一種格瑞克黴素和p-1894b的生物合成基因簇及其應用的製作方法

2023-10-31 04:21:02

專利名稱：一種格瑞克黴素和p-1894b的生物合成基因簇及其應用的製作方法
技術領域：
:本發明屬於微生物基因工程領域，具體涉及一組角環素(angucycline)抗生素，格瑞克黴素(grincamycin)和P-1894B(vineomycin Al)的生物合成基因簇及其應用。
背景技術：
:格瑞克黴素和P-1894B是一類由角環素為骨架連接5個糖配基所組成的抗生素，具有很好的抗各種腫瘤細胞和革蘭氏陽性細菌的活性，其結構式如

圖1所示。角環素是指通過聚酮生物合成途徑形成十聚酮鏈而產生的具有角四環即苯並蒽環(Benz[a]anthracene)結構並不含糖配基的化合物。角環素類化合物分別於1965及1966年被Dann和Kunstmann and Mitscher等人首次報導過。微生物次級代謝產物生物合成是由多酶體系參與的，這些多酶體系中的各個酶系按照一定的組織結構協調起作用。聚酮化合物均是由多酶體系PKS催化醯基-CoA活化的底物之間的重複脫梭縮合而合成的。所有角環素類化合物都是由II型PKS形成的具有廣泛生物活性及化學多樣性的芳香多聚酮類化合物，其生物活性主要包括抗腫瘤、抗菌、抗病毒、酶抑制、血小板凝集抑制以及免疫調節等。由於角環素結構骨架及其糖配基數量和種類上的多樣性，目前已發現天然的角環素類化合物總數超過170多個。目前有許多典型的角環素類型化合物的生物合成被報導，如wrdamycins，landomycins, gaudimycins, simocyclinone, oviedomycin。角環素類天然產物在過去十幾年裡由於其顯著的生物活性及多樣的糖基團而引起了許多科學家的關注。除了從自然界中獲得典型的天然角環素類化合物，通過組合生物合成的手段對角環素類化合物生物合成基因簇進行改造也已經獲得一些新的具有顯著生物活性的角環素類衍生化合物。另外，可以通過對化合物生物合成途徑的了解，對一些化合物結構進行修飾，得 到目標的化合物，或者通過對一些調控基因進行改造，可以達到提高目標化合物產量的目的。由於存在角環素化合物的毒性及可溶性問題，目前並沒有該類化合物進入臨床試驗藥物的報導，所以可以通過組合生物合成的手段，對該類化合物進行定向修飾，從而能夠得到具有用藥前景的角環素類化合物。組合生物合成是近20年發展起來的一種合成天然產物結構多樣性，用以發現和發展藥物的新方法。它尤其適合於化學方法難以合成的那些複雜的生物大分子化合物。由於分子遺傳工程、基因工程的發展，以及基因組學和蛋白質組學等學科研究的不斷深入，諸多與微生物代謝相關的生物合成基因和蛋白功能被認知與掌握。通過生物信息學和微生物遺傳學手段可確定基因簇中的各模塊或結構域的功能，如將這些模塊或結構域進行多種「自由」組合就可能產生核心環合成和功能基團各異的新型「非天然」天然產物。組合生物合成和代謝工程在篩選和發展新型藥物方面日益成為生物、化學和醫藥界關注的重點。基於聚酮和聚肽類天然產物的獨特化學結構和良好生物活性，研究它們的生物合成機制，將為合理化遺傳修飾生物合成途徑獲得結構類似物提供遺傳和生物化學的基礎，實現利用現代生物學和化學的技術手段在微生物體內進行藥物開發的目的。發明內容:本發明的第一個目的是提供一種格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇。本發明的格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇來源於鏈黴菌Streptomyceslusitanus SCSIO LR32，其特徵在於，該生物合成基因簇是從包含有整個格瑞克黴素和P-1894B生物合成基因簇的coSmidl79F中測序獲得的，該格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第3722 40612位的鹼基序列所示，包含30個基因，具體為:(I)負責格瑞克黴素和P-1894B的角環素骨架合成的基因，即gcnH、gcn1、gcnJ共3個基因:gcnH位於基因簇核苷酸序列(SEQ ID N0.1，下同)第11220-12500個鹼基處，長度為1281個鹼基對，編碼酮基合成酶，426個胺基酸；gcnl位 