探針信號P值是對具有相同或更高信號的相關對照組探針的比率。結果是P-值彡O. 05，且評分超過500。在SPVal列為O. O的情況下，該值小於O.0001。2.表達分析-第2組為進一步確定在O上預測的髮夾結 構和miRNA，我們在另外的組織中檢測了表達。表16通過下列列出了 miRNA的表達數據HID :表17中所示的序列的髮夾結構序列標誌符；MID :表17中所示的序列的miRNA序列標記符組織受試組織；S :晶片表達評分級別(範圍=100-65000) ；Dis.Diff. Exp.:疾病相關性差異表達和在其中對其進行檢驗的組織；R :疾病相關性表達的比率(範圍=O. 01-99. 99);和縮寫腦混合物A-患阿爾茨海默氏病的腦組織混合物；腦混合物B-所有腦組織的混合物；和腦SN-黑質。3.測序為進一步驗證第二次預測的髮夾結構(「HID」)，通過使用和美國專利申請號60/522，459、10/709，577和10/709，572 (其內容在此引用作為參考)中描述的方法相似的測序方法驗證許多miRNA。表3顯示通過測定所示的組織(「組織」)中的miRNA(MID)的序列驗證的髮夾結構(「HID」)。實施例4第19號染色體的miRNA來自實施例3的成組的經驗證的miRNA在胎盤中高度表達，其具有明顯的序列相似性，且位於第19號染色體上的相同基因座中(圖2)。這些預測的miRNA沿著19ql3.42基因座中的大約100，OOO個核苷酸的區域散布。該基因組區域沒有編碼蛋白的基因並且似乎是基因間的。基因組序列的進一步分析，包括徹底檢查我們的預測算法的輸出，揭示了更多的推定的相關性miRNA,且將mir-371、mir-372和mir-373定位在該區域下遊大約25, OOObp0總共在該區域鑑定了 54個推定的miRNA前體。可將該miRNA前體分成4個不同類型的關聯序列(圖2)。聚簇中大約75%的miRNA是高度關聯的並且被標記為A型。其他三種miRNA類型，類型B、C和D分別由4、2和2個前體組成。另外3個推定的miRNA前體(SI至S3)具有非相關序列。有趣地，所有miRNA前體的方向都和相鄰的mir-371、mir-372和mir-373 miRNA前體的方向相同。進一步的序列分析揭示大多數A-型miRNA內嵌於在聚簇中重複35次的大約600bp的區域中。該重複序列不出現在基因組的其他區域中，且只在靈長類動物中保守。該重複單位幾乎總是被上遊和下遊Alu重複序列包圍。這和極度缺乏Alu重複序列的MC14-1聚簇形成了鮮明的反差。圖3-A顯示人中包含A-型miRNA前體的35個重複單位的序列的比較。該比較鑑定了 2個表現最高序列相似性的區域。一個區域包含A-型miRNA，位於重複序列的3』區域。第2個區域位於A-型miRNA前體上遊大約100個核苷酸處。然而，第2個區域在黑猩猩的重複序列單位中沒有顯示 高度相似性，而包含A-型miRNA前體的區域則顯示高度相似性(圖3-B)。檢查包含A-型重複序列的區域顯示，由前體的5』莖編碼的miRNA的5』區域(5pmiRNA)似乎比成熟的miRNA的其他區域更可變。這和從3』莖衍生的成熟的miRNA的3』區(3p miRNAs)中的可變性相匹配。如所預期的，環區域高度可變。也可在所有43個A-型miRNA的多重序列比對中觀察到相同的現象(圖4)。圖4中展現的多重序列比對揭示了下列關於預測的成熟miRNA的發現。可將5pmiRNA分成3個組。核苷酸I至6為富含C/T的，其相對可變，且在大多數miRNA中由核苷酸3至5中的CTC基序標記。核苷酸7至15富含A/G，且除了核苷酸7和8外，其為絕大多數miRNA所共有。核苷酸16至23富含C/T，且再次顯示，其在成員中是保守的。一般而言，預測的3p miRNA在家族成員中顯示更高的保守性。大部分從AAA基序開始，但少數具有可能在其靶識別中至關重要的不同的5』序列。核苷酸8至15富含C/T並且顯示高度保守性。最後7個核苷酸保守性稍低，但其在核苷酸17至19中包含大多數成員共有的GAG基序。重複單位的5』區域的分析鑑定了潛在的髮夾結構。然而，在大多數重複單位中，這些髮夾結構未得以保存，並且從最高評分的髮夾結構克隆miRNA的努力也遭到失敗。存在未在長重複單位內發現的8個A-型前體。圍繞這些前體的序列沒有顯示出和A-型重複單位或和任何其他基因組序列的相似性。對於這些A-型前體中的5個前體，存在位於顯著靠近A-型序列的下遊的Alu重複序列。聚簇中其他miRNA類型顯示下列特徵。