miR‑21的模擬物、抑制物及其重組表達載體與應用的製作方法
2023-10-04 21:28:39
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及一種mir-21的模擬物和一種抑制物及後者的重組表達載體及其用途。
背景技術：
肝臟是機體的重要器官，具有儲存、代謝、生物轉化、解毒、造血、合成膽色素、分泌、再生等功能。研究肝再生相關基因對肝細胞增殖和肝再生的作用，對揭示肝再生機制、構建人工肝、建立治療和預防肝病方法等都有重要理論意義和應用價值。
microrna(mirna)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈rna分子，它們在動植物中參與轉錄後基因表達調控。到目前為止，在動植物以及病毒中已經發現有28645個mirna分子。大多數mirna基因以單拷貝、多拷貝或基因簇的形式存在於基因組中。
研究表明，mir-21出現於多種生物，能調節包括faslg在內的多種靶基因作用。faslg是死亡受體fas的配體，一方面，faslg與fas結合後，引起fas的聚合，後者通過胞質區的死亡結構域招募接頭蛋白fadd和caspase-8/10酶原，形成死亡誘導信號複合體disc。caspase-8酶原在複合物中通過自身切割而被激活，活化的caspase-8/10將胞質中的促凋亡分子bid剪切，形成活性分子tbid(truncatedbid)，tbid進入線粒體，導致細胞色素c從線粒體釋放到細胞質，進入細胞質的細胞色素c與凋亡相關因子1(apaf-1)結合形成複合體，進而激活caspase-9。被激活的caspase-9又通過激活其它caspase誘導細胞凋亡；或者活化的caspase-8/10直接切割執行者caspase-3酶原，產生有活性的caspase-3，導致細胞凋亡。另一方面，faslg與fas結合後，也可通過與死亡結構域相關蛋白daxx結合激活促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶5(mapkkk5)，後者通過磷酸化級聯反應激活下遊的mekk3/6、mkk4/7和jnk。jnk通過使線粒體外膜通透性發生改變，促進細胞色素c釋放和活化凋亡複合體的形成，引起細胞的凋亡。或者通過激活p38mapk途徑導致細胞的凋亡。
mir-21的模擬物體內促細胞增殖的原理是用基因轉染的方法將模擬物導入受體細胞，該模擬物與faslg的3′-utr結合，導致faslg表達水平降低，從而阻遏fas的促凋亡作用，促進細胞增殖；mir-21的抑制物體內發揮作用的原理是設計並構建重組載體，其內含有mir-21的抑制物核苷酸序列，用基因轉移的方法將重組載體導入受體細胞，通過載體過表達mir-21的抑制物核苷酸序列，此抑制物核苷酸序列與mir-21定點結合，從而抑制mir-21與faslg的3′-utr結合，faslg表達水平增加，與fas結合水平增加，從而促進fas的促細胞凋亡作用。
技術實現要素：
本發明提供了一種mir-21的模擬物及抑制物，該模擬物及抑制物可用於調節faslg蛋白表達，以及調節肝細胞增殖或凋亡的基礎醫學和臨床醫學的研究，有利於為開發相關藥物提供高效的、大通量的篩選和評價平臺及手段，將大大促進mirna在腫瘤預防、診斷和治療中的應用。
本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
本發明提供了一種mir-21的模擬物，所述模擬物為seqidno.1。
本發明還提供了一種能抑制mir-21結合faslg的3′-utr的抑制物，所述抑制物選自faslg的3′-utr中長約700～1000bp區段；所述抑制物與mir-21的結合位點為ataagcta。
在根據本發明的一個實施方案中，所述抑制物為seqidno.2。
在根據本發明的一個實施方案中，所述抑制物核苷酸序列的5′和3′末端分別添加限制性酶切位點；優選地，所述限制性酶切位點在酶切後產生粘性末端；更優選地，所述的限制性酶切位點分別為xhoi和noti對應的核苷酸序列；所述xhoi酶切位點位於5′末端，所述noti酶切位點位於3′末端。
本發明進一步提供了一種重組表達載體，所述重組表達載體包含上述mir-21的抑制物。
在根據本發明的一個實施方案中，所述重組表達載體中的標記基因為雙螢光素報告酶。
