基因豐度的測定方法

2024-03-01 03:30:15

基因豐度的測定方法
【專利摘要】一種基因的豐度的測定方法，包括：在一個反應液中，使用第二引物和包括至少兩種第一引物的第一引物組對編碼至少兩個基因的核酸進行核酸擴增，其中，所述至少兩個基因在對象樣品中的核酸中的基因豐度有可能不同，所述至少兩種第一引物能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中且分別對應於所述至少兩個基因，所述第二引物用於擴增包括所述單一的額外鹼基序列的核酸，並獲得包含所述單一的額外鹼基序列且分別對應於所述至少兩個基因的至少兩種擴增產物；以及檢測基於所述至少兩種擴增產物的豐度的各自的信號，基於該信號測定出所述至少兩個基因的豐度。
【專利說明】基因豐度的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因豐度的測定方法。
【背景技術】
[0002]有些基因可能在一個基因組中存在多個。這樣的基因的基因組中的豐度有可能被利用到基因診斷或有可能影響到藥劑的效果，有時要求了解或測定基因在對象樣品中的核酸(例如基因組等)中的豐度。作為這樣的檢測的一例，可以舉出基因拷貝數的測定或基因數量增減的測定，還有拷貝數變異(CNV, copy number ofvariat1n)的診斷等。
[0003]作為測定基因豐度的方法有，例如FISH法(請參照例如Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,Vol.89，pp.5321-5325，Junel992)或利用了競爭性結合DNA的CGH法(請參照例如JP特表平7-505053號公報)等的利用了突光標記法的方法。在這些方法中，使突光標記化合物直接與染色體反應之後，通過圖像處理或螢光顯微鏡的觀察可以確認基因豐度。但是，具有不能正確識別同一個基因在染色體上比較接近位置存在兩處以上等情況、以及使用大量試劑以及操作複雜等缺點。
[0004]從這樣的觀點出發，開發了使用利用PCR(聚合酶鏈式反應，polymerasechain react1n)技術而測定基因豐度的實時PCR(請參照例如Clinical Chemistrypp.1546-1554 (2009)、國際公開第W02011/043220號小冊子等)以及數字PCR (請參照例如JP特開2010-538614號公報)等，有效且準確地測定基因豐度的技術。
[0005]特別是，JP特開2010-538614號公報中公開的技術，是一種確定對象基因組中的目標多核苷酸序列的相對拷貝數的方法，在包含對象基因組DNA的試樣中，對目標基因序列以及參照基因序列進行核酸擴增，並對通過數字PCR而進行擴增的各基因序列進行分析，根據包括目標基因序列的擴增多核苷酸分子數和包括參照基因序列的擴增多核苷酸分子數的比，來確定拷貝數的變動。
[0006]一方面，在一個試樣中存在多個不同的基因的情況下，作為擴增目標核酸(作為目標的部分)的方法，JP特表2011-516069號公報中公開了包括兩階段的核酸擴增工序、以及其間拯救被用作目標的核酸擴增子的工序的方法。這種方法中，在最初的核酸擴增工序中，使用目標特定性引物而進行核酸的擴增，由此產生至少一個包括至少一個共通引物結合部位的核酸擴增子，將已獲的核酸擴增子從已使用的目標特定引物中分離(拯救)之後，使用共通引物而進行擴增。
[0007] 並且一般在PCR技術中，使用相互方向不同的一對引物對而分別對雙鏈核酸進行核酸擴增，產生對象基因序列的擴增產物(有時被稱為擴增子)。因此，已知在使用引物對的核酸擴增的過程中，雙鏈擴增子在一個反應體系中指數性累積之後，隨著產生的互補擴增子鏈的累積量的增加，擴增反應速度會降低，會停止任一個(平臺期)。一旦達到平臺期之後不會產生核酸擴增，因此擴增子量不會增加。為了不達到這樣的平臺期而繼續增加擴增子的累積量，利用了對使用量設定一定的差的一對引物的「指數後的線型PCR(LATE-PCR) 」 (請參照如 JP 特表 2005-512577 號公報)。[0008]並且，在檢測融合基因的情況下，使用對於各變異體設定特異的引物的多重PCR的情況較多（請參照如JP特開2012-100628號公報）。在多重PCR中，必須準備多個引物且根據每個引物製作二聚物的可能性來進行優化。經由這種優化的過程再製作引物，必須進行關於可否通過實驗而進行測定的檢討。並且，隨著引物數的增加，這種優化的過程的難易度會提高，找出這種最佳的引物組為止需要大量的時間、勞力、以及成本。

【發明內容】

[0009]發明要解決的問題
[0010]但是，即使在使用目標基因序列和參照基因序列而進行核酸擴增、基於擴增產物的量比確定拷貝數的情況下，也為了分別擴增目標基因序列和參照基因序列，會使用不同的引物。如此使用不同的引物時，大多情況下的擴增效率不同。並且，在通過PCR技術進行核酸擴增的情況下，因存在前述的平臺期，當PCR循環數增多時，擴增產物量將會與原來的豐度無關地變成一定量。因此，即使要使用PCR技術來測定基因的豐度，也無法正確反映出原來的基因豐度。並且，在使用多重PCR的情況下，必須準備大量的引物，因此在優化的過程中，會產生費用方面、勞力方面、和/或時間方面等的問題。
[0011]因此，本發明的目的是提供一種相比現有技術更準確且簡便地測定出基因在對象樣品中的核酸中的豐度的基因豐度測定方法。
[0012]用於解決問題的手段
[0013]本發明為如下：
[0014][I] 一種基因豐度的測定方法，包括：在一個反應液中，使用第二引物和包括至少兩種第一引物的第一引物組對編碼至少兩個基因的核酸進行核酸擴增，其中，所述至少兩個基因在對象樣品中的核酸中的基因豐度有可能不同，所述至少兩種第一引物能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中且分別對應於所述至少兩個基因，所述第二引物用於擴增包括所述單一的額外鹼基序列的核酸，並獲得包含所述單一的額外鹼基序列且分別對應於所述至少兩個基因的至少兩種擴增產物；以及檢測基於所述至少兩種擴增產物的豐度的各自的信號，基於該信號測定出所述至少兩個基因的豐度。
[0015][2]根據[I]所述的測定方法，其中，所述第一引物具有所述單一的額外鹼基序列、以及能夠與編碼各個所述基因的核酸的擴增對象區域的鹼基序列進行雜交的鹼基序列。
[0016][3]根據[I]或[2]所述的測定方法，其中，所述第二引物具有能夠與所述單一的額外鹼基序列或其互補的鹼基序列進行雜交的鹼基序列。
[0017][4]根據[I]至[3]中任一項所述的測定方法，其中，所述單一的額外鹼基序列由與所述至少兩個基因的各擴增對象區域中的鹼基序列非同源的鹼基序列組成。
[0018][5]根據[I]至[4]中任一項所述的測定方法，其中，所述第一引物組包括所述第一引物以及第三引物，所述第三引物用於擴增該第一引物進行雜交的鹼基序列的互補鏈側的鹼基序列、並且不包含所述單一的額外鹼基序列。
[0019][6]根據[5]所述的測定方法，其中，所述反應液中的所述第三引物的豐度與所述反應液中的所述第一引物的豐度相比，以物質量基準為O. 25倍量~4倍量。
[0020] [7]根據[I]至[6]中任一項所述的測定方法，其中，所述第二引物在所述反應液中的豐度與所述第一引物組中包含的各引物各自在所述反應液中的豐度相比，以物質量基準為I倍量~400倍量。
[0021][8]根據[I]至[7]中任一項所述的測定方法，其中，所述反應液還包括分別識別所述至少兩種擴增產物的至少兩種檢測用探針。
[0022][9]根據[I]至[8]中任一項所述的測定方法，其中，所述第一引物包含選自相對擴增對象區域的鹼基序列錯配的鹼基以及簡併的鹼基組成的組的至少一者。
[0023][10]根據[I]至[9]中任一項所述的測定方法，其中，所述第二引物的Tm值高於所述第一引物的各Tm值。
[0024][11]根據[I]至[10]中任一項所述的測定方法，其中，所述第二引物還包括不同於所述單一的額外鹼基序列、以及其互補鹼基序列的額外序列。
[0025][12]根據[I]至[11]中任一項所述的測定方法，其中，所述至少兩個基因的至少一個是預先判明在對象樣品中的核酸中的豐度的參照基因，至少一個是作為在對象樣品中的核酸中的豐度的測定對象的目標基因。
[0026][13]根據[12]所述的測定方法，包括：對來自所述參照基因的擴增產物的檢測信號和來自所述目標基因的擴增產物的檢測信號進行比較，來確定所述目標基因在對象樣品中的核酸中的豐度。
[0027][14]根據[I]至[11]中任一項所述的測定方法，其中，所述至少兩個基因的至少一個是融合基因的融合點的上遊的5』側基因區域，至少一個是融合基因的融合點的下遊的3』側基因區域。