在大約500bp的重複區域中發現了 4個B組miRNA，其中一個位於聚簇的末端。兩個D-型miRNA，其相互之間相距大約2000個核苷酸，位於聚簇的起始處並且包含在1220個核苷酸的重複區域內。有趣地，兩個D-型前體相同。3個非關聯序列的miRNA中的2個，SI和S2，正好位於2個D型miRNA之後，且第3個位於A34和A35之間。一般地，包含該聚簇的整個大約100，000個核苷酸的區域被重複元件覆蓋。這包括對於該區域特異性的包含miRNA的重複單位和大量散布在該聚簇中的基因組範圍的重複元件。實施例5預測的miRNA的克隆為進一步驗證預測的miRNA，使用和美國專利申請號60/522，459、10/709，577和10/709，572 (其內容在此引用作為參考)中描述的方法相似的方法克隆實施例4中描述的許多miRNA。簡而言之，針對各預測的miRNA設計特異性的捕獲寡核苷酸。使用所述寡核苷酸捕獲、克隆來自富含小RNA的胎盤衍生的文庫的特定miRNA並對其進行測序。我們克隆了 43個A-型miRNA中的41個miRNA和D-型miRNA，A-型miRNA中的13個miRNA沒有呈遞在最初的微陣列上，但只進行了計算機預測。對於預測的miRNA前體中的11個，將5p和3p預測的成熟miRNA都呈遞在微陣列上，且在所有情況中兩種miRNA都產生了顯著的信號。因此，我們試圖在所有的克隆嘗試中克隆5'和3'成熟miRNA。對於43個克隆的miRNA中的27個，我們能夠克隆衍生自5'和3'莖的miRNA。因為我們的克隆努力不是無遺漏的，所以可能有更多的miRNA前體同時編碼5'和3'成熟miRNA。如在許多miRNA 克隆研究(Lagos-Quintana 2001，2002，2003) (Poy 2004)中所觀察到的，許多克隆的miRNA已在3』末端顯示不均一性。有趣地，我們也在大量克隆的miRNA的5』末端觀察到不均一性。和3』-莖衍生的miRNA(6)相比，該不均一性似乎在5』-莖衍生的miRNA(9)中更普遍。在比較中，3'末端上的不均一性和Y和Y -莖衍生的miRNA(分別是19和13)的相似。5』不均一性主要包括一個核苷酸(主要是C或A)的加入，但在一種情況下加入了 3個核苷酸。該現象對於第19號染色體聚簇中的miRNA不是特異性的。我們已在許多另外克隆的miRNA中，包括已知的miRNA和來自其他染色體的新的miRNA中觀察到該現象(數據 未顯示)。實施例6miRNA表達的分析為進一步檢查實施例4的miRNA的表達，我們使用RNA印跡分析來分析幾種組織中miRNA表達的特徵。使用40 μ g在13 %變性聚丙烯醯胺凝膠上分離的總RNA和使用32P末端標記的寡核苷酸探針進行RNA印跡分析。寡核苷酸探針序列是5' -ACTCTAAAGAGAAGCGCTTTGT-3' (A19-3p，NCB1:HSA-MIR-RG-21)和5' -ACCCACCMAGAGMGCACTTT-3' (A24_3p,NCBI HSA-MIR-RG-27)。miRNA表達為大約22個核苷酸長的RNA分子，其具有和在微陣列分析(圖5-A)中觀察到的組織特異性概況相同的組織特異性概況。為了確定MC19-1聚簇是如何轉錄的。對該區域中的ESTs的考察只鑑定了一個包含具有多腺苷酸化信號和聚腺苷酸尾的ESTs的位置。該區域正好位於A43前體的下遊。僅有的具有包含多腺苷酸化信號的ESTs的其他區域正好位於mir-373之後，從而表明mir-371、2、3位於獨立的轉錄物上。我們進行了初步研究，所述研究集中在圍繞mir-A43的區域上，以確保該區域確實被轉錄為聚腺苷醯化的mRNA。使用覆蓋3. 5kb區域的引物進行的RT-PCR實驗導致獲得預期的片段(圖5-B)。使用5 μ g胎盤總RNA和使用寡脫氧胸苷作為引物進行RT-PCR分析。使用下列引物來擴增轉錄物fl 5/ -GTCCCTGTACTGGAACTTGAG-3'；
