蘭屬植物種子無菌萌發與植株培育方法

2023-10-06 17:43:19 2

專利名稱：蘭屬植物種子無菌萌發與植株培育方法
技術領域：
本發明涉及植物培植技術領域，具體地說是蘭屬植物種子無菌萌發與植株培育方法。
背景技術：
沉香虎頭蘭(Cmbidium tracyanum L castle)、碧玉蘭(C.Lowianum)及黃蟬蘭(C.iridioides)是蘭科蘭屬植物，花大枝長，觀賞價值高，是優異的蘭花資源。三種蘭花多產於雲南、貴州和西藏東南部，是很好的雜交親本和切花材料。
蘭花種子很小，內含一些發育不完全的球形胚，無胚乳，自然狀態下很難萌發，需與蘭菌共生或無菌條件培養才能獲得成功。蘭屬(Cmbidium)植物種子的萌發，已有人作過研究，但以上三種蘭屬植物的無菌萌發未見報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種蘭屬植物種子無菌萌發與植株培育方法。
本發明對沉香虎頭蘭(Cmbidium tracyanum L castle)、碧玉蘭(C.Lowianum)及黃蟬蘭(C.iridioides)三種蘭花種子進行了無菌萌發和快速繁殖技術體系研究，成功地培育出大量組培苗，形成雜交育種和規模化生產栽培不可缺少的關鍵技術。
本發明的具體方法是1)材料來源採得沉香虎頭蘭蘭株、黃蟬蘭蘭株、碧玉蘭蘭株在資源圃內培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘取；2)培養方法①外植體處理將上述90％成熟度果實用75％酒精消毒40秒，轉入1％升汞表面消毒8～12分鐘，無菌水衝洗3～4次，無菌室取出種子並用紗布包好種子後，以少量無菌水潤洗5次，然後用0.1mol/L KOH溶液預處理8分鐘，用無菌水衝洗3次，在飽和漂白粉上清液中消毒10～20分鐘，無菌水衝洗5次後，接種到固體培養基；②培養基用改良的MS固體培養基(即1/2MS培養基)加入細胞分裂素，和生長素，即1/2MS+6-BA1.0～2.0mg.L-1+NAA0.5～1.0mg.L-1培養基，將種子接種在此培養基上培養；③培養條件在整個培養過程中，種子無菌萌發採用暗箱培養，圓球莖成苗的培養、增殖和生根培養均採用光照培養，培養條件為溫度25±2℃，光照1800～2500勒克斯(lx)，每天光照12～15小時，培養基pH5.4，瓊脂7g/L，待種子萌發後長出芽和長出帶根毛的幼根時，轉接培養；④轉接對圓球莖進行轉接，即從一個培養瓶轉到另一個培養瓶的；⑤快速增殖當圓球莖長到1cm左右，再轉到增殖培養基1/2MS+6-BA1.5～2.5mg.L-1+NAA0.2～0.5mg.L-1+香蕉泥70～80g/L培養中進行增殖培養；⑥生根培養將增殖培養後的苗培養到5～8cm高，從基部切下，轉到生根培養基1/2MS+10-6Y2或10-6Y1中，一個月後即長出新根。
本發明從實驗研究中得出如下結論1、種子無菌萌發培養1/2MS培養基外加6-BA1.0～2.0mg.L-1+NAA0.5～1.0mg.L-1有利於種子萌發。
2、圓球莖培養改良的培養基培養圓球莖生長的效果最佳。
3、不同激素、培養基對增殖的影響根據不同培養時期加入不同的生長素、細胞分裂素及其他附加物質(香蕉泥)增殖培養效果最好。
4、生根培養把無根蘭苗轉接到不同活性物質的生根培養基中，培養三個月時的不同活性物質的促根效果不同，在基本培養基加入10-6Y2(生防菌)時，根長、根數、莖粗效果都較其它三組好，且根數較對照高33％；不加激素的對照也長出三條根，說明對外源激素的依賴程度不高，同時NAA為2.0mg/L時對根的生長有抑制作用；加入10-6Y1(生防菌)時，根長、根粗、株高、莖粗都較對照好。說明生根培養以10-6Y2(生防菌)為宜。
本發明與現有技術比較具有的優點1、傳統的蘭花繁育主要以分株繁殖為主，而分株繁殖係數底，每年老苗與新新生苗的比例只為1∶1～3左右，很難進行規模化生產。組織培養應用於蘭花的培養報導較少，這種現代生物技術可用一個芽在一年中繁殖出數十萬株蘭花，從而滿足蘭花產業化需求；還可進行脫毒技術操作，生產出無病毒種苗，從而可降低蘭花生產的成本和提高產品質量，這都是傳統分株技術無法做到的。因此，該技術克服了蘭花傳統繁殖方法帶來的種種弊端，有利於擴大蘭花的繁殖係數，能在短期內生產出數量巨大的試管種苗和脫毒苗，有效滿足蘭花產業化生產的巨大需求。
具體實施例方式
實施例1材料來源自雲南山區採得沉香虎頭蘭蘭株，在資源圃內培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘取。