[0028][15]根據[14]所述的測定方法，包括：對來自所述5』側基因區域的擴增產物的檢測信號和來自所述3』側基因區域的擴增產物的檢測信號進行比較，來檢測樣品中的所述融合基因的存在。
[0029][16]根據[I]至[15]中任一項所述的測定方法，其中，所述至少兩個基因的豐度通過該基因的各個對應的至少兩個檢測信號的Tm分析而測定。
[0030][17]根據[I]至[16]中任一項所述的測定方法，其中，通過由同一波長取得的吸光度或螢光值，來獲得用於測定所述至少兩種基因的豐度的所述信號。
[0031][18]根據[16]或[17]所述的測定方法，其中，對Tm分析的結果進行面積分析，並確定在對象樣品中的核酸中的豐度。
[0032][19] 一種用於[I]至[4]以及[7]至[18]中任一項所述的測定方法的基因測定試劑盒，包括：第一引物組，所述第一引物組包括能夠將單一的額外鹼基序列導入到擴增產物中且對應於所述至少兩個基因的至少兩種的第一引物；以及第二引物，所述第二引物用於擴增包括所述單一的額外鹼基序列的核酸。
[0033][20] 一種用於[5]至[18]中任一項所述的基因測定試劑盒，包括：第一引物組，所述第一引物組包括能夠將單一的額外鹼基序列導入到擴增產物且各自對應於所述至少兩個基因的至少兩種的第一引物；第二引物，所述第二引物用於擴增包括所述單一的額外鹼基序列的核酸；以及第三引物，所述第三引物用於擴增所述第一引物進行雜交的鹼基序列的互補鏈側的鹼基序列且不包括所述單一的額外鹼基序列。
[0034] [21]根據[19]或[20]所述的基因測定試劑盒，還包括至少兩個檢測用探針，所述兩個檢測用探針具有能夠分別與所述至少兩個基因的核酸擴增區域進行雜交的鹼基序列且具備標記。
[0035][22]根據[21]所述的基因測定試劑盒，其中，所述標記為螢光標記。
[0036][23] 一種能夠應用[I]至[18]中任一項所述的基因的豐度的測定方法的基因測定裝置，包括：檢測部，所述檢測部檢測基於包括通過所述第一引物而導入的所述單一的額外鹼基序列且對應於通過所述第二引物而進行核酸擴增的所述至少兩個基因的擴增產物的豐度的至少兩個信號；以及運算部，所述運算部對通過所述檢測部而檢測的所述至少兩個檢測信號進行對比，運算出所述至少兩個基因的豐度。
[0037][24] 一種實施[I]至[18]中任一項所述的基因豐度的測定方法的基因測定系統，包括：檢測裝置，所述檢測裝置基於包括通過所述第一引物而導入的所述單一的額外鹼基序列且對應於通過所述第二引物而進行核酸擴增的所述至少兩個基因的擴增產物的豐度的至少兩個信號；以及運算裝置，所述運算裝置對通過所述檢測部而檢測的所述至少兩個檢測信號進行對比，運算出所述至少兩個基因的豐度。
[0038][25] 一種使用[I]至[18]中任一項所述的測定方法進行的基因診斷方法。 [0039]發明效果
[0040]根據本發明，可以提供相比現有技術更正確且簡便地測定出基因在對象樣品中的核酸中的豐度的測定方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖I的（A)是核酸混合物的解鏈曲線的一例，（B)是微分解鏈曲線的一例；
[0042]圖2A是示出本發明的實施例1涉及的Tm分析的結果的曲線圖；
[0043]圖2B是示出本發明的比較例I涉及的Tm分析的結果的曲線圖；
[0044]圖2C是示出本發明的比較例2涉及的Tm分析的結果的曲線圖；
[0045]圖2D是示出本發明的比較例3涉及的Tm分析的結果的曲線圖；
[0046]圖3是示出本發明的實施例2涉及的Tm分析的結果的曲線圖；
[0047]圖4是示出本發明的實施例3涉及的Tm分析的結果的曲線圖；
[0048]圖5是示出本發明的實施例4涉及的Tm分析的結果的曲線圖；
[0049]圖6是示出本發明的實施例5涉及的Tm分析的結果的曲線圖；
[0050]圖7是示出本發明的實施例6~8涉及的Tm分析的結果的曲線圖；
[0051 ]圖8是示出本發明的實施例9涉及的Tm分析的結果的曲線圖。
【具體實施方式】
[0052]本發明涉及基因的豐度的測定方法，包括：使用第二引物和包括至少兩種第一引物的第一引物組對編碼至少兩個基因的核酸進行核酸擴增，其中，所述至少兩個基因在對象樣品中的核酸中的基因豐度有可能不同，所述至少兩種第一引物能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中且分別對應於所述至少兩個基因，所述第二引物用於擴增包括所述單一的額外鹼基序列的核酸，並獲得包含所述單一的額外鹼基序列且分別對應於所述至少兩個基因的至少兩種擴增產物；以及檢測基於所述至少兩種擴增產物的豐度的各自的信號，基於該信號測定出所述至少兩個基因的豐度。
[0053]另外，本說明書中的「基因」中還包含示出基因的部分區域的「基因區域」。並且，「基因」只要通過鹼基序列編碼即可，不僅包含表達特定功能的，還包含不表達特定功能的基因。
[0054]本測定方法中，在使第二引物和包括指定第一引物的第一引物組存在於一個反應液中，並對所述至少兩個基因(以下稱為「測定對象基因」)的各自的核酸進行核酸擴增，因此通過使用指定的第一引物而進行的核酸擴增，在各個測定對象基因對應的多種擴增產物中導入單一的額外鹼基序列。因此，即使在反應液中存在多種測定對象基因，對應的擴增產物中也被導入單一的、即共通的額外鹼基序列。被導入這種單一的額外鹼基序列且對應於測定對象基因的多種核酸(或擴增產物)均包括一個共通的額外鹼基序列，因此可以通過一種的第二引物而一律進行核酸擴增。由此，即使反應液中存在的多個基因的豐度不同，來自通過同一第二引物的核酸擴增而獲得的各個基因的擴增產物的豐度也不同於使用不同引物的核酸擴增，反映出各基因的豐度。其結果為，相比現有技術更正確且簡便地測定出對象樣品中的核酸中至少兩種基因的豐度。
[0055]本發明中，關於被用作測定對象的試樣中的試樣核酸、檢測用探針、或引物的各個序列，只要不特別指出，基於這些相互互補關係而記載的事項還應用到各自的序列和相對於各序列互補的序列中。將本發明的事項應用到相對於各序列互補的該序列中時，關於該互補序列所識別的序列，在對本領域的技術人員而言屬於技術常識的範圍內，會將全部說明書替換為對應的本說明書中所述的序列的互補序列。
[0056]本發明中，「Tm值」是指雙鏈核酸解離的溫度(解離溫度:Tm)，通常定義為260nm處的吸光度達到吸光度全上升量的50%時的溫度。即，加熱包括雙鏈核酸例如雙鏈DNA的溶液時，260nm處的吸光度上升。這是因為雙鏈DNA中的雙鏈間的氫鍵由於加熱而解開，解離成單鏈DNA (DNA的解鏈)。而且，所有的雙鏈DNA解離成單鏈DNA時，其吸光度是示出加熱開始時的吸光度(僅為雙鏈DNA的吸光度)的約1.5倍，通過這些可以判斷出解鏈已完成。Tm值是基於這些現象而設定的。只要不特別指出，本發明的Tm值是指50%的鹼基形成雙鏈、剩下的50%解鏈成單鏈時的溫度。
[0057]本發明中的「模板核酸」或「模板」是指進行核酸擴增時將引物作為模板而進行退火處理的鹼基序列。
[0058]本發明中的「工序」的術語不僅包括獨立的工序，而且包括即使在不能明確區分於其他工序的情況下，只要能達到本工序的所期目的就被包括在本術語中。
[0059]並且，本發明中使用「~」而示出的數值範圍是表示包括「~」前後所述的數值各自作為最小值以及最大值的範圍。
[0060]並且，本說明書中，在組成物中存在多個對應於各成分的物質的情況下，只要不特別指出，組成物的各成分的量就是指組成物中存在的該多個物質的合計量。
[0061]以下說明本發明的內容。
[0062]〈基因豐度的測定方法〉
[0063] 本發明涉及的基因豐度的測定方法包括:在一個反應液中，使用第二引物和包括至少兩種第一引物的第一引物組對編碼至少兩個基因的核酸進行核酸擴增，其中，所述至少兩個基因在對象樣品中的核酸中的基因豐度有可能不同，所述至少兩種第一引物能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中且分別對應於所述至少兩個基因，所述第二引物用於擴增包括所述單一的額外鹼基序列的核酸，並獲得包含所述單一的額外鹼基序列且分別對應於所述至少兩個基因的至少兩種擴增產物(以下稱為「核酸擴增工序」)；以及檢測基於所述至少兩種的擴增產物的豐度的信號，基於該信號測定出所述至少兩個基因的豐度(以下稱為「豐度測定工序」)。
[0064]核酸擴增工序包括:在一個反應液中，使用第二引物和包括至少兩種第一引物的第一引物組對編碼至少兩個基因的核酸進行核酸擴增，其中，所述至少兩個基因在對象樣品中的核酸中的基因豐度有可能不同，所述至少兩種第一引物能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中且分別對應於所述至少兩個基因，所述第二引物用於擴增包括所述單一的額外鹼基序列的核酸，並獲得包含所述單一的額外鹼基序列且分別對應於所述至少兩個基因的至少兩種擴增產物。