在根據本發明的一個實施方案中，所述重組表達載體是通過將上述的mir-21抑制物連接到報告載體psi-check-2中得到的。
本發明還提供了上述mir-21的模擬物及抑制物在製備用於促進肝再生的藥物中的應用；優選的，所述促進肝再生的藥物為抑制細胞凋亡相關蛋白faslg表達和/或促進肝細胞增殖相關蛋白表達的藥物。
與現有技術相比，本發明至少具有以下優點：
本發明提供的mir-21的模擬物可以用於降低faslg蛋白的表達，以及促進肝細胞增殖的基礎醫學和臨床醫學的研究；本發明提供的mir-21的抑制物及其重組表達載體可以用於增加faslg蛋白的表達，以及促進肝細胞凋亡的基礎醫學和臨床醫學的研究；二者有利於為開發相關藥物提供高效的、大通量的篩選和評價平臺及手段，將大大促進mirna在腫瘤預防、診斷和治療中的應用。
附圖說明
圖1為mir-21的高通量檢測結果與qrt-pcr檢測結果的比較。灰色線為高通量檢測結果；黑色線為qrt-pcr檢測結果；
圖2為用含mir-21抑制物的重組表達載體轉染brl-3a細胞的mtt檢測結果；
圖3a為brdu免疫組化檢測rno-mir-21的mimic對brl-3a細胞增殖的影響；
圖3b為brdu免疫組化檢測細胞增殖結果統計；
圖4a為mir-21與faslg的3′-utr結合位點示意圖；
圖4b為mir-21的mimic和inhibitor分別與faslg的3′-utr共轉染brl-3a細胞後dual-luciferace檢測結果。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的保護範圍。
實施例1：大鼠肝再生模型製備與取材
實驗大鼠為成年健康雄性sprague-dawley大鼠，體重230±20g，由河南師範大學實驗動物中心提供。飼養溫度為21±2℃，相對溼度為60±10％，光照時間12h/d(8：00-20：00)，自由飲水、攝食。取114隻上述大鼠，隨機分為19組，每組6隻。其中，正常對照(0h)1組，2/3肝切除(partialhepatectomy，ph)與假手術對照(shamoperation，so)各9組。ph組按higgins和anderson方法進行，so組除不切除肝葉外，其他同ph。手術後2、6、12、24、30、36、72、120和168h時，取肝右葉置於組織儲存試劑(例如rnalater)中，於-20℃保存備用。
實施例2：mirnas的高通量測序
取適量上述保存於-20℃的肝組織置於裝有液氮的研缽中研磨，按mirvanamirnaisolationkit(ambion，usa)操作指南提取和純化mirnas。用瓊脂糖凝膠電泳(180v，0.5h)檢測總rna質量，分別通過260nm和280nm波長測定rna的濃度和純度。實驗用樣品的28s和18srrna亮度比約為2∶1，od260/od280≥2.0。mirnas的定性和定量分析由上海伯豪生物技術公司進行，測序方法為單端solexamicrorna-seq測序，讀長36nt。將測序得到的mirnas序列與mirnas庫比對，確定mirnas的種類和豐度。
實施例3：大鼠肝再生相關mirnas
用單端solexamicrorna-seq高通量測序法，從實驗組(ph)和假手術組(so)的0、2、6、12、24、30、36、72、120和168h等10個時間點的大鼠再生肝中檢測出425條mirnas，經過ratio值分析表明，信號值大於20的126條mirnas中，39條發生了有意義的表達變化。其中，31條的ratio值≥對照2倍，視為有意義表達上調。4條的ratio值≤對照2倍，視為有意義表達下調。4條在有的時間點上調，有的時間點下調，視為上/下調。t-檢驗表明，上述39條發生了有意義表達變化的mirnas中，23條mirnas與肝再生相關(表1)。
表1大鼠肝再生中發生有意義轉錄變化的mirnas
註：表示ratio值≥2；表示ratio值≤05；「」表示p＜005，推測為大鼠肝再生相關micrornas。
實施例4：實時螢光定量pcr(qrt-pcr)檢測
