一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒及其製備方法
2023-10-10 12:45:49 2
專利名稱：一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術檢測領域，具體涉及一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒及其製備方法，利用豬肺炎支原體偶聯的豬肺炎支原體特異多肽抗原包被固相載體，製備的豬肺炎支原體特異多 肽抗原ELISA試劑盒用於豬肺炎支原體感染的臨床檢測，流行病學調查及免疫監測。
背景技術：
豬支原體肺炎(Mycoplasmal Pneumonia of Swine,MPS,又稱「氣喘病」)是由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一種慢性、接觸性、高發病率、低死亡率為特點的傳染病。豬肺炎支原體主要感染呼吸道，損傷纖毛和上皮細胞，其致病的一個重要因素是支原體與淋巴細胞的相互作用，支原體感染改變了肺泡巨噬細胞的吞噬功能使豬只產生免疫抑制，患豬易繼發其它病原體的感染。豬支原體肺炎病廣泛存在於養殖豬群中，是造成經濟損失的最重要的疾病之一。豬肺炎支原體常與其他細菌和病毒混合感染，引起地方性肺炎(EnzooticPneumoniae, EP)和豬呼吸道疾病症候群(Porcine Respiratory Disease Complex, PRDC),由於豬群感染MPS後難以治癒，且本病難以淨化，避免接觸Mhp是最有效的預防措施，早期快速地檢測診斷十分必要。從病豬體內分離培養出Mhp被認為是豬感染MPS的判斷標準，由於Mhp是世界上公認的最難分離和鑑定的病原體之一，生長緩慢且經常因豬鼻支原體(M. hyorhinis)過度生長而被掩蓋，藥物治療後或康復的豬也很難再分離。因此，分離培養診斷在臨床上的應用仍不可行。近年來對Mhp快速檢測方法的研究有了一些進展，一些快速、敏感、準確的檢測方法已被應用於Mhp的診斷，比如臨床診斷(屠宰場監測)、分離培養法、染色電鏡觀察法、核酸探針技術、PCR診斷技術、血清學方法、免疫學診斷方法等。血清學方法是最常用的診斷工具，通常用來判定豬群中病原體，如豬肺炎支原體的存在與否。然而，隨著大多數豬肺炎支原體診斷方法的出現，血清學結果的解釋也被提出質疑。大量研究比較了多種用於病變肺臟檢測和疾病抵禦的測定法。最初，補體結合(CF)實驗用於檢測豬肺炎支原體的抗體。然而，一些比較性的研究發現，間接ELISA實驗在檢測抗體水平上比補體結合(CF)實驗更為有效。當前，ELISA測定法最常用於病原菌抗體的測定。酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-LinkedImmunosorbent Assay, ELISA)是一種將抗原、抗體反應的特異性和酶催化底物的專一性二者有機結合而形成的血清學方法，是以物理方法將抗體或抗原吸附在固相載體上，隨後的一系列免疫學和酶促生化反應都在此固相載體上進行的免疫酶測定實驗。包括間接ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA和斑點ELISA等類型。Bereiter M等(1990)對補體結合試驗(CFT)、ELISA和放射免疫酶試驗(RIDEA)的敏感性進行評價在人工感染後13天，被感染豬開始咳嗽，ELISA在3周後檢測到抗體。Okada M等(2005)利用豬肺炎支原體P46外膜蛋白的單克隆抗體和在大腸桿菌中的表達產物建立了檢測豬肺炎支原體抗體的雙夾心ELISA方法。在實驗感染豬肺炎支原體的豬只中，該ELISA方法和CFT法幾乎同一時間檢測到豬肺炎支原體，且兩種方法有很好的相關性。然而在臨床檢測中，兩種方法沒有什麼相關性，而CFT法特異性較差。目前，對該病的抗體早期診斷，市場上的主要有美國IDEXX公司生產的Mycoplasma hyopneumoniae antibody test k it 檢測試劑盒、丹麥 Dako 公司生產的Mycoplasma hyopneumoniae ELISA檢測試劑盒和中國獸醫藥品監察所生產的豬肺炎支原體抗體IHA檢測·試劑盒。雖然使用國外進口的ELISA檢測試劑盒所獲的檢測結果較均一、但國外的試劑盒使用的是豬肺炎支原體全菌蛋白，或是基因工程表達蛋白作為包被抗原，故該類試劑盒檢測的特異性不高，有待於使用我國國內的大量的臨床樣本作進一步驗證，另外，進口試劑盒價格普遍昂貴；中國獸醫藥品監察所的IHA檢測試劑盒結果判斷需要一定的經驗，且靈敏度低，市場佔有量不大。另外，實驗證明，在許多血清學測定法中，由於豬絮狀支原體抗體與豬肺炎支原體發生交叉反應，使豬肺炎支原體的血清學診斷變得非常複雜，準確檢測判定特異豬肺炎支原體較困難。因此，建立一種豬肺炎支原體特異的診斷方法，對研究其致病機理，有效預防和控制該病的傳播具有十分重要的意義。
發明內容