[0065]所述反應液中包括至少兩種基因、即測定對象基因。
[0066]所述測定對象基因在對象樣品中的核酸中的基因豐度可相互不同，通常包括對象樣品中的核酸中的基因豐度不同的基因，但也可以包括同一個基因。對反應液中的所述測定對象基因進行編碼的鹼基序列相當於進行後述的核酸擴增時的被用作模板的核酸。
[0067]對於可被用作所述反應液中的核酸的供給源的試樣，並沒有特別的限制。例如可以舉出血液、口腔黏膜懸浮液、指甲以及毛髮等體細胞、生殖細胞、乳汁、腹水液、石蠟包埋組織、胃液、胃洗淨液、腹膜液、羊水、以及細胞培養等任意來自或有可能來自生物源的試樣。關於被用作模板的核酸，可以是從該來源獲得的狀態下直接使用，也可以是進行前處理而改變該樣品特性之後使用。
[0068]例如，將全血用作試樣的情況下，可以從全血中分離基因組DNA而調製測定對象基因的核酸。可以通過現有公知方法從全血中分離基因組DNA。可以使用例如市售的基因組DNA分離試劑盒(商品名為GFX Genomic Blood DNA Purificat1n kit;通用電氣醫療集團生命科學公司制)等。
[0069]反應液中的核酸可以是單鏈，也可以是雙鏈。作為反應液中的核酸序列，例如可以是DNA，也可以是總RNA、mRNA等的RNA。並且，在本發明中，由於使後述的多種引物存在於反應液中而進行核酸擴增，因此在核酸擴增工序後的反應液中也存在通過核酸擴增而產生的擴增產物。因此，作為本發明的反應液中的核酸，還包括這些擴增產物。
[0070]反應液中的所述測定對象基因只要為至少兩種基因，則有可能被用作本發明中的豐度的測定對象。優選地，所述測定對象基因的至少一個為預先判明對象樣品中的核酸中的豐度的參照基因，至少一個為對象樣品中的核酸的被用作測定對象的目標基因。如此，通過將測定對象基因的至少一個作為對象樣品中的核酸中的豐度已被判明的參照基因，能將參照基因的豐度作為參照(指標)而使用，可以容易地測定出目標基因的對象樣品中的核酸中的豐度。
[0071]在這裡，「對象樣品中的核酸中的豐度」是指指定大小的基因的拷貝數、I拷貝的整個基因所佔的對象樣品中核酸的大小、疾病相關的基因的增加或減少、相當於蛋白質翻譯時的功能域的基因內特定區域、串聯重複或微衛星等。在本發明涉及的測定方法中，例如從所述測定方法的靈敏度以及簡便性等的關聯方面考慮，優選將基因的拷貝數作為被用作測定對象的豐度。
[0072]作為能夠用作所述參照基因的基因，只要是預先判明個體間具有同等豐度的基因或豐度隨時間無變化而比較穩定的豐度的基因即可，不需要特別限制，可以舉出RNaseP、sod2X0L8AUgamma-actin等。並且，作為所述參照基因和所述目標基因的組合，沒有特別限制，可以在基因組地圖上在同一個染色體上，還可以是位於其他染色體上的在基因組地圖上遠離的位置，可以適當選擇，對於所述目標基因和所述參照基因的選擇並沒有特別的限制。
[0073]作為能夠用作所述目標基因的基因，根據被測定的豐度的利用目的而不同。例如可以舉出示出多態性的基因以及疾病引起的豐度增加或減少的基因，疾病引起的、鹼基序列中的喊基缺失的基因，以及通過樣品而表達水平改變的基因等。
[0074]並且，所述參照基因和目標基因的組合可以根據目標基因的性質而適當選擇。例如，在檢測個體間的拷貝數多態性的情況下，可舉出將預先判明個體間為同等豐度的基因作為參照基因、將顯示多態性的基因作為目標基因；在檢測作為疾病治療藥的目標的基因的豐度的情況下，將豐 度隨時間無變化且具有比較穩定豐度的基因用作參照基因，將疾病引起的、豐度增加或減少或鹼基缺失的基因作為目標基因；在檢測RNA表達水平的情況下，例如可以舉出將管家基因作為參照基因、將由於樣品而表達水平變化的基因作為目標基因。
[0075]並且，作為其他的實施例，優選所述測定對象基因的至少一個是融合基因的融合點上遊的5』側基因區域(以下也稱為「5』側基因區域」)，至少一個是融合基因的融合點下遊的3』側基因區域(以下也稱為「3』側基因區域」)。如此，通過對5』側基因區域的豐度和3』側基因區域的豐度進行比較，可以容易地檢測融合基因變異的有無等。
[0076]所述融合基因是只要以某基因的一部分和其他基因的一部分融合併作為一個基因而存在即可，不需要特別限制。具體可以舉出ALK融合基因，BCR-ABL融合基因，AML1-MTG8融合基因，RET融合基因，以及ROSl融合基因等。
[0077]以下，以ALK融合基因為例，進行具體的說明。
[0078]ALK 基因(NCBI 登記號 NM004304.4)進行對 ALK (anaplastic lymphoma kinase)受體酪氨酸激酶的編碼。
[0079]作為ALK融合基因例如已知J.C1n.0ncol.2009S印10 ；27(26) =4232-5中所記載的EML4-ALK融合基因以及KIF5B、KLCl、TFG等各種基因的融合基因。
[0080]在這裡，對於本發明的測定方法，僅關注了組成融合基因的任何一方的基因，只要測定並比較該基因的融合點上遊的5』側基因區域的豐度以及下遊的3』側基因區域的豐度即可。
[0081]融合點意味著不同的兩個基因融合時的邊界部分。例如ALK基因中第4125位鹼基(相當於序列號23中的第1760個鹼基)成為融合點。
[0082]另外，測定基因豐度的5』側基因區域以及3』側基因區域只要是融合點的上遊以及下遊的區域即可，並沒有特別的限制。測定基因豐度的5』側基因區域以及3』側基因區域離融合點有一個鹼基以上時，可以測定出基因的豐度，但優選充分遠離的區域，例如優選10個鹼基以上遠離，更優選約50個鹼基以上。
[0083]並且，核酸上有可能存在多個隨著融合基因變異而產生的融合點。因此，通過對應於被用作測定對象的融合基因變異的種類而適當設定從融合點到5』側基因區域以及3』側基因區域的距離，就能自由地變更可以檢測到的融合基因變異的種類，能檢測出更多的變異體(Variant)。[0084]另外，從融合點到基因區域的距離（鹼基數）以在與成為測定對象基因的5』側基因區域以及3』側基因區域進行雜交的引物中、與接近融合點的距離雜交的引物的5』末端作為基礎而計算出。
[0085]另外，在本說明書中，融合基因並不限於ALK融合基因。例如只要在GenBank等的資料庫中登錄的鹼基序列即可，可以是任何基因，與ALK融合基因同樣，可以應用到本發明涉及的方法中。
[0086]所述第一引物組包括第一引物，其是一種對測定對象基因中的擴增對象區域的雙鏈核酸分別進行擴增的引物組。所述第一引物可以將單一的額外鹼基序列導入到擴增產物中且各自對應於所述至少兩個基因的引物。
[0087]在這裡，所述擴增對象區域相當於對測定對象基因進行編碼的鹼基序列一部分的區域，優選40個鹼基長~5000個鹼基長，更優選50個鹼基長~1000個鹼基長，進一步優選60個鹼基長~200個鹼基長。通過將所述擴增對象區域設為這種範圍內的長度，有利於例如縮短所述核酸擴增工序中的反應時間的、緩和擴增阻礙影響、使多個核酸擴增可靠進行，以及測定精度的提聞等。
[0088]在這裡，「對應於所述至少兩個基因的各個」是指以能夠將在測定對象基因中有特徵的鹼基序列作為擴增對象區域而可以進行擴增。因此，在所述核酸擴增工序中，使用了與測定對象基因種類對應的數量的第一引物。
[0089]所述第一引物需要能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中。在這裡，「能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中」意味著不僅要產生包括由指定鹼基序列組成的所述單一的額外鹼基序列本身的擴增產物，還要產生包括與該指定鹼基序列互補的鹼基序列的擴增產物這兩方面的意思。
[0090]為了能夠在擴增產物中導入單一的額外鹼基序列，所述第一引物可以包括單一的額外鹼基序列，以及能夠以編碼所述測定對象基因的核酸的鹼基序列的一部分為模板進行核酸擴增的鹼基序列，它們之間可以包括連接序列。作為能夠以編碼所述測定對象基因的核酸的鹼基序列的一部分為模板進行核酸擴增的鹼基序列，例如可以是能夠與所述擴增對象區域的鹼基序列雜交的鹼基序列。例如，從操作的簡便性、測定方法的測定敏感度等觀點出發，第一引物優選所述單一的額外鹼基序列、以及可以與所述測定對象基因的擴增對象區域的喊基序列雜交的喊基序列的組合。