利用oligo6及primerpremier5.0軟體，設計特異性stem-loop反轉錄(rt)引物和qrt-pcr上下遊引物序列，並與mirbase進行物種比對，確定引物的特異性。將設計好的引物序列及u6內參引物序列交由上海生工生物工程公司合成(表2)。將提取的mir-21按照amv反轉錄試劑盒(promega，usa)操作說明進行反轉錄得到cdna，進行pcr反應，確定最佳反應溫度、時間、模板和引物量，繼而進行qrt-pcr。
qrt-pcr的條件均為：95℃2min，95℃15sec，60℃20sec，72℃20sec，40個循環。每個樣品重複檢測三次，所得數據用2-δδct法作相對定量處理。
表2反轉錄引物及pcr引物序列
註：rt：反轉錄引物；fp：上遊引物；rp：下遊引物。
用qrt-pcr驗證mir-21在大鼠再生肝中表達變化，驗證結果如圖1所示，mir-21的表達趨勢與高通量測序結果基本吻合。
實施例5：大鼠肝細胞培養
實驗所用大鼠正常肝細胞brl-3a購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，培養基為含10％胎牛血清(fbs)的dmem高糖培養基，細胞培養於37℃、飽和溼度、5％co2的培養箱裡。取對數生長期細胞進行傳代，5×104個細胞/瓶。
實施例6：mtt法檢測肝細胞增殖
在含brl-3a細胞的培養基中加入mtt(geneview，usa)，使其最終濃度達0.5mg/ml，於37℃避光培養4h，徹底棄去培養基，每孔加入150μl二甲基亞碸(dmso，geneview，usa)，輕輕震蕩10min，充分溶解甲瓚晶體。最後，用biotekreader酶標儀檢測490nm處各孔的吸光值。每個實驗組設置5個復孔，實驗重複3次。
利用mir-21的mimic(50nm/孔)和inhibitor(100nm/孔)分別轉染brl-3a細胞24、48和72h後做mtt檢測，檢測結果如圖2所示，mimic促進了brl-3a細胞的增殖，inhibitor抑制了brl-3a細胞增殖，且差異顯著(p＜0.01)。
實施例7：brdu-標記法檢測肝細胞增殖
將brl-3a細胞接種於24孔細胞培養板中，1×105個細胞/孔，待細胞長到50％融合度時，加入lipofectamine2000(invitrogen)和mimic(50nm/孔)轉染細胞。在5％co2、37℃培養箱中培養48h，brdu螢光標記10h，70％體積分數的乙醇固定，變性(1mhcl，56℃，35min)、抗原修復(0.1％胰酶37℃孵育1h)。brdu一抗(用體積分數為0.1％的bsa以1∶1000的體積比稀釋，sigma，usa)4℃孵育12h，fitc-二抗(用0.1％bsa1∶50稀釋，sigma，usa)室溫孵育35min；然後0.1μg/ml的dapi(sigma，usa)中室溫孵育10min復染細胞核，上述每進行一個步驟，均用pbs洗3次，每次5min。然後，在螢光顯微鏡下隨機選取5個不重疊的視野(20×)拍照，用生物學軟體image-proplus6.0對brdu陽性細胞和dapi標記的細胞核數分別進行計數，統計每組brdu陽性細胞佔總細胞數的百分率，並用spss13.0統計學軟體的單因素方差分析方法分析組間差異，p＜0.05表示有顯著差異，p＜0.01表示差異極顯著。
進一步用brdu免疫螢光檢測brdu陽性肝細胞，檢測結果如圖3a、3b所示，mimic處理組brdu陽性對照顯著高於對照組，inhibitor處理組brdu高於對照組。
實施例8：mirnas的靶基因預測及其功能確認
根據mirnas在大鼠肝再生中的表達變化，找出發生有意義表達變化的mirnas。用targetscan、miranda、pcitar、mirdb、mirwalk等在線分析工具預測上述mirnas的靶基因。簡要地說，在mirwalk(www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirqwalk/index.html)主頁上點擊「micrornatargets」欄的「genetargets」，將目的mirnas輸入搜索欄，在資料庫選項中選擇targetscan、miranda、pcitar、mirdb、mirwalk，點擊「search」，獲得靶基因。進一步查找kegg(www.genome.jp/keg/pathway.html)網站，確認mirnas的靶基因。將確認的靶基因與go資料庫比對，找出靶基因參與的信號通路和/或細胞增殖和凋亡活動。繼續將參與細胞增殖和凋亡信號通路的靶基因輸入ipa等軟體和qiagen等資料庫，獲得信號通路的結構、成分和信號傳導路徑。