培養方法1、外植體處理將上述90％成熟度果實用75％酒精消毒40秒，轉入1％升汞表面消毒8～12分鐘，無菌水衝洗3～4次，無菌室取出種子並用紗布包好種子後，以少量無菌水潤洗5次，然後用0.1mol/L KOH(氫氧化鉀)溶液預處理8分鐘，用無菌水衝洗3次，在飽和漂白粉上清液中消毒10～20分鐘，無菌水衝洗5次後，接種到固體培養基；2、培養基用1/2MS+6-BA1.0mg.L-1+NAA1.0mg.L-1培養基，將種子接種在此改良的MS培養基上培養(6-BA即6-苄基腺嘌呤，為細胞分裂素，NAA即奈乙酸，為生長素)；3、培養條件在整個培養過程中，除了種子無菌萌發採用暗箱培養外，圓球莖成苗的培養，增殖和生根培養均採用光照培養。培養條件為溫度25±2℃，光照1800～2500勒克斯(lx)，每天光照12～15小時，培養基pH5.4，瓊脂7g/L。接種3個月後發芽率達90％以上。種子萌發後先長出芽，隨後長出帶根毛的幼根，轉接培養3個月後逐漸成苗；4、轉接的具體過程轉接方法由於蘭花種子非常細小，播種時有些種子聚集在一起，致使長出的圓莖球較擁擠，因此對圓球莖進行轉接，即從一個培養瓶轉到另一個培養瓶的過程；5、快速增殖過程當圓球莖長到1cm左右，再轉到增殖培養基1/2MS+6-BA2.5mg.L-1+NAA0.2mgL-1+香蕉泥70g/L培養(香蕉泥是附加物)；6、生根培養將增殖培養後的苗培養到5～8cm高，從基部切下，轉到生根培養基1/2MS+10-6Y2或10-6Y1中(Y1、Y2為生防菌，由雲南農業大學提供)，一個月後即長出新根。
實施例2材料來源自雲南山區採得碧玉蘭(C.Lowianum)蘭株，在資源圃內培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘取。
培養方法1、外植體處理按實施例1的方法進行。
2、培養基用1/2MS+6-BA2.0mg.L-1+NAA0.5mg.L-1培養基，將種子接種在此改良的MS培養基上培養；步驟3和4按實施例1的方法進行。
5、快速增殖過程當圓球莖長到1cm左右，再轉到增殖培養基1/2MS+6-BA1.5mg.L-1+NAA0.5mg.L-1+香蕉泥80g/L培養；6 步驟按實施例1的方法進行。
實施例3材料來源自雲南山區採得黃蟬蘭(C.iridioides)蘭株，在資源圃內培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘取。
培養方法按實施例1或實施例2的方法進行。
權利要求
1.一種蘭屬植物種子無菌萌發與植株培育方法，其特徵在於按以下步驟進行1)材料來源採得沉香虎頭蘭蘭株、黃蟬蘭蘭株、碧玉蘭蘭株在資源圃內培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘取；2)培養方法①外植體處理將上述90％成熟度果實用75％酒精消毒40秒，轉入1％升汞表面消毒8～12分鐘，無菌水衝洗3～4次，無菌室取出種子並用紗布包好種子後，以少量無菌水潤洗5次，然後用0.1mol/L KOH溶液預處理8分鐘，用無菌水衝洗3次，在飽和漂白粉上清液中消毒10～20分鐘，無菌水衝洗5次後，接種到固體培養基；②培養基用MS+6-BA1.0～2.0mg.L-1+NAA0.5～1.0mg.L-1培養基，將種子接種在此培養基上培養；③培養條件在整個培養過程中，種子無菌萌發採用暗箱培養，圓球莖成苗的培養、增殖和生根培養均採用光照培養，培養條件為溫度25±2℃，光照1800～2500勒克斯(lx)，每天光照12～15小時，培養基pH5.4，瓊脂7g/L，待種子萌發後長出芽和長出帶根毛的幼根時，轉接培養；④轉接對圓球莖進行轉接，即從一個培養瓶轉到另一個培養瓶的；⑤快速增殖當圓球莖長到1cm左右，再轉到增殖培養基1/2MS+6-BA1.5～2.5mg.L-1+NAA0.2～0.5mg.L-1+香蕉泥70～80g/L培養中進行增殖培養；⑥生根培養將增殖培養後的苗培養到5～8cm高，從基部切下，轉到生根培養基1/2MS+10-6Y2或10-6Y1中，一個月後即長出新根。
全文摘要
本發明是一種蘭屬植物種子無菌萌發與植株培育方法。採得沉香虎頭蘭蘭株、黃蟬蘭蘭株、碧玉蘭蘭株在資源圃內培育至蘭花果實到九成熟。培養方法經外植體處理，改良的培養基對種子進行培養，待種子萌發後長出芽和長出帶根毛的幼根時，轉接培養，快速增殖，生根培養，一個月後即長出新根。傳統的蘭花繁育主要以分株繁殖為主，而分株繁殖係數底，每年老苗與新生苗的比例只為1∶1～3左右，很難進行規模化生產。本發明用現代生物技術可用一個芽在一年中繁殖出數十萬株蘭花，從而滿足蘭花產業化需求；還可進行脫毒技術操作，生產出無病毒種苗，從而可降低蘭花生產的成本和提高產品質量，有效滿足蘭花產業化生產的巨大需求。
文檔編號A01G7/00GK1729747SQ20051001076
公開日2006年2月8日 申請日期2005年4月22日 優先權日2005年4月22日
發明者李枝林, 餘朝秀, 王卜瓊, 王玉英, 黃麗萍 申請人:雲南農業大學