[0091]在這裡，「單一的額外鹼基序列」意味著對於一個用於測定的、有可能存在於一個反應液中的所有擴增產物，有可能是共通並被導入的一種類型（單一的）額外鹼基序列，還包含其互補序列。第一引物具有的「單一的額外鹼基序列」可以是任何一個所述單一的額外鹼基序列以及其互補的鹼基序列。以下，沒有特別指出的情況下，將所述擴增產物中導入的「單一的額外鹼基序列」以及第一引物具有的「單一的額外鹼基序列」統稱為「單一的額外鹼基序列」。
[0092] 作為這樣的單一的額外鹼基序列的構造（鹼基序列以及長度），沒有特別限制，可以選擇任意的序列。由於鹼基序列是在所有擴增產物內共通並被導入，因此優選由不同於至少兩個基因的各擴增對象區域中鹼基序列的鹼基序列組成的序列，更優選由不同於包括所述擴增對象區域以及該擴增對象區域相鄰的區域（如，1000個鹼基長以內的範圍）的區域的喊基序列組成的序列，進一步優選由反應液中存在的基因的喊基序列中不存在的喊基序列組成的序列。如此，有利於後述的第二引物引起的核酸擴增的精度的提高。在這裡，「不同於」意味著具有例如擴增對象區域50%以下，優選具有25%以下的同源性。
[0093]在這裡，「能夠與所述擴增對象區域的鹼基序列進行雜交的鹼基序列」意味著在通常的核酸擴增條件下，將對含有被用作擴增對象的鹼基序列的單鏈核酸（模板核酸）進行退火處理，具有可與模板核酸之間形成雙鏈核酸的序列。
[0094]關於可以與所述第一引物中的所述擴增對象區域的核酸序列進行雜交的鹼基序列，並沒有特別的限制，只要能夠對擴增對象區域中的模板核酸的鹼基序列進行擴增即可，對本領域的技術人員來說，可以基於被用作對象的基因的鹼基序列而進行適當的設計。
[0095]關於所述第一引物的「能夠進行雜交的鹼基序列」中包括對於模板核酸的鹼基序列完全互補的的鹼基序列，並且，在後述的核酸擴增條件下，對於完全互補的鹼基序列，在不明顯損傷單鏈核酸親和性的程度下，還可以包括缺失、取代、或附加一個或多個鹼基的鹼基序列。在插入、缺失、或取代鹼基的情況下，對於其插入、缺失、或取代的位置並沒有特別的限制。作為插入、缺失、或取代的鹼基數，可以舉出一個鹼基或兩個鹼基以上，雖然根據第一引物全體的長度而不同，但是例如可以舉出I個鹼基~10個鹼基，優選I個鹼基~5個喊基。
[0096]並且，在所述第一引物中優先通過後述的第二引物進行的核酸擴增，因此可以包括不同於前述的單一的額外鹼 基序列的種種額外鹼基或指定長度的額外鹼基序列（以下統稱為「調整用額外鹼基序列」）。這些調整用額外鹼基序列可以是單獨使用後述的鹼基序列，或可以是從後述中適當選擇的兩個以上的組合。
[0097]作為這樣的調整用額外鹼基序列，優選包括相對所述擴增對象區域的鹼基序列錯配鹼基以及簡併鹼基組成的組中選擇的至少一者。關於所述錯配鹼基以及簡併鹼基的種類以及鹼基數，並沒有特別的限制，但可以通過預測的Tm值的調整、對擴增效率的影響、同一個引物分子數的調整而設定。
[0098]並且，作為其他調整用額外鹼基，可以導入由尿嘧啶鹼基、AP位點、以及RNA鹼基組成的組中選擇的分解誘導鹼基。在導入這些分解誘導鹼基的情況下，獲得第一引物引起的擴增產物之後，通過分解這些分解誘導鹼基，可獲得能降低第一引物相對於擴增產物的Tm值、並且能夠優先進行第二引物引起的核酸擴增的優點。
[0099]所述第一引物的長度以及Tm值通常為12mer~60mer以及40°C~85°C,優選16mer~50mer以及50°C~80°C，但並不限於此。
[0100]並且，所述第一引物中的所述單一的額外鹼基序列以及能夠與所述基因的擴增對象區域的基因序列進行雜交的鹼基序列可以具有相同長度，也可以具有不同長度。
[0101]並且，所述第一引物中的所述單一的額外鹼基序列的位置可以是任何位置。優選為，所述單一的額外鹼基序列被配置在所述第一引物的5』末端。通過將所述單一的額外鹼基序列配置在與所述基因的擴增對象區域雜交的鹼基序列的5』末端側，例如不妨礙第一引物最初擴增測定對象基因時的反應。
[0102]第二引物是用於擴增包括通過所述第一引物組而擴增的所述單一的額外鹼基序列的核酸。如此，可以對包括所述單一的額外鹼基序列的擴增產物進一步進行核酸擴增，並在反應液中累積，所述擴增產物是使用包括所述第一引物的第一引物組而獲得的。
[0103]所述第二引物可以具有能夠與所述單一的額外鹼基序列或其互補的鹼基序列進行雜交的鹼基序列。為了防止第一引物的所述單一的額外鹼基序列以及第二引物的雜交等，優選具有可以與所述第一引物的一部分中包括的所述單一的額外鹼基序列的互補鹼基序列進行雜交的鹼基序列，即與所述第一引物的一部分中包括的所述單一的額外鹼基序列同源的鹼基序列。如此，能夠將包括所述單一的額外鹼基序列的擴增產物有效率且有效果地累積在反應液中。
[0104]所述第二引物在核酸擴增條件下，只要可以與所述單一的額外鹼基序列或其互補的鹼基序列之間形成雙鏈核酸，還可以是缺失、取代、或添加一個或多個鹼基的引物。在鹼基被插入、缺失、或取代的情況下，對於其插入、缺失、或取代的位置並沒有特別的限制。作為插入、缺失、或取代的鹼基數，可以舉出一個鹼基或兩個鹼基以上，根據第二引物全體長度而不同，但是例如可以舉出I個鹼基~10個鹼基，優選I個鹼基~5個鹼基。 [0105]優選所述第二引物包括相對所述第一引物的一部分中所包含的所述單一的額外鹼基序列同源的序列。如此，例如可以提高測定精度。在這裡，所述第二引物中，相對所述單一的額外鹼基序列「同源」意味著相對所述單一的額外鹼基序列具有80%以上的同源性。相對所述第二引物中的所述單一的額外鹼基序列同源的序列，優選相對所述單一的額外鹼基序列具有90%以上,最優選100%的同源性。
[0106]在所述第二引物中，為了能使所述第二引物引起的核酸擴增相比所述第一引物引起的核酸擴增優先進行，優選第二引物的Tm值(是指相對所述擴增產物的Tm值)高於第一引物的Tm值(是指相對於編碼所述至少兩個基因的各擴增對象區域或所述擴增產物的Tm 值)。
[0107]因此，第二引物是不同於所述單一的額外鹼基序列以及其互補鹼基序列的額外鹼基序列，能包括可以調整到聞於第一引物的Tm值的額外序列(以下稱為調整用額外喊基序列)。其結果為，對於所述擴增產物可以提高第二引物的Tm值。作為用於這種目的的額外序列，雖然沒有特別限制，但可以舉出GC含量高的鹼基序列等。
[0108]並且，可以在所述第二引物中導入人工核酸。作為這樣的人工核酸，可以舉出LNA、BNA、PNA 等。
[0109]並且，為了能使所述第二引物的Tm值高於所述第一引物的Tm值，可以導入RNA引物。還可以添加作為提高解鏈溫度的Tm增強劑的MGB (小溝組合劑)。
[0110]所述第二引物的長度以及Tm值通常為12mer~60mer以及40°C~85°C,優選16mer~50mer以及50°C~80°C，但並不限於此。
[0111]另外，在將所述第二引物的Tm值設定得高於所述第一引物的Tm值的情況下，優選所述第二引物的Tm值相比所述第一引物的Tm值高至少0.1°C、1°C、3°C、5°C。並且，優選所述第二引物的Tm值和所述第一引物的Tm值之差低於30°C、25°C、20°C。在此基礎上，優選所述第二引物的Tm值和所述第一引物的Tm值之差高於0.1°C~30°C，更優選高於1°C~30°C、3°C~30°C、5°C~25°C。
[0112]並且，在將所述第二引物的Tm值設定得高於所述第一引物的Tm值的情況下，優選所述第二引物的Tm值為50°C~85°C，以及所述第一引物的Tm值為40°C~75°C。並且，更優選所述第二引物的Tm值為55°C~80°C，以及所述第一引物的Tm值為50°C~75°C。
[0113]所述第一引物組是除了所述第一引物之外還包括其他引物，所述其他引物是為了擴增用作測定對象的基因的雙鏈核酸的另一方單鏈核酸。作為該另一方引物，可以是設計成同等於使能包括所述單一的額外鹼基序列的同等第一引物(由一對第一引物組成的組)，並且，可以是第三引物，所述第三引物是用於對所述第一引物進行雜交的單鏈互補鏈側的核酸擴增中且不包括所述單一的額外鹼基序列。第三引物是只要不包括所述單一的額外鹼基序列，具有對於所述第一引物識別的所述測定對象基因的單鏈互補鏈的核酸序列能夠進行雜交的核酸序列即可。
[0114]在所述第三引物涉及的「能夠進行雜交的鹼基序列」中，可以直接應用第一引物涉及的所記述內容。
[0115]並且，所述第二引物可以形成另一方引物和第二引物組，所述另一方引物是用於擴增具有所述第一的額外鹼基序列的雙鏈核酸的另一方核酸。作為所述第二引物組中包括的另一方引物，可以是由一對所述第二引物組成的組，並且也可以與所述第一引物組中包括的所述第三引物一起組成所述第二引物組。即在所述第一引物組包括所述第三引物的情況下，所述第一引物以及所述第二引物的各自形成一對(所述第一引物或所述第二引物和所述第三引物的組)，可以對所述測定對象基因的雙鏈核酸的雙方鹼基序列進行核酸擴增。
