一種黑牛肝菌母種保藏方法
2023-07-13 04:18:06
一種黑牛肝菌母種保藏方法
【專利摘要】本發明涉及一種黑牛肝菌母種保藏方法，所述方法包括在固體培養基上培養菌絲以及取菌絲塊將其放入裝有滅菌蒸餾水的容器中，密封容器，在10℃～15℃恆溫保藏。本發明還涉及一種黑牛肝菌母種保藏用培養基以及該培養基在黑牛肝菌培養和/或保藏中的用途。
【專利說明】一種黑牛肝菌母種保藏方法【技術領域】
[0001]本發明涉及一種黑牛肝菌母種保藏方法，屬於食用真菌栽培【技術領域】。
【背景技術】
[0002]黑牛肝菌(/%76^0/瓜5 /70_Τ--?/7?05.?),也名暗褐網柄牛肝菌,是熱帶地區珍貴的、最受消費者喜愛的食用菌，也是目前牛肝菌科(Aohiaceae)脈柄牛肝菌屬(/%7?^ο/7?5.)中唯一一種可以用腐生栽培方法培養的牛肝菌，分布於斯裡蘭卡、越南、印度尼西亞、泰國、巴西、墨西哥、澳大利亞、紐西蘭及我國雲南、廣西和海南等地。黑牛肝菌品質鮮嫩、味道鮮美、營養價值豐富、高蛋白、低脂肪，富含17種人體必需胺基酸及豐富的磷、鉀、鈣、鎂、鐵、鋅等人體必須的礦質元素，是較好的健康食品並具有很好的藥用價值，深受消費者喜愛。在自然環境中常生長於鳳凰木(從?JrOfliz regia)fern咖啡(CbiTeaaraAica )、柚子(CYtras grand is)和菠蘿蜜 ClriocarjDW1S he terophyllus )等樹下和附近的草地上，和土壤中根粉蚧也有密切關係，其特殊的生活方式正在研究中。目前已可用栽培腐生菌的方式進行人工栽培，以及接種鳳凰木、咖啡、柚子、芒果寄主樹等寄主樹進行仿生栽培。
[0003]但是黑牛肝菌母種的保藏一直是個難題。黑牛肝菌是一種高溫食用菌，適宜菌絲生長的最適溫度28°C~30°C。在現有的技術條件下，其菌種不能像腐生食用菌那樣進行保藏。發明人多年對黑牛肝菌菌種保藏的實踐經驗表明，一般微生物菌種常規使用的低溫保藏法及液氮超低溫保藏法都不能有效的保藏黑牛肝菌菌種。4°C低溫保藏法，保藏15天後，菌絲死亡；液氮超低溫保藏，試驗了在保護劑中添加20%甘油及添加20%甘油、5%海澡糖兩種處理進行菌種保藏，保藏6個月進行活化，結果表明:保護劑中添加20%甘油的處理，菌種全部死亡；保護劑添加20%甘油、5%海藻糖的處理，有10%菌絲塊萌發生長，但後期的栽培試驗結果表明菌株發生了嚴重退化、菌絲弱、形成菌皮多、出菇不整齊、子實體重量減輕以及減產嚴重。因此，在食用真菌栽培【技術領域】存在對簡便高效的保藏黑牛肝菌母種的方法的迫切需求。
【發明內容】
[0004]本發明的目的之一在於提供一種操作簡便、可長期保持菌株活力的黑牛肝菌母種保藏方法，以解決黑牛肝栽培及科學研究中其菌種難於保藏的問題，並為其他牛肝菌及菌根食用菌菌種保藏提供借鑑。本發明的另一目的在於提供一種黑牛肝菌母種保藏用培養基以及該培養基在黑牛肝菌培養和/或保藏中的用途。
[0005]本發明一方面涉及一種黑牛肝菌(/%76^0/7?5.PoriefliolSW1S)的保藏方法,所述方法包括:
1)在固體培養基上培養菌絲，
其中所述固體培養基包括: 紅壤土100~200 g葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素BI 100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g
水1000ml
pH4.5~6.5 ;以及
2)取菌絲塊將其放入裝有滅菌蒸餾水的容器中，密封容器，在10°C~15°C恆溫保藏。
[0006]在一個【具體實施方式】中，步驟2)中的菌絲塊大小為0.5 cm~I cm X0.5 Cm~I Cm的菌絲塊。
[0007]在一個【具體實施方式】中， 步驟2)中的所述容器選自玻璃容器和塑料容器。
[0008]在一個【具體實施方式】中，步驟2)中的所述容器選自保藏專用管、試管和培養瓶。
[0009]在一個【具體實施方式】中，步驟2)中的恆溫保藏在具有恆定溫度能力的裝置和/或環境中進行。
[0010]本發明另一方面涉及一種黑牛肝菌的保藏方法，所述方法包括:
1)採集野生的黑牛肝菌子實體，用組織分離法取牛肝菌的組織塊接種於固體培養基中，於28°C~30°C恆溫培養25天~30天以獲得菌絲，
其中所述固體培養基包括:
紅壤土100~200 g
葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素BI 100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5 ;
2)從步驟(1)得到的菌絲切取0.5 cm~I cm X0.5 cm~I cm的菌絲塊放於裝有滅菌蒸
餾水的試管中，每支試管放入菌絲塊3塊~5塊，用塞子塞緊試管口；於10°C~15°C的恆溫箱中保臧。