實施例9：雙螢光素酶報告基因檢測系統的設計與構建
按上述方法，將目的mirnas輸入mirwalk網站的「genetargets」搜索欄，點擊「search」，獲得mirna及其靶基因3′-utr端的結合位點。通過ncbi網站，找到相應結合位點的。委託上海捷瑞生物工程公司用其相應方法合成mir-21可識別的faslg基因的3′-utr約900bp核苷酸序列，並將該序列克隆到靶基因報告載體psi-check-2，備擴增、檢測、篩選和使用。
實施例10：目的mirna與靶基因3′-utr結合的驗證
用雙螢光素酶報告基因檢測系統(dlr)驗證目的mirna與靶基因的結合。簡要地說，在24孔細胞培養板中，加入0.5ml10％fbs的dmem高糖培養液和2×104個細胞/孔，培養於37℃、飽和溼度、5％co2的培養箱裡。待細胞的融合度達到50％時，分別將以下分組共轉染brl-3a細胞。(1)lipofectamine2000(invitrogen)、「靶基因-報告載體」和mimic；(2)lipofectamine2000(invitrogen)、「靶基因-報告載體」和inhibitor；(3)lipofectamine2000(invitrogen)、「點突變-靶基因-報告載體」和mimic；(4)lipofectamine2000(invitrogen)、「點突變-靶基因-報告載體」和inhibitor；(5)lipofectamine2000(invitrogen)、「報告載體」和mimic；(6)lipofectamine2000(invitrogen)、「報告載體」和inhibitor。此外，還包括上述六組的mimic和inhibitor的陰性對照。mimic濃度為50nm/孔，inhibitor濃度為100nm/孔。轉染48h後，小心吸掉上清，每孔加入200μl報告基因-細胞裂解液，輕輕振蕩30min，15000g/min離心5min，取上清，在96孔板中加入100μl/孔上清和100μl/孔螢火蟲螢光素酶檢測液(購自碧雲天生物技術有限公司)，迅速混勻，在560nm波長條件下檢測其吸光值(od值)；檢測完畢後，再在其中加入100μl/孔海腎螢光素酶檢測液(按海腎螢光素酶檢測底物：海腎螢光素酶檢測緩衝液＝1∶100稀釋)，迅速混勻，在465nm波長條件下，檢測其吸光值(od值)。做3次重複實驗，每次檢測3個復孔。t檢驗實驗組與對照的差異性，找出差異顯著(p＜0.05)、極顯著(p＜0.01)和不顯著(p≥0.05)組。
實施例11：mir-21的促進brl-3a細胞生長增殖機制
取對數生長期的brl-3a細胞，按5×104/孔接種在24孔板中，用含faslg3′-utr的螢光素酶報告質粒或含突變faslg的3′-utr的報告質粒和mir-21mimic/inhibitor共轉。在轉染後48h，使用雙螢光素酶報告基因測定試劑盒(promega)分析蛋白質提取物的螢光值。結果表明，mir-21的mimic能與faslg的3′-utr結合，並降低螢光活性(p＜0.05)，但添加mir-21的inhibitor後，mir-21與faslg的3′-utr結合降低，也未見螢光活性降低(p＜0.01)(圖4a、b)。此結果表明mir-21可以通過靶向結合faslg的3′-utr，阻遏faslg表達，降低faslg與凋亡蛋白fas結合水平，從而抑制brl-3a細胞凋亡，促進brl-3a的增殖。而mir-21的inhibitor可以抑制mir-21與faslg的3′-utr結合，促進faslg表達，faslg又與凋亡蛋白fas結合，促進brl-3a細胞凋亡。
以上，僅為本發明較佳的具體實施方式，但發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明透露的技術範圍內，可想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。因此，本發明的保護範圍應該以權利要求書的保護範圍為準。
河南師範大學
mir-21的模擬物、抑制物及其重組表達載體與應用
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