[0116]作為核酸擴增工序中使用的引物組，可以是例如一對第一引物組以及一對第二引物組的組合，第一引物以及第二引物和第三引物的組合。並且，在這種情況下，第一引物以及第二引物中可以包括所述調整用額外鹼基序列。
[0117]作為組合的示例，例如雖然不限於此，但可以舉出以下:
[0118]具有相對所述單一的額外鹼基序列以及所述測定對象基因的擴增對象區域的鹼基序列互補的鹼基序列的第一引物、不包括調整用額外鹼基序列的第二引物、以及第三引物的組合；
[0119]低於第二引物Tm值的第一引物、高於第一引物Tm值的第二引物、以及第三引物的
組合；
[0120]高於第二引物Tm值的第一引物，低於第一引物Tm值的第二引物、以及第三引物的
組合；
[0121]包括低於第二引物Tm值的調整用額外序列的第一引物、不包括錯配或簡併鹼基的第二引物、以及第三引物的組合；
[0122]包括低於第二引物Tm值的錯配或簡併鹼基等的調整用額外鹼基序列的第一引物、不包括錯配或簡併鹼基等的調整用額外鹼基序列的第二引物、以及第三引物的組合；
[0123]包括低於第二引物Tm值的調整用額外序列以及錯配或簡併鹼基的第一引物、不包括錯配或簡併鹼基等的調整用額外鹼基序列的第二引物、以及第三引物的組合；
[0124]相對於所述單一的額外鹼基序列以及測定對象基因的擴增對象區域的鹼基序列雙方不包括取代等的第一引物，包括高於第一引物Tm值的調整用額外鹼基序列的第二引物、以及第三引物的組合；
[0125]包括錯配或簡併鹼基等的調整用額外鹼基序列的第一引物、包括高於第一引物Tm值的錯配或簡併基因等的調整用額外鹼基序列的第二引物、以及第三引物的組合；以及
[0126]包括錯配或簡併鹼基的第一引物、包括高於第一引物Tm值的錯配或簡併鹼基以及調整用額外鹼基序列的第二引物、以及第三引物的組合。
[0127] 另外，這時與反應液中的測定對象基因對應的第一引物的組成可以是同種類(例如，由同時不包括錯配或簡併鹼基的第一引物組成)，也可以是不同種類(例如，一方應用不包括錯配或簡併鹼基的第一引物，另一方應用包括錯配或簡併鹼基的第一引物)，但從對多個測定對象基因以同一擴增效率進行核酸擴增的觀點等出發，優選同種類。
[0128]在使用第三引物的情況下，所述反應液中可以包括相對與該第三引物成對的所述第一引物量以物質量基準0.25倍量~4倍量的所述第三引物。如果為0.25倍量以上時，則例如有能夠不大大損傷第一引物和第三引物的擴增平衡的擴增的傾向，如果是4倍量以下，則例如可以獲得第二引物容易與第三引物的擴增產物發生反應等優點。
[0129]可以使第三引物的量等量於第一引物的量。並且，為了調節實際中使用的引物序列、試劑配方、以及獲得的檢測結果的數值，能夠增加或減少第三引物量來微調整並進行優化。因此，例如可以得到能調節參照基因或目標基因、或5』側基因區域或3』側基因區域的檢測信號強度的優點，除了這個優點，還可以得到能調節參照基因或目標基因的擴增效率的優點。
[0130]例如，從容易轉移到第二引物引起的反應中等方面來看，優選將第三引物量設為相對第一引物的豐度為以物質量基準約I倍~4倍，更優選I倍~2倍。
[0131]而且，在所述第三引物量少於所述第一引物量的情況下，例如因反應液中的第三引物的量少，以所述第一引物以及第二引物相互爭奪第三引物的方式發生反應。從這一點看，可獲得能夠準備很容易達到參照基因和目標基因的反應平臺的試劑的優點。這時，可以將第三引物量設為相比第一引物豐度以物質量基準約為0.25倍~I倍，更優選0.5倍~I倍。
[0132]並且，所述反應液可以包括以物質量基準與包括在所述第一引物組中的各引物相比等量或多量的所述第 二引物。因此，例如有能夠可靠地擴增通過第一引物組而進行核酸擴增的擴增產物等優點。並且，可以得到如下優點中的一個以上，所述優點包括:相比第一引物組引起的核酸擴增更容易轉移到第二引物組的核酸擴增中，可以獲得多量的第二引物引起的核酸擴增產物，以及防止第二引物的枯竭為原因引起的核酸擴增產物達到平臺期
坐寸ο
[0133]優選地，所述第二引物在所述反應液中的量是組成第一引物組的各引物中量多的一方的I倍量~400倍量(摩爾比)，優選為I倍量~40倍量(摩爾比)的多量，更優選為I倍~20倍(摩爾比)。通過將第二引物的反應液中的濃度設為組成所述第一引物組的各引物種量多的一方的濃度的I倍量以上，傾向於不損失擴增效率地在反應液中確切地累積擴增產物等，通過設為400倍量以下，傾向於防止非特異擴增、以及第一引物組引起的核酸擴增反應的不妨礙等。
[0134]為了同時滿足與所述第一引物的量比以及與所述第二引物的量比，所述反應液中可以包括所述第三引物。因此，可以同時具有上述優點。
[0135]另外，在所述核酸擴增工序中，各引物組中包括的各引物的長度可以是相同也可以是不相同。
[0136]作為核酸擴增的方法，優選的是使用聚合酶的方法，作為其例可以舉出PCR法、ICAN法、LAMP法以及NASBA法等。在通過使用聚合酶的方法而進行擴增的情況下，優選的是在後述的探針的存在下進行擴增。對於本領域技術人員來說，對應於使用的探針以及聚合酶而調整擴增的反應條件等是很容易的事情。
[0137]並且，作為用於PCR法的DNA聚合酶，使用通常被使用的DNA聚合酶，並沒有特別的限制。例如，可以舉出GeneTaq(日本基因公司制)，PrimeSTAR Max DNA Polymerase(寶生物工程株式會社制)，以及Taq聚合酶等。
[0138]作為聚合酶的使用量，只要為通常使用的濃度即可，並沒有特別的限制。例如在使用Taq聚合酶的情況下，優選的是相對反應液量50 μ I濃度設為0.01U~100U。
[0139]所述PCR擴增產物的解離(解離工序)中的加熱溫度為只要能解離所述擴增產物即可，並沒有特別的限制。例如為85°C~95°C。加熱時間也沒有特別的限制。通常為I秒~10分鐘，優選I秒~5分鐘。
[0140]並且，解離的單鏈核酸和所述引物各自之間的雜交是例如可以通過所述解離工序之後，降低所述解離工序中的加熱溫度而進行。作為溫度條件，例如為50°C~80°C。
[0141]關於溫度條件，在核酸擴增和反應過程中，可以設定成多個條件。例如在實行50個循環的PCR反應的核酸擴增反應中，可以將反應條件調整為55°C時實施前面的10個循環，65°C時實施後面的40個循環。
[0142]關於雜交工序的反應液中的各組成體積或濃度，並沒有特別的限制。作為具體例，所述反應液中的引物濃度例如為第一引物和第三引物是0.001 μ M~I μ Μ,優選0.01 μ M~
0.5 μ Μ,第二引物的濃度例如為0.01 μ M~10 μ Μ，優選0.05 μ M~5 μ Μ。
[0143]為了在後述的信號檢測工序中有效地檢測信號，所述反應液中可以包括對所述至少兩種擴增產物分別進行識別的至少兩種的檢測用探針。
[0144]作為所述檢測用探針，只要能檢測被用作目標的擴增產物即可，並沒有特別的限制。並且，作為檢測用探針的長度，並沒有特別的限制，優選5mer~50mer，更優選1mer~30mero探針的長度在這個範圍時，例如可以提高檢測敏感度。
[0145]關於所述檢測用探針，優選的是相對所述測定對象基因各自的核酸序列70%~100 %相同的序列，特別優選80 %以上相同。
[0146]並且，在將所述檢測用探針在核酸擴增工序中與引物同時存在而使用的情況下，為了被用作DNA聚合酶的反應對象而防止探針自身的延長，優選要麼在3』末端側中添加後述的螢光標記，要麼在探針的3』末端中再添加磷酸基。
[0147]從檢測效率性的觀點出發，優選檢測用探針是附加標記的標記化探針。
[0148]作為標記化探針中的標記物質的具體例，例如可以舉出螢光染料以及螢光團。作為所述標記化探針的具體例，例如優選以螢光染料作標記的、單獨顯示螢光且由於雜交體形成而螢光減少(例如為淬滅)的探針。
[0149]利用這樣的突光淬滅現象(Quenching phenomenon)的探針通常被稱為突光淬滅探針。其中，作為所述探針，優選的是寡核苷酸的3』區域(例如3』末端)或5』區域(例如5』末端)的鹼基被突光染料標記化,被標記化的所述鹼基優選的是胞嘧啶(C)。這時,在所述標記化探針進行雜交的檢測目標序列中，優選設計所述標記化探針的鹼基序列，使能與所述標記化探針的末端鹼基C成對的鹼基或從形成所述對的鹼基中遠離I~3個鹼基的鹼基為鳥嘌呤(G)。這樣的探針通常被稱為鳥嘌呤淬滅探針，已知為所謂的Q Probe0
[0150]這樣的鳥嘌呤淬滅探針在檢測目標序列中進行雜交時，顯示通過被螢光染料標記化的末端的C接近所述檢測目標序列中的G，而所述螢光染料的發光變弱(減少螢光強度)的現象。使用這樣的探針時，通過信號的變動，可以容易地確認雜交和解離。並且，所述標記物質可以結合在例如通常為核苷酸的磷酸基上。[0151]另外，除了使用Q Probe的檢測方法之外，可以使用公知的檢測方式。作為這樣的檢測方式，可以舉出Taq-man Probe法或RFLP法等。