[0011]本發明另一方面涉及一種黑牛肝菌菌種保藏方法，包括如下步驟:
(I)用改良的培養基配方培養黑牛肝菌母種，母種培養基配方及配製方法如下: a:培養基配方
紅壤土100~200 g葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素B1 100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5
b:配製方法
取1000 ml水，放入紅壤土，煮沸5分鐘，然後過濾，取濾液，加水定容至1000 ml，加入配方中其餘成份，灌入規格25X200的試管中，灌入量每支20 ml，121°C滅菌20分鐘，然後擺成斜面；
(2)母種培養:採集野生的黑牛肝菌子實體，用組織分離法取黑牛肝菌的組織塊接種於步驟(1)配製的培養基中，於28°C~30°C恆溫培養，25天~30天菌絲長滿培養基，得黑牛肝菌母種；
(3)母種保藏存儲管制作:用18X180規格的試管,每支試管裝蒸懼水10ml~15ml,然後常規滅菌待用；將步驟(2)得到的黑牛肝菌母種,切取0.5 cm~Icm X0.5 Cm~I Cm的菌絲塊放於已滅菌試管裝的蒸餾水中，每支試管放入3塊~5塊，用矽膠塞塞緊試管口，得母種存儲管；
(4)母種保藏溫度:步驟(3)得到的母種存儲管放於10°C~15°C的恆溫箱中保藏；
(5)母種活力及栽培性狀檢驗:步驟(4)保存的黑牛肝菌母種，分別於保藏半年、I年、3年、5年後活化菌株，擴繁菌種，再培養成液體菌種，液體菌種接種袋裝基質人工栽培黑牛肝菌，檢驗菌種活力及栽培性狀，結果如下:a、菌種擴繁菌絲生長快，用活化菌絲體接種於試管裝斜面培養基，接種後25天菌絲長滿斜面；b、用「a」擴繁的菌絲體接種液體培養基培養液體菌種，接種第3天開始形成菌球,至第9天時菌球顏色金黃、色澤明亮,大小均勻、分布於液體培養基中，為菌球旺盛生長期；C、將「b」培養的液體菌種接種固體基質人工栽培黑牛肝菌，接種後第3天菌絲吃料，第50天菌絲長滿基質，然後覆土培養出菇，覆土第10天出菇且整齊，平均每個菌袋產子實體100g-120g，能實現黑牛肝菌規模化栽培。
[0012]本發明另一方面涉及一種固體培養基，其包括:
紅壤土100~200 g
葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素BI 100~200ug瓊脂粉15.0~20.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5。
[0013]本發明另一方面涉及一種固體培養基在黑牛肝菌培養和/或保藏中的用途，所述固體培養基，其包括:
紅壤土100~200 g
葡萄糖10.0~20.0 g
酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g
CaCl20.5 ~1.0 g
ZnSO40.5 ~1.0 g
FeSO40.5 ~1.0 g
維生素BI 100~200ug 瓊脂粉15.0~ 20.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5。
[0014]本發明涉及的固體培養基的成分包括但不限於紅壤土、葡萄糖、酵母浸出汁、NH4NO3' CaCl2' ZnSO4' FeSO4、維生素 B1、瓊脂粉和水。
[0015]如本文所用，數值範圍包括上限值、下限值以及上限值與下限值之間的任意數值。例如，「紅壤土 100~200 g」指紅壤土的含量可以為100g、200g以及100g與200g之間的任意數值選項，例如IOlg, 125g、150g、175g、199g等。
[0016]使用本發明的方法及培養基保藏黑牛肝菌母種，其菌絲活力及菌種栽培性狀與一代母種相同。本發明可保存黑牛肝菌母種活力及優良性狀達5-10年以上，解決了黑牛肝菌菌種保藏難的難題，為規模化栽培提供了有力保障。
[0017]本發明的優點在於:利用本發明涉及的方法保藏黑牛肝菌菌種方法簡便有效，設備簡單，解決了高溫食用菌菌種難於保藏的難題，可長時期(5-10年)保存黑牛肝菌菌株活力及優良性狀，為實現黑牛肝菌規模化生產提供了有力保障，具有較高的應用價值、經濟意義及社會意義。
實施例
[0018]在以下實施例中進一步描述本發明，所述實施例示出了實施本發明的簡要方法，但不限定其所有可能變型。
[0019]實施例1
(I)用改良的培養基配方培養黑牛肝菌母種，母種培養基配方及配製方法如下:
a:培養基配方
紅壤土100 g
葡萄糖10.0 g
酵母浸出汁 l.0g
NH4NO31.0gCaCl20.5 g
ZnSO40.5 g
FeSO40.5g
維生素B1 100.0ug 瓊脂粉15.0 g
水1000ml