於基因簇核苷酸序列第12497-13717個鹼基處，長度為1221個鹼基對，編碼II型PKS鏈延伸因子模塊，406個胺基酸；gcnj位於基因簇核苷酸序列第13794-14063個鹼基處，長度為270個鹼基對，編碼醯基載體蛋白，89個胺基酸；(2)負責格瑞克黴素和P-1894B的角環素骨架後修飾的基因，即gcnA、gcnC、gcnF、gcnK、gcnL、gcnM、gcnP、gcnT、gcnU 共 9 個基因:gcnA位於基因簇核苷酸序列第3722-4840個鹼基處，長度為1119個鹼基對，編碼氧化還原酶，372個胺基酸；gcnC位於基因簇核苷酸序列第6612-7211個鹼基處，長度為600個鹼基對，編碼NADPH-依賴型黃素單核苷酸還原酶，199個胺基酸；gcnF位於基因簇核苷酸序列第9396-10883個鹼基處，長度為1488個鹼基對，編碼氧化還原酶，495個胺基酸；gcnK位於基因簇核苷酸序列第14192-14977個鹼基處，長度為786個鹼基對，編碼酮基還原酶,261個胺基酸；gcnL位於基因簇核苷酸序列第14998-15933個鹼基處，長度為936個鹼基對，編碼環化酶，311個胺基酸；gcnM位於基因簇核苷酸序列第15935-17923個鹼基處，長度為1989個鹼基對，編碼氧化還原酶，662個胺基酸；gcnP位於基因簇核苷酸序列第32089-33624個鹼基處，長度為1536個鹼基對，編碼羧基轉移酶，511個胺基酸；gcnT位於基因簇核苷酸序列第37801-39597個鹼基處，長度為1797個鹼基對，編碼氧化還原酶，598個胺基酸；gcnU位於基因簇核苷酸序列第39587-40612個鹼基處，長度為1026個鹼基對，編碼氧化還原酶，341個胺基酸；(3)負責格瑞克黴素和P-1894B的脫氧糖合成的基因，即gcnSl、gcnS2、gcnS3、gcnS4、gcnS5、gcnS6、gcnS7、gcnS8 共 8 個基因:gcnSl位於基因簇核苷酸序列第21799-22293個鹼基處，長度為495個鹼基對，編碼NDP-己糖3，5-異構酶，164個胺基酸；
gcnS2位於基因簇核苷酸序列第23455-24522個鹼基處，長度為1068個鹼基對，編碼dNDP-葡糖合成酶，355個胺基酸；gcnS3位於基因簇核苷酸序列第24519-25502個鹼基處，長度為984個鹼基對，編碼dNDP-葡糖4，6脫水酶，327個胺基酸；gcnS4位於基因簇核苷酸序列第25537-26547個鹼基處，長度為1011個鹼基對，編碼NDP-己糖4-酮基還原酶,336個胺基酸；gcnS5位於基因簇核苷酸序列第26550-27854個鹼基處，長度為1305個鹼基對，編碼NDP-己糖3，4-脫水酶，434個胺基酸；gcnS6位於基因簇核苷酸序列第27907-28671個鹼基處，長度為765個鹼基對，編碼NDP-己糖4-酮基還原酶,254個胺基酸；gcnS7位於基因簇核苷酸序列第29709-31112個鹼基處，長度為1404個鹼基對，編碼NDP-己糖2，3-脫水酶，467個胺基酸；gcnS8位於基因簇核苷酸序列第31109-32068個鹼基處，長度為960個鹼基對，編碼NDP-己糖3-酮基還原酶,319個胺基酸；(4)負責格瑞克黴素和P-1894B的脫氧糖轉移的基因，即gcnGl、gcnG2、gcnG3共3個基因:gcnGl位於基因簇核苷酸序列第19194-20486個鹼基處，長度為1293個鹼基對，編碼O-糖基轉移酶，430個胺基酸；gcnG2位於基因簇核苷酸序列第20516-21730個鹼基處，長度為1215個鹼基對，編碼O-糖基轉移酶，404個胺基酸；gcnG3位於基因簇核苷酸序列第22296-23426個鹼基處，長度為1131個鹼基對，編碼C-糖基轉移酶，376個胺基酸；(5)負責格瑞克黴素和P-1894B調控子蛋白和轉運子的基因，即gcnB、gcnD、gcnN、gcnR共4個基因:gcnB位於基因簇核苷酸序列第5064-6581個鹼基處，長度為1518個鹼基對，編碼轉運蛋白，505個胺基酸；gcnD位於基因簇核苷酸序列第7242-8081個鹼基處，長度為840個鹼基對，編碼TetR家族的轉錄調控蛋白，279個胺基酸；gcnN位於基因簇核苷酸序列第17936-19153個鹼基處，長度為1218個鹼基對，編碼轉運蛋白，405個胺基酸；gcnR位於基因簇核苷酸序列第36424-37134個鹼基處，長度為711個鹼基對，編碼正調控調節子，236個胺基酸；(6)負責格瑞克黴素和P-1894B脫氧糖脫氫修飾的基因，即gcnQl個基因:gcnQ位於基因簇核苷酸序列第34148-35737個鹼基處，長度為1590個鹼基對，編碼FAD/FMN依賴型脫氫酶，529個胺基酸；(7)其它功能尚未明確的蛋白，gcnE、gcnO共2個基因:gcnE位於基因簇核苷酸序列第8228-9070個鹼基處，長度為843個鹼基對，編碼未知功能蛋白，280個胺基酸；gcnO位於基因簇核 