f2 5/ -GTGTCCCTGTACTGGAACGCA-3'；rl 5/ -GCCTGGCCATGTCAGCTACG-3'；r2 5/ -TTGATGGGAGGCTAGTGTTTC-3'；r3 5/ -GACGTGGAGGCGTTCTTAGTC-3';和r4:5' -TGACAACCGTTGGGGATTAC-3;。通過測序驗證片段的真實性。該區域包括mir-A42和mir-A43,這顯示兩個miRNA都存在於相同的初級轉錄物上。關於該聚簇的轉錄的進一步信息來自位於其內部的77個EST的分析。我們發現42個EST衍生自胎盤。由於這些ESTs沿著整個聚簇散布，因此其表明整個聚簇都在胎盤中表達。該觀察和在微陣列分析中觀察到的表達概況一致。因此，該聚簇中的所有miRNA都可共表達，只有D-型miRNA例外，其是唯一的在HeLa細胞中表達的miRNA。有趣地，在聚族中，位於該區域的77個EST中沒有一個和miRNA前體交疊。這和通過Drosha加工從轉錄物中除去EST表現度(EST representation) 一致。微陣列表達概況的檢查揭示miRNAs Dl/2、A12、A21、A22和A34在幾種接受檢查的其他組織中具有反映為低至中等表達水平的稍許不同的表達概況。這可通過編碼miRNA的轉錄物的可變剪接或通過另外的具有不同組織特異性的啟動子沿聚簇的存在來解釋。
3p和5p成熟miRNA的表達的比較揭示，對於許多miRNA前體，兩者都表達，但在大多數情況下以不同的水平表達。對於大多數pre-miRNA, 3p miRNA以高於5p miRNA的水平表達。然而，在 6 種情況 (mir-Dl, 2、mir-Al、mir-A8、mi;r-A12、mi;r-A17 和 mir-A33)下，3p和5p miRNA以相似的水平表達，且在I種情況(mir_A32)下，5p miRNA以高於3p miRNA的水平表達。 實施例7保守性來自實施例4的所有4種類型的預測的miRNA的序列和其他物種(黑猩猩、獼猴、狗、雞、小鼠、大鼠、果蠅、斑馬魚、真菌、秀麗隱杆線蟲)的序列的比較揭示，聚簇中，且事實上整個區域中的所有miRNA，除了在靈長類動物中外，都不是保守的。有趣地，該區域的同源物不存在於接受檢查的任何其他基因組中，包括小鼠和大鼠的基因組。因此，這是第I個對於靈長類動物特異性的並且一般不為哺乳動物共有的miRNA聚簇。黑猩猩和人之間的同源性分析顯示攜帶有A-型miRNA的所有35個重複序列在兩個物種之間是鄰接的(contiguous)。此外，整個聚族在人和黑猩猩之間似乎是相同的。因此,導致MC19-1聚簇出現的多個重複(multiple duplication)必須在黑猩猩和人類分離(split)前已經發生並且在各物種的進化過程中保持穩定。應當指出，已知人第19號染色體包含許多串聯簇生的基因家族和大片段重複(Grimwood等人，2004)。因此，在該方面MC19-1聚簇是第19號染色體的天然部分。在比較中，MC14-1聚簇在小鼠中一般是保守的，並且在聚簇中只包含A7和A8miRNA，除了在靈長類動物中外，所述miRNA不是保守的(Seitz 2004)。相反地，MC19-1聚族中的所有miRNA對靈長類動物是獨特的。對在Sanger中發現的所有miRNA的考察揭示，只有3種miRNA，mir-198、mir-373和mir_422a在小鼠或大鼠基因組中不是保守的，然而，其在狗基因組中是保守的，且從而對於靈長類動物不是特異性的。有趣地，和mir-373簇生的，且位於MC19-1聚族下遊25kb處的mir-371和mir-372在某種程度上和A-型miRNA (圖4)是同源的，但在嚙齒類動物中是保守的。A-型miRNA序列和Sanger資料庫中的miRNA的比較揭示,人mir_302家族存在最大的同源性(圖4-C)。該同源性比用mir-371、2、3觀察到的同源性高。在覆蓋690個核苷酸的5個miRNA (包括mir-367)的緊密堆積的聚簇中發現了 mir_302家族(mir_302a、b、c和d)，所述家族以反義的方向位於HDCMA18p基因(檢索號ΝΜ_016648)的編碼蛋白的外顯子內的第I個內含子中。除了 miRNA同源性外，沒有另外的同源性存在於mir-320聚簇和MC19-1聚簇之間。mir-371、2、3和mir_302a、b、C、d對於胚胎幹細胞都是是特異性的事實是值得注意的。實施例8miRNA的差異表達使用和O中描述的方法相似的晶片表達方法，使用特徵提取軟體(FeatureExtraction Software)(版本7.1.1, Agilent)分析微陣列圖像。表2顯示和正常組織相比的疾病關聯性表達(「R」)的比率。表2也顯示規格化的信號的統計分析(「RPval」)。將各探針的信號設置為其中等強度。信號強度的變化範圍為從400的背景水平至66000的飽和水平。進行2通道雜交，且將Cy3信號和Cy5信號進行比較，其中進行(正常對疾病)螢光逆轉晶片(fluor reversed chip)，將探針信號設置為其平均信號。通過用已知的miRNA平均信號去除信號來規格化所述信號，從而在各實驗或通道中，已知的miRNA信號的總和相同。計算疾病和正常組織之間的信號比率。信號比率大於1. 5表明顯著上調，P值為O. 007，而信號比率大於2，則有O. 003的P值。基於這些或更大的信號比率在在重複實驗中的發生來評價P值。表2中的差異表達分析表明許多miRNA的表達在疾病組織中發生了顯著的改變。特別是，實施例4的MC19-1 miRNA在前列腺癌和肺癌中差異表達。在來源於前列腺癌的細胞中，MC19-1區域內的雜合 性喪失的鑑定支持MC19-1 miRNA和癌症的關聯性(Dumur等人2003)。