pH4.5 ~6.5
b:配製方法
取1000 ml水，放入紅壤土，煮沸5分鐘，然後過濾，取濾液，加水定容至1000 ml，加入配方中其餘成份，灌入規格25X200的試管中，灌入量每支20 ml，121°C滅菌20分鐘，然後擺成斜面。
[0020](2)黑牛肝菌母種培養:採集野生的黑牛肝菌子實體，用組織分離法取黑牛肝菌的組織塊接種於步驟(1)配製的培養基中，28°C恆溫培養，25天菌絲長滿培養基，得黑牛肝菌母種。
[0021](3)母種保藏存儲管制作:用18X180規格的試管，每支試管裝蒸餾水10 ml，然後常規滅菌待用；將步驟(2)得到的黑牛肝菌母種，切取0.75 cm X0.75 cm的菌絲塊放於已滅菌試管裝的蒸餾水中，每`支試管放入3塊，用矽膠塞塞緊試管口，得母種存儲管。
[0022](4)母種保藏溫度:步驟(3)得到的母種存儲管放於10°C的恆溫箱中保藏。
[0023](5)母種活力及栽培性狀檢驗:將步驟(3)保存的黑牛肝菌菌種，在保藏2半年後活化菌株，擴繁菌種，再培養成液體菌種，液體菌種接種袋裝基質人工栽培黑牛肝菌，檢驗菌種活力及栽培性狀，結果:a、菌種擴繁菌絲生長快，用活化菌絲體接種於試管裝斜面培養基，接種後25天菌絲長滿斜面；b、用「a」擴繁的菌絲體接種液體培養基培養液體菌種，接種第3天開始形成菌球，至第9天時菌球顏色金黃、色澤明亮，大小均勻、分布於液體培養基中，為菌球旺盛生長期；C、將「b」培養的液體菌種接種固體基質人工栽培黑牛肝菌，接種後第3天菌絲吃料，第50天菌絲長滿基質，然後覆土培養出菇，覆土第10天出菇且整齊，平均每個菌袋產子實體120.8g，菌種活力及栽培性狀較佳。
[0024]實施例2-3
作為優選，實施例2-3中母種培養基配製、母種培養、母種保藏存儲管制作及保藏溫度、母種活力及栽培性狀檢驗與實施例1相同，不同之處見表1。
[0025]表1
【權利要求】
1.一種黑牛肝菌(/%76^ο/7?5.portentosus)的保藏方法,所述方法包括: 1)在固體培養基上培養菌絲， 其中所述固體培養基包括: 紅壤土100~200 g 葡萄糖10.0~20.0 g 酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g CaCl20.5 ~1.0 g ZnSO40.5 ~1.0 g FeSO40.5 ~1.0 g 維生素BI100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g 水1000ml pH4.5~6.5 ;以及 2)取菌絲塊將其放入裝有滅菌蒸餾水的容器中，密封容器，在10°C~15°C恆溫保藏。
2.根據權利要求1的方法，其中在步驟2)中菌絲塊大小為0.5 cm~I cm X0.5 cm~Icm的菌絲塊。
3.根據權利要求1或2的方法，其中步驟2)中的所述容器選自玻璃容器和塑料容器。
4.根據權利要求3的方法，其中步驟2)中的所述容器選自保藏專用管、試管和培養瓶。
5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中步驟2)中的恆溫保藏在具有恆定溫度能力的裝置和/或環境中進行。
6.一種黑牛肝菌的保藏方法，所述方法包括: 1)採集野生的黑牛肝菌子實體，用組織分離法取牛肝菌的組織塊接種於固體培養基中，於28°C~30°C恆溫培養25天~30天以獲得菌絲， 其中所述固體培養基包括: 紅壤土100~200 g 葡萄糖10.0~20.0 g 酵母浸出汁 1.0~2.0g NH4NO31.0 ~2.0g CaCl20.5 ~1.0 g ZnSO40.5 ~1.0 g FeSO40.5 ~1.0 g 維生素BI 100~200ug 瓊脂粉15.0~20.0 g 水1000ml pH4.5 ~6.5 ;2)從步驟(1)得到的菌絲切取0.5 cm~I cm X0.5 cm~I cm的菌絲塊放於裝有滅菌蒸餾水的試管中，每支試管放入菌絲塊3塊~5塊，用塞子塞緊試管口；於10°C~15°C的恆溫箱中保藏。
7.—種固體培養基，其包括:紅壤土100~200 g葡萄糖10.0~20.0 g酵母浸出汁1.0~2.0gNH4NO31.0 ~2.0gCaCl20.5 ~1.0 gZnSO40.5 ~1.0 gFeSO40.5 ~1.0 g維生素BI100~200ug瓊脂粉15.0~20.0 g水1000mlpH4.5 ~6.5。
8.權利要求7的固體`培養基在黑牛肝菌培養和/或保藏中的用途。
【文檔編號】C05G3/00GK103766138SQ201310546293
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年11月7日 優先權日:2013年11月7日
【發明者】石建同 申請人:石泉