苷酸序列第28700-29653個鹼基處，長度為954個鹼基對，編碼未知功能蛋白，317個胺基酸；(8)格瑞克黴素和P-1894B生物合成基因簇的上下遊基因，即orf (_3)、orf (_2)、orf (-1)和 orf (+1)共 4 個基因:orf (-3)位於基因簇核苷酸序列第1_600個鹼基處，長度為600個鹼基對，編碼推測的保守蛋白，199個胺基酸；orf (-2)位於基因簇核苷酸序列第763-2388鹼基處，長度為1626個鹼基對，編碼蘋果酸合成酶，541個胺基酸；orf (-1)位於基因簇核苷酸序列第2682-3605個鹼基處，長度為924個鹼基對，編碼推測的保守蛋白，307個胺基酸；orf (+1)位於基因簇核苷酸序列第40952-41908個鹼基處，長度為957個鹼基對，編碼膜輸出蛋白，編碼318個胺基酸；SEQ ID N0.1 (序列表)所示序列的第3722 40612位的鹼基序列的互補序列可根據DNA鹼基互補原則隨時得到。且第3722 40612位的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)或用合適的限制性內切酶酶切相應的DNA或DNA體外合成技術或使用其他合適的技術得到。本發明提供了得到至少包含部分SEQ ID N0.1所示序列的第3722 40612位 中DNA序列的重組DNA載體的途徑。本發明還提供了產生格瑞克黴素和P-1894B生物合成基因被中斷或其他基因改造的途徑，至少其中之一的基因包含有SEQ ID N0.1所示序列的第3722 40612位中的核苷酸序列。本發明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法或包含本發明SEQ ID N0.1所示序列的第3722 40612位的DNA作為探針以Southern雜交等方法從其他生物體中得到與格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇相似的基因。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用於從鏈黴菌Streptomyces lusitanus SCSIO LR32基因組文庫中定位更多的文庫質粒。這些文庫質粒至少包含本發明中的部分序列，也包含有Streptomyces lusitanus SCSIO LR32基因組中鄰近區域未克隆的DNA。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被體內、體外修飾或進行突變，包括插入、置換或缺失，聚合酶鏈式反應，錯誤介導聚合酶鏈式反應，位點特異性突變，不同序列的重新連接，序列的不同部分或與其他來源的同源序列進行定向進化，或通過紫外線或化學試劑誘變等。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過合適的表達體系在外源宿主中表達以得到相應的酶或其他更高的生物活性物質或產量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈黴菌、小單孢菌、假單孢菌、芽孢桿菌、酵母、植物和動物等。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過遺傳重組來構建重組載體以獲得新型生物合成途徑，也可以通過插入、置換、缺失或失活進而獲得其他新型生物合成途徑或者產生新的化合物。包含DNA片段或基因可以用來提高格瑞克黴素和P-1894B或其衍生物的產量，本發明提供了在基因工程微生物中提高產量的途徑。本發明所提供的胺基酸序列可以用來分離所需要的蛋白並可用於抗體的製備。