權利要求
1.分離的核酸，其在長度上是12至250個核苷酸，且包含和SEQID NO :3360, SEQ IDNO :13805,SEQ ID NO :13806、SEQ ID NO :13807,SEQ ID NO :13808或SEQ ID NO :13809 的序列具有至少60%的同一性的至少12個鄰接的核苷酸或由其互補物組成。
2.權利要求1的分離的核酸，其包含和SEQID NO :3360, SEQ ID NO :13805, SEQ IDNO :13806,SEQ ID NO :13807,SEQ ID NO :13808 或 SEQ ID NO :13809 具有至少 70% 的同一性的核苷酸序列或其互補物。
3.權利要求2的分離的核酸，其包含和SEQID NO :3360, SEQ ID NO : 13805、SEQ IDNO :13806,SEQ ID NO :13807,SEQ ID NO :13808 或 SEQ ID NO :13809 具有至少 80% 的同一性的核苷酸序列或其互補物。
4.權利要求3的分離的核酸，其包含和SEQID NO :3360, SEQ ID NO :13805, SEQ IDNO :13806,SEQ ID NO :13807,SEQ ID NO :13808 或 SEQ ID NO :13809 具有至少 90% 的同一性的核苷酸序列或其互補物。
5.權利要求1-4中任一項的分離的核酸，其包含SEQID NO :3360,SEQ ID NO =13805,SEQ ID NO : 13806、SEQ ID NO : 13807、SEQ ID NO :13808 或 SEQ ID NO 13809 的核苷酸序列或其互補物。
6.權利要求1-5中任一項的分離的核酸，其由SEQID NO :3360,SEQ ID NO :13805,SEQID NO : 13806、SEQ ID NO : 13807、SEQ ID NO 13808 或 SEQ ID NO 13809 的核苷酸序列或其互補物組成。
7.由權利要求1-6中任一項的核酸組成的探針。
8.由至少8-22個鄰接的核苷酸組成的探針，該鄰接的核苷酸和SEQID NO :13807,SEQID NO 13808 或 SEQ ID NO :13809 互補。
9.權利要求8的多種探針。
10.權利要求9的多種探針，其由至少一個和表2中稱為在前列腺癌中差異表達的各miRNA互補的探針組成。
11.權利要求9的多種探針，其由至少一個和表2中稱為在肺癌中差異表達的各miRNA互補的探針組成。
12.包含權利要求10或權利要求11的多種探針的組合物。
13.包含固體基質的生物晶片，所述基質包含權利要求10或權利要求11的多種探針，其中在空間確定的地址上將各探針附著至基質。
14.權利要求13的生物晶片，其中所述探針和表2中稱為在前列腺癌中差異表達的miRNA互補。
15.權利要求13的生物晶片，其中所述探針和表2中稱為在肺癌中差異表達的miRNA互補。
16.檢測疾病關聯性miRNA的差異表達的方法，其包括在生物學樣品中測量和SEQIDNO : 13806、SEQ ID NO : 13807、SEQ ID NO :13808 或 SEQ ID NO 13809 中任一種具有至少·70 %的同一性的核酸的水平， 其中和對照相比，核酸水平上的差異指不差異表達。
全文摘要
此處描述了和前列腺癌以及肺癌關聯的新的多核苷酸。所述多核苷酸是miRNA和miRNA前體。公開了可用於這些醫學狀況的診斷、預後和治療的相關方法和組合物。此處也描述了可用於鑑定前列腺癌和肺癌的調節劑的方法。
文檔編號C12N15/113GK103045593SQ201210229008
公開日2013年4月17日 申請日期2005年5月14日 優先權日2004年5月14日
發明者I·本特維奇, A·阿夫尼爾, Y·卡洛夫, R·阿哈羅諾夫 申請人:羅塞塔金諾米克斯有限公司