[0152]作為所述螢光染料，並沒有特別的限制，例如可以舉出螢光素、若丹明、磷光體、以及聚甲炔染料衍生物等，作為市場上可買到的螢光染料，例如可以舉出BODIPY FL、FluorePrime、Fluoredite、FAM、Cy3以及Cy5、以及TAMRA等。由於試樣液中存在多個被用作測定對象的基因，因此可以在本發明中應用多個檢測用探針。這時優選使用的多個探針中可以使用的螢光染料的組合為，例如只要在不同條件下能檢測即可，並沒有特別的限制，例如可以舉出Pacific Blue (檢測波長為445nm~480nm), TAMRA (檢測波長為585nm~700nm)、以及BODIPY FL (檢測波長為520nm~555nm)的組合等。在使用同一個螢光染料的情況下，優選選擇相對所述檢測對象具有不同Tm值的檢測用探針。
[0153]並且，在所述檢測用探針為被螢光染料等標記化物質標記化的標記化探針的情況下，例如為了調節檢測的螢光強度等的信號強度，可以並用與所述標記化探針相同序列的未標記探針。關於未標記探針，例如可以在其3』末端中添加磷酸。
[0154]關於檢測用探針相對於所述反應液中核酸的添加比例(摩爾比)，並沒有特別的限制。相對試樣中的核酸，優選I倍以下，更優選0.1倍以下。因此，例如可以充分確保檢測信號。
[0155]所述檢測用探針相對於所述核酸的添加比例例如可以是相對雙鏈核酸的摩爾比，也可以是相對單鏈核酸的摩爾比。
[0156]所述豐度測定工序中包括檢測基於所述至少兩種擴增產物豐度的信號，以及基於該信號測定出所述至少兩個基因的豐度。
[0157]至少兩種擴增產物的豐度反映出至少兩種基因的豐度，因此通過測定基於核酸擴增工序中獲得的擴增產物的豐度的信號，可以測定出對象樣品中的核酸中基因的豐度。
[0158]可以通過獲得擴增產物的檢測信號(以下稱為信號檢測工序)、以及對比已獲檢測信號而測定豐度(以下稱為信號對比工序)，可以進行基因豐度的測定。
[0159]信號的檢測只要是能測定出反應液中累積的擴增產物的豐度的方法即可，對於信號種類也沒有特別的限制。
[0160]作為所述信號檢測工序，優選使用利用了可以檢測被用作目標的擴增產物的檢測用探針的檢測方法。
[0161]所述信號對比工序中包括通過對對應於所述信號檢測工序中獲得的各基因的各檢測信號進行對比而測定各基因豐度。關於所述檢測信號的對比以及從對比結果獲得的各基因豐度的測定方法，並沒有特別的限制。
[0162]例如從PCR循環數和擴增產物的累積量之間的關係，可以對比與所述基因對應的檢測信號而計算出各基因的豐度。
[0163] 這時，可以經過PCR循環數的同時逐次測定出反應液中的多個測定對象基因的擴增產物量，從獲得的測定結果測定測定對象基因的豐度。伴隨PCR循環數的擴增產物的量一般指數性擴增，但在一般的檢測方法中分為不能進行檢測的初期循環期、指數性增長並可以進行檢測的擴增期、以及反應速度下降的平臺期。在所述核酸擴增工序中，與所述檢測對象基因種類對應的多個擴增產物中均是通過第二引物而獲得的擴增產物，因此即使達到平臺期，也以與所述測定對象基因的豐度對應的量比累積在反應液中。因此，通過應用對所述擴增產物的種類進行識別的種類識別手段，能對來自於反應液中累積的所述測定對象基因的擴增產物進行識別，通過各自量比的測定，可以測定出各自測定對象基因的豐度。
[0164]作為所述種類識別手段，可以舉出固定了所述檢測用探針的Tm值、標記種類、以及探針的DNA微序列等。
[0165]並且，在所述測定對象基因包括參照基因和目標基因的情況下，從相對於參照基因的豐度的比率中，可以測定出目標基因的豐度。在所述測定對象基因為融合基因中的5』側基因區域和3』側基因區域的情況下，可以是從相對於5』側基因區域的豐度中測定出3』側基因區域的豐度，也可以是從相對於3』側基因區域的豐度中測定出5』側基因區域的豐度。
[0166]並且，所述豐度測定工序中，所述至少兩個基因的豐度可以是通過與該基因各自對應的至少兩個檢測信號的Tm分析而測定出。這時，作為所述信號檢測工序以及所述信號對比工序，更優選的是包括下述工序（I)~（IV)。另外，下述工序（I)可以與上述核酸擴增工序同時進行。
[0167](I)使所述檢測用探針和試樣中的單鏈核酸（擴增產物）接觸，獲得雜交體形成體(雜交工序）。
[0168](II)通過改變包括所述雜交體形成體的試樣的溫度，使所述雜交體形成體解離，測定出基於所述雜交體形成體解離的檢測信號的變動（測定工序）。
[0169](III)基於所述檢測信號的變動，檢測雜交體形成體的解離溫度Tm值（Tm值檢測工序）。
[0170](IV)基於所述Tm值，檢測所述試樣的單鏈核酸中被用作目標的擴增產物的存在或豐度比（豐度比檢測工序）。
[0171]在雜交工序中，通過所述檢測用探針和試樣中的單鏈核酸的接觸，能使兩者進行雜交。試樣中的單鏈核酸是例如通過解離上述中獲得的擴增產物而可以調製。
[0172]對於所述擴增產物的解離（解離工序）中的加熱溫度，只要能解離所述擴增產物即可，並沒有特別的限制。例如為85°C~95°C。對於加熱時間也沒有特別的限制。通常為I秒~10分鐘，優選I秒~5分鐘。
[0173]對於解離的單鏈核酸和所述檢測用探針之間的雜交，例如可以通過所述解離工序之後，降低所述解離工序中的加熱溫度而進行。作為溫度條件，例如為25°C~50°C。對於雜交工序的反應液中的各組成的體積以及濃度，並沒有特別的限制，可以應用通常的應用條件。
[0174]在測定工序中，漸漸加熱已獲的所述單鏈核酸和所述檢測用探針之間的雜交體形成體，並測定伴隨溫度上升的螢光信號的變動。例如，在使用Q Probe的情況下，與單鏈核酸進行雜交的狀態下，相比解離狀態螢光強度減少（或淬滅）。因此，例如只要漸漸加熱螢光正減少（或淬滅）的雜交體形成體，並測定伴隨溫度上升的螢光強度的增加即可。
[0175]對於測定螢光強度變動時的溫度範圍，並沒有特別的限制，例如開始溫度為室溫~85°C，優選25°C~70°C，結束溫度例如為40°C~105°C。並且，對於溫度的上升速度並沒有特別的限制，例如為O. I0C /秒~20°C /秒，優選O. 30C /秒~5°C /秒。
[0176]在 測定工序中，對用於所述至少兩種基因豐度的測定中的所述信號，優選通過同一個波長時取得的吸光度或螢光值而獲得。如此，通過簡單化的測定以及檢測，可以測定出所述測定對象基因的豐度。為了通過同一波長取得吸光度或螢光值，例如可以使用相同的檢測用探針的標記。這時，從檢測靈敏度的觀點出發，對於使用的各引物，優選不同的Tm值。
[0177]在Tm值檢測工序中，對所述信號的變動進行分析，並確定為Tm值。具體地，基於獲得的螢光強度計算出各溫度下的微分值(-d螢光強度/dt)，將顯示最低值的溫度確定為Tm值。並且，還可以將每單位時間的螢光強度增加量(螢光強度增加量/t)最高的點確定為Tm值。另外，作為標記化探針，在不使用淬滅探針，而使用了通過雜交體形成而增加信號強度的探針的情況下，相 反只要測定螢光強的減少量即可。
[0178]並且，可以代替加熱雜交體形成體而進行的伴隨溫度上升的螢光信號變動(優選螢光強度的增加)的測定，例如可以進行形成雜交體時的信號變動的測定。即，可以測定降低添加了所述探針的試樣的溫度並形成雜交體形成體時的伴隨所述溫度降低的螢光信號變動。
[0179]作為具體例，與未與互補序列中進行雜交的螢光強度相比，使用與互補序列雜交時的螢光強度減少(淬滅)的螢光標記探針(例如為Q Probe)的情況下，當將所述探針添加到試樣中時，所述探針處於解離狀態，因此螢光強度很大，但是當通過溫度的降低而形成雜交體形成體時，所述螢光減少(或淬滅)。因此，例如通過漸漸降低所述加熱的試樣的溫度而可以測定出溫度下降伴隨的螢光強度的減少。
[0180]另一方面，在使用通過雜交體形成而信號增加的標記化探針的情況下，當將所述探針添加到試樣中時，所述探針處於解離狀態，因此螢光強度很小(或淬滅)，但是當通過溫度的降低而形成雜交體體時，螢光強度增加。因此，例如只要漸漸降低所述試樣的溫度而測定出溫度的降低伴隨的螢光強度的增加即可。
[0181]在豐度比檢測工序中，基於所述Tm值而檢測所述試樣中的單鏈核酸中被用作目標的擴增產物，並基於該豐度檢測被用作測定對象的基因的豐度。
[0182]在所述信號檢測工序中獲得的所述擴增產物的檢測信號中，混雜了來自被用作測定對象的多個基因的多個擴增產物的信號。這些信號反映出各自的擴增產物的信號，因此通過對各自的檢測信號的比較對比，可以測定出測定對象基因的豐度，即對象樣品中的核酸中的豐度。特別是，在被用作測定對象的基因中包括預先判明了基因豐度的所述參照基因和所述目標基因的情況下，通過將參照基因的檢測信號用作基準，可以簡便地測定出所述目標基因的豐度。