包含本發明所提供的胺基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些胺基酸之後仍有生物活性甚至有新的生物學活性，或者提高了產量或優化了蛋白動力學特徵或其他致力於得到的性質。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達並了解它們在宿主代謝中的功能。本發明還提供了格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇在製備格瑞克黴素或/和P-1894B及其類似物中的應用。本發明還提供了如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列在製備化合物P-1894B中的應用。所述的應用是將如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列轉入鏈黴菌S.coelicolor中異源表達產生化合物P-1894B。本發明還提供了 FAD/FMN依賴型脫氫酶的編碼基因gcnQ，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第34148-35737位鹼基所示。一種上述編碼基因gcnQ編碼的FAD/FMN依賴型脫氫酶GcnQ。FAD/FMN依賴型脫氫酶GcnQ在催化脫氧糖L-玫紅糖(L-rhodinose)末端糖基脫氫氧化成L-aculose中的應用。FAD/FMN依賴型脫氫酶GcnQ在催化化合物Ia產生化合物Ic和/或化合物Ib中的應用，所述的化合物Ia其結構如式Ia所示,所述的化合物Ic其結構如式Ic所示,所示的化合物Ib即為P-1894B ；

產？ c 產/丫丫
&1aI丨1c7
W wrsOFAD/FMN依賴型脫氫酶GcnQ在催化化合物2a產生化合物2c和/或化合物2b中的應用，所述的化合物2a其結構如式2a所示，所述的2c其結構如式2c所示，所述的化合物2b其結構如式2b所示；
權利要求
1.一種格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇，其特徵在於，該格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第3722 40612位的鹼基序列所示。
2.權利要求1所述的格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇在製備格瑞克黴素或/和P-1894B及其類似物中的應用。
3.如SEQID N0.1所示的核苷酸序列在製備化合物P-1894B中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，是將如SEQID N0.1所示的核苷酸序列轉入鏈黴菌S.coelicolor中異源表達產生化合物P-1894B。
5.一種FAD/FMN依賴型脫氫酶的編碼基因gcnQ，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQIDN0.1的第34148-35737位鹼基所示。
6.一種權利要求5所述的FAD/FMN依賴型脫氫酶的編碼基因gcnQ編碼的FAD/FMN依賴型脫氫酶GcnQ。
7.權利要求6所述的FAD/FMN依賴型脫氫酶GcnQ在催化脫氧糖L-玫紅糖末端糖基脫氫氧化成L-aculose中的應用。
8.權利要求6所述的FAD/FMN依賴型脫氫酶GcnQ在催化化合物Ia產生化合物Ic和/或化合物Ib中的應用，所述的化合物Ia其結構如式Ia所示，所述的化合物Ic其結構如式Ic所示,所示的化合物Ib即為P-1894B ；
9.FAD/FMN依賴型脫氫酶GcnQ在催化化合物2a產生化合物2c和/或化合物2b中的應用，所述的化合物2a其結構如式2a所示，所述的2c其結構如式2c所示，所述的化合物2b其結構如式2b所示；
10.FAD/FMN依賴型脫氫酶GcnQ在催化化合物3a產生化合物3c中的應用，所述的化合物3a其結構如式3a所示，所述的化合物3c其結構如式3c所示；
全文摘要
本發明公開了一種格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇及其應用。格瑞克黴素和P-1894B的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3722～40612位的鹼基序列所示。本發明所提供的包含格瑞克黴素和P-1894B生物合成相關的所有基因和蛋白信息，可以幫助人們理解角環素類天然產物的生物合成機制，為進一步遺傳改造提供了材料和知識。本發明所提供的基因及其蛋白質也可以用來尋找和發現可用於醫藥、工業或農業的化合物或基因、蛋白。
文檔編號C12N15/31GK103215281SQ20131011857
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月3日 優先權日2013年4月3日
發明者鞠建華, 張雲, 黃洪波, 劉靜, 馬俊英 申請人:中國科學院南海海洋研究所