[0183]並且，在被用作測定對象的基因為融合基因中5』側基因區域和3』側基因區域的情況下，通過對5』側基因區域的檢測信號和3』側基因區域的檢測信號的比較，可以簡便地檢測樣品中的融合基因的豐度。
[0184]作為基於檢測信號而測定基因豐度的方法，並沒有特別的限制，只要是可以為這種目的使用的分析方法，任何一種都能應用。
[0185]例如優選通過對上述信號的Tm分析中獲得的解鏈曲線進行對比而測定基因的豐度，所述基因豐度的測定具有可以高精度且簡便地測定被用作目標的基因的豐度等優點。
[0186]作為這樣的Tm分析方法，可以優選舉出W02009/081965以及W02010/001969等中記載的內容。
[0187]作為Tm分析方法的優選的一例，以下陳述關於將測定對象基因作為參照基因和目標基因，對Tm分析結果進行面積分析，並確定各自基因的對象樣品的核酸中的豐度的方法。
[0188]圖1的(A)中示出通過某任意的目標基因和參照基因的核酸混合物的溫度和吸光度或螢光強度等的檢測信號之間的關係而表示的解鏈曲線，以及圖1的(B)中示出通過溫度和檢測信號的微分值之間的關係而表示的解鏈曲線(也稱為微分解鏈曲線)。通過從這種微分解鏈曲線中的峰值的檢測，檢測參照基因的核酸R的解鏈溫度Tm,以及目標基因的核酸T的解鏈溫度TmT，並設定包括TmK以及TmT的各自的溫度範圍。
[0189]作為包括TmK的溫度範圍ΛΤΚ，可以設定例如Tm1^P TmT之間的檢測信號的微分值為最小的溫度為下限，檢測信號的峰值部分對應的溫度為上限的溫度範圍。並且，作為包括Tm1的溫度範圍Λ Tt，可以設定例如Tm,和TmT之間的檢測信號的微分值為最小的溫度為下限，檢測信號的峰值部分對應的溫度為上限的溫度範圍。
[0190]另外，溫度範圍ΛΤΚ以及溫度範圍ΛΤτ可以設定成同一寬度(例如為10°C)或不同寬度(例如溫度範圍ΛΤΚ* 10°C，溫度範圍八1\為7V)。並且，溫度範圍ΛΤΚ以及溫度範圍Λ Tt可以設定成各自的解鏈溫度Tm中加X°C、減X°C的寬度(X°C例如在15°C以內，最好是10°C以內)。
[0191]接著，對於各自的溫度範圍ΛΤΚ以及溫度範圍Λ Tt，求出經過對應於微分解鏈曲線的溫度範圍的下限的點和對應於上限的點的直線、以及微分解鏈曲線包圍的面積。作為面積的求出方法的一例，具體如以下方式可以求出。將溫度T中的檢測信號的微分值作為f (T)，將溫度T中的基值作為B(T)，通過下述(I)式能求出。
[0192]面積S = {f (Tsh) -B (Ts+1)} + {f (Ts+2) -B (Ts+2)}
[0193]+- + {f (V1)-B (Te^1)I (I)
[0194]其中，Ts為各溫度範圍中的下限值，Te為上限值。並且，各溫度T中的基值B (T)是通過下述(2)式而求出的值，表示了檢測信號中包括的背景值。從檢測信號的微分值中減去這個基值，就能除去檢測信號中包括的背景值的影響。
[0195]B(T) = aX (T-Ts)+f (Ts)(2)
[0196]其中，a= {f (Te) -f (Ts)} / (Te-Ts)。
[0197]根據上述⑴式以及⑵式，可以求出各核酸的溫度範圍ΛΤΚ中的面積&以及溫度範圍ΛΤτ中的面積St，計算出面積比和各核酸豐度比之間的關係。例如橫軸上標註豐度比(對應核酸總量的目標基因T的比率)，縱軸上標註面積比(ST/SK)。另外，面積比可以是由ST/SK確定。
[0198]在這裡，預先已判明了參照基因的豐度，因此通過參照基因的面積和目標基因的面積之間的對比，可以確定目標基因的豐度。
[0199]另外，對於如上述預先已知具體豐度的測定對象基因，可以製作校準曲線而進行目標基因的定量。
[0200]使用如上述的方法製作的校準曲線，測定出被用作測定對象的多個基因的豐度。對於豐度的測定，可以是通過作為測定對象的基因中、與一個基因的豐度進行對比而獲得其他基因的相對豐度，還可以是基於一個基因的具體豐度而獲得其他基因的具體豐度。將一個基因用作參照基因的情況下，可以將目標基因豐度作為基於參照基因豐度的相對量而獲得，並且還可以作為具體的量而獲得。在作為豐度而求出拷貝數的情況下，對來自所述參照基因的擴增產物檢測信號和來自目標基因的擴增產物檢測信號之間進行比較，並確定所述目標基因的拷貝數。
[0201]另外，即使對於測定對象基因為5』側基因區域以及3』側基因區域的情況，通過與上述方法同樣的方法，對來自5』側基因區域的擴增產物檢測信號以及來自3』側基因區域的擴增產物檢測信號進行對比，並檢測樣品中的融合基因的豐度。
[0202]
[0203]本發明涉及的基因測定試劑盒是用於前述基因測定方法的試劑盒，包含所述的第一引物組和所述第二引物，所述第一引物組包括前述的第一引物。
[0204]根據本測定試劑盒，可以簡便地測定出豐度不同的測定對象基因的豐度。
[0205]並且，除所述第一引物以及第二引物之外，所述測定試劑盒中還可以含有前述的第二引物。
[0206]對於本基因測定試劑盒中的所述第一引物、所述第二引物、以及所述第三引物，可以直接應用前述的事項。
[0207]並且，所述測定試劑盒中可以包括至少兩個檢測用探針，所述檢測用探針具有能夠分別於所述至少兩個基因的核酸擴增區域進行雜交的核酸序列且具備標記。由此，通過使用檢測探針，可以進一步簡便地測定出豐度不同的測定對象基因。作為所述測定試劑盒中包括的所述檢測用探針，優選的是所述標記為突光標記。對於所述標記以及突光標記，可以直接應用前述的事 項。
[0208]並且，所述測定試劑盒除了探針之外還可以包括本發明涉及的測定方法中的進行核酸擴增所需的試劑類。並且，對於所述各探針、所述各引物、以及其他的試劑類，可以分別收納，也可以將它們的一部分製成混合物。
[0209]另外，對於「分別收納」，只要各試劑區分開以能維持非接觸狀態即可，不需要一定收納在可以獨立操作的個別容器中。
[0210]本發明的測定試劑盒優選包括操作說明書或使用說明書。所述操作說明書中記載了使用包括所述第一引物的所述第一引物組和第二引物，針對包括測定對象基因的試劑製作微分解鏈曲線，並進行其Tm值分析而測定出測定對象基因的豐度。所述使用說明書中記載了測定試劑盒中包括的或可以附加性包括的各種試劑。
[0211]並且，本發明的測定試劑盒可以用於融合基因變異的檢測中。例如作為ALK融合基因測定試劑盒，可以舉出包括所述第一引物組(例如序列號為19以及21)和第二引物(例如序列號為22)的測定試劑盒，所述第一引物組中包括了可以擴增ALK基因中的特定基因區域的第一引物。並且，ALK融合基因測定試劑盒可以是包括所述第一引物組(例如序列號為19以及21)、第二引物(例如序列號為22)、以及第三引物(例如序列號為18以及20)的測定試劑盒，所述第一引物組中包括了可以擴增ALK基因中的特定基因區域的第一引物。
[0212]〈基因測定裝置〉
[0213]本發明涉及的基因測定裝置是可以應用前述基因豐度測定方法的裝置，包括檢測部以及運算部。所述檢測部檢測基於包含通過所述第一引物而導入的所述單一的額外鹼基序列且對應於通過第二引物而進行核酸擴增的所述至少兩個基因的擴增產物豐度的至少兩個信號。所述運算部是對所述檢測部檢測的所述至少兩個檢測信號進行對比，並運算出所述至少兩個基因的豐度。
[0214]只要是本基因測定裝置，就能更簡便地實施前述的本發明涉及的基因豐度的測定方法。
[0215]關於所述檢測部，只要可以檢測檢測信號即可，並沒有特別的限制，例如對應於被使用的檢測用探針的種類，可以適當地選擇。例如當檢測用探針為螢光標記探針時，可以包括突光檢測器。
[0216]所述運算部是基於通過檢測部獲得的各檢測信號而運算出反應液中的測定對象基因的豐度。
[0217]運算中包括：例如對解鏈曲線的檢測信號進行關於溫度的微分，並運算出表示溫度和檢測信號的微分值之間關係的微分解鏈曲線；對於微分解鏈曲線，設定預先製作校正曲線時設定的溫度範圍；各自求出對應於測定對象基因的面積，所述面積為經過微分解鏈曲線的溫度範圍的下限對應的點和上限對應的點的直線、以及微分解鏈曲線包圍的面積；運算出已獲的面積的比；以及基於預先製作的校正曲線而運算出測定對象基因對應的豐度比。
[0218]作為具備所述檢測部以及運算部的裝置，可以使用任何一種公知的裝置。例如可以直接應用W02009/081965以及W02010/001969等中記載的裝置。
[0219]〈基因測定系統〉
[0220]本發明涉及的基因測定系統是可以應用前述基因豐度測定方法的裝置，包括檢測裝置以及運算裝置。所述檢測裝置檢測基於包含通過所述第一引物而導入的所述單一的額外鹼基序列且對應於通過第二引物而進行核酸擴增的所述至少兩個基因的擴增產物豐度的至少兩個信號。所述運算裝置是對所述檢測部檢測的所述至少兩個檢測信號進行對比，運算出所述至少兩個基因的豐度。
[0221]只要是本基因測定裝置，就能更簡便地實施前述的本發明涉及的基因豐度的測定方法。
[0222]對於本系統中使用的檢測裝置以及運算裝置，可以直接應用上述基因測定裝置中記述的檢測部以及運算部。
[0223]並且，與所述測定裝置同樣，對於所述測定裝置以及運算裝置，例如可以直接應用W02009/081965以及W02010/001969等中記載的裝置。
[0224]〈基因診斷方法〉
[0225]本發明中的基因診斷方法是使用上述的基因測定方法而進行的診斷方法。
[0226]根據本發明，基於對象樣品中的核酸中的豐度不同的至少兩個基因的豐度，就可以進行這些豐度相關的疾病、藥物代謝能力、以及藥物耐受性等的診斷。
[0227]優選地，測定對象基因的豐度為拷貝數量，並將本發明應用到拷貝數多態性的診斷中，所述診斷的指標之一是對象樣品中的核酸中拷貝數的增減。作為將拷貝數變異用作指標之一的疾病，可以舉出染色體lq21. I的拷貝數變異引起的神經胚細胞瘤等。根據本發明，可以高精度地診斷出這些疾病、藥物代謝能力、以及藥物耐受性有關的基因豐度的檢測。
[0228]實施例
[0229]以下，對本發明的實施例進行詳細的說明。但是，本發明不限於這些實施例。另外，除非特別指出」為質量基準。
[0230][實施例1]
[0231]將CYP2D6基因用作目標基因，測定了人CYP2D6基因的特定區域序列(序列號I)的豐度。作為參照基因，使用了人sod2基因的特定區域序列(序列號2)。另外，CYP2D6基因的基因組鹼基序列能夠作為GenBank NG008376獲得，sod2基因的基因組鹼基序列能夠作為 GenBank NG008729 獲得。
[0232]調製將序列號I或序列號2的核酸序列插入到PUC57的人工核酸(質粒)，為了改變CYP2D6的拷貝數，根據表1而準備了各種質粒溶液的試樣a~d。使用這些質粒溶液，調製了以指定拷貝數含有目標基因以及參照基因的各種試樣(各種模板)。
[0233][表 I]
【權利要求】
1.一種基因的豐度的測定方法，包括： 在一個反應液中，使用第二引物和包括至少兩種第一引物的第一引物組對編碼至少兩個基因的核酸進行核酸擴增，其中，所述至少兩個基因在對象樣品中的核酸中的基因豐度有可能不同，所述至少兩種第一引物能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中且分別對應於所述至少兩個基因，所述第二引物用於擴增包括所述單一的額外鹼基序列的核酸，並獲得包含所述單一的額外鹼基序列且分別對應於所述至少兩個基因的至少兩種擴增產物；以及 檢測基於所述至少兩種擴增產物的豐度的各自的信號，基於該信號測定出所述至少兩個基因的豐度。
2.根據權利要求1所述的測定方法，其中， 所述第一引物具有所述單一的額外鹼基序列、以及能夠與編碼各個所述基因的核酸的擴增對象區域的鹼基序列進行雜交的鹼基序列。
3.根據權利要求1或2所述的測定方法，其中， 所述第二引物具有能夠與所述單一的額外鹼基序列或其互補的鹼基序列進行雜交的鹼基序列。
4.根據權利要求1至3中任一項所述的測定方法，其中， 所述單一的額外鹼 基序列由與編碼所述至少兩個基因的核酸的各擴增對象區域中的鹼基序列非同源的鹼基序列組成。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的測定方法，其中， 所述第一引物組包括所述第一引物以及第三引物，所述第三引物用於擴增該第一引物進行雜交的鹼基序列的互補鏈側的鹼基序列、並且不包含所述單一的額外鹼基序列。
6.根據權利要求5所述的測定方法，其中， 所述反應液中的所述第三引物的豐度與所述反應液中的所述第一引物的豐度相比，以物質量基準為O. 25倍量~4倍量。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的測定方法，其中， 所述第二引物在所述反應液中的豐度與所述第一引物組中包含的各引物各自在所述反應液中的豐度相比，以物質量基準為I倍量~400倍量。
8.根據權利要求1至7中任一項所述的測定方法，其中， 所述反應液還包括分別識別所述至少兩種擴增產物的至少兩種的檢測用探針。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的測定方法，其中， 所述第一引物包含選自相對擴增對象區域的鹼基序列錯配的鹼基以及簡併的鹼基組成的組的至少一者。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的測定方法，其中， 所述第二引物的Tm值高於所述第一引物的各Tm值。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的測定方法，其中， 所述第二引物還包含不同於所述單一的額外鹼基序列、以及其互補的鹼基序列的額外序列。
12.根據權利要求1至11中任一項所述的測定方法，其中， 所述至少兩個基因的至少一個是預先判明在對象樣品中的核酸中的豐度的參照基因，至少一個是作為在對象樣品中的核酸中的豐度的測定對象的目標基因。
13.根據權利要求12所述的測定方法，包括: 對來自所述參照基因的擴增產物的檢測信號和來自所述目標基因的擴增產物的檢測信號進行比較，來確定所述目標基因在對象樣品中的核酸中的豐度。
14.根據權利要求1至11中任一項所述的測定方法，其中， 所述至少兩個基因的至少一個是融合基因的融合點上遊的5』側基因區域，至少一個是融合基因的融合點下遊的3』側基因區域。
15.根據權利要求14所述的測定方法，包括: 對來自所述5』側基因區域的擴增產物的檢測信號和來自所述3』側基因區域的擴增產物的檢測信號進行比較，來檢測樣品中的所述融合基因的存在。
16.根據權利要求1至15中任一項所述的測定方法，其中， 所述至少兩個基因的豐度通過與該基因的各個對應的至少兩個檢測信號的Tm分析而測定。
17.根據權利要求1至16中任一項所述的測定方法，其中， 通過由同一波長取得的吸光度或螢光值，來獲得用於測定所述至少兩種基因的豐度的所述信號。
18.根據權利要求16或17所述的測定方法，其中， 對Tm分析的結果進行面積分析，並確定在對象樣品中的核酸中的豐度。
19.一種用於權利要求1至4以及權利要求7至18中任一項所述的測定方法的基因測定試劑盒，包括: 第一引物組，所述第一引物組包括能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中且對應於所述至少兩個基因的各個的至少兩種的第一引物；以及 第二引物，所述第二引物用於擴增包含所述單一的額外鹼基序列的核酸。
20.一種用於權利要求5至18中任一項所述的測定方法的基因測定試劑盒，包括: 第一引物組，所述第一引物組包括能夠將單一的額外鹼基序列導入擴增產物中且對應於所述至少兩個基因的各個的至少兩種的第一引物； 第二引物，所述第二引物用於擴增包含所述單一的額外鹼基序列的核酸；以及 第三引物，所述第三引物用於擴增所述第一引物進行雜交的鹼基序列的互補鏈側的鹼基序列且不包含所述單一的額外鹼基序列。
21.根據權利要求19或20所述的基因測定試劑盒，還包括: 至少兩個檢測用探針，所述兩個檢測用探針具有能夠分別與所述至少兩個基因的核酸擴增區域進行雜交的鹼基序列且具備標記。
22.根據權利要求21所述的基因測定試劑盒，其中， 所述標記為突光標記。
23.一種能夠應用權利要求1至18中任一項所述的基因的豐度的測定方法的基因測定裝置，包括: 檢測部，所述檢測部檢測基於包含通過所述第一引物導入的所述單一的額外鹼基序列且對應於通過第二引物而進行核酸擴增的所述至少兩個基因的擴增產物的豐度的至少兩個信號，以及運算部，所述運算部對通過所述檢測部而檢測的所述至少兩個檢測信號進行對比，並運算出所述至少兩個基因的豐度。
24.一種實施權利要求1至18中任一項所述的基因的豐度的測定方法的基因測定系統，包括: 檢測裝置，所述檢測裝置檢測基於包含通過所述第一引物而導入的所述單一的額外鹼基序列且對應於通過第二引物而進行核酸擴增的所述至少兩個基因的擴增產物的豐度的至少兩個信號，以及 運算裝置，所述運算裝置對由所述檢測部而檢測的所述至少兩個檢測信號進行對比，運算出所述至少兩個基因的豐度。
25.一種使用權利要求1至18中任一項所述的測定方法進行的基因診斷方法。
【文檔編號】C12Q1/68GK104024433SQ201280053730
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年10月29日 優先權日:2011年10月31日
【發明者】細見敏也, 伊集院萌子 申請人:愛科來株式會社