為克服現有技術的缺陷，本發明的目的在於提供豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，本發明利用非蛋白多聚體定向偶聯豬肺炎支原體多肽抗原作為包被液包被固相載體，可有效提高多肽與目標抗體的結合效率，從而顯著提高可檢測靈敏度，同時顯著降低非特異背景讀值，特異性高，操作簡單，診斷速度快，在進行大規模檢測中經濟方便等優點。本發明的另一目的在於提供豬肺炎支原抗體檢測試劑盒的製備方法。為實現上述目的本發明所採用的技術方案如下一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，包括被偶聯的豬肺炎支原體特異多肽抗原包被液包被的固相載體；陽性血清和陰性血清各I管，其中陽性血清為Mhp標準陽性血清稀釋液，陰性血清為Mhp標準陰性血清稀釋液；用辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG的稀釋液的酶標二抗I瓶；抗體稀釋液I瓶；底物顯色液I瓶；終止液I瓶。所述偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被液是偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原用包被液按照5μ g/ml-ΙΟμ g/ml的濃度稀釋；其中偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原是通過以下方法製備得到的I)選取豬肺炎支原體特異反應原性多肽溶解，得到豬肺炎支原體特異多肽溶液；2)取非蛋白多聚體溶解，得到非蛋白多聚體溶液；3)在豬肺炎支原體特異多肽溶液或非蛋白多聚體溶液中加入偶聯劑，混合均勻；4)將豬肺炎支原體特異多肽溶液與非蛋白多聚體溶液混合均勻，攪拌反應，使豬肺炎支原體特異多肽偶聯到非蛋白多聚體上；5)用透析袋去除未參與結合的偶聯劑，純化，凍幹，得到偶聯豬肺炎支原體特異多肽；其中豬肺炎支原體特異反應原性多肽為SEQ ID NO: I SEQ ID N0:5系列多肽中的一種。所述偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被液包被的固相載體是將偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原用包被液稀釋，然後將稀釋的偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被至少8孔的酶標板，每孔100 μ L，4°C過夜包被，用PBST洗滌液250 μ I/孔洗滌2_4次後拍幹，用封閉液150 μ I/孔，37°C封閉lh，洗滌液PBST 250 μ I/孔洗滌2_4次後拍幹，放入真空袋中，加入乾燥劑，抽真空，4°C保存；所述包被液為I. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3溶於800mL雙蒸水中，調節pH值至9. 6，並定容至1000mL。 所述辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG的稀釋液是用HRP保護液按照辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG與HRP保護液體積比為I : 2000-10000的比例稀釋，酶標二抗每瓶量為12ml ;所述 HRP 保護液為 O. 1%BSA I. Og, O. 25%EDTA2. 5g，加 PBS 至 1000ml。所述Mhp標準陽性血清稀釋液是用抗體稀釋液按照體積比為1:2-128的比例將Mhp標準陽性血清稀釋，每管量為Iml ;Mhp標準陰性血清稀釋液用抗體稀釋液按照體積比為1:2-128的比例將Mhp標準陰性血清稀釋，每管量為1ml。作為優選的Mhp標準陽/陰性血清用抗體稀釋液按照1: 2、1: 4、1: 8、1:16、1:32、1:64、1:128稀釋。所述抗體稀釋液為O. 1%BSA1. Og加入PBS至IOOOml ;每瓶量為12ml。所述底物顯色液為50mg TMB, IOmL DMSO, 9. 8g檸檬酸和I. 2ml 30%H202加蒸餾水定容至IOOOml ;每管量為12ml。所述終止液包括雙蒸水178. 3mL和98%的濃硫酸21. ImL,每管量為6ml。本發明所述的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒還包括I瓶洗滌液，所述洗滌液為O. 2gKH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12Η20，8· Og NaCl，0. 2g KC1，0. 5mL Tween-20 (0. 05%V/V)，加雙蒸水定容至100ml，pH值為7.4ο—種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒的製備方法，包括以下步驟I)非蛋白多聚體定向偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被的固相載體的包被；2)抗體稀釋液(AD)配製；3)底物液顯色液配製；4)終止液配製；5)陰陽性血清稀釋；6)酶標二抗配製；7)試劑盒的組裝將偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被至少8孔的酶標板I塊、陰陽性血清各I管、抗體稀釋液I瓶、酶標二抗I瓶、底物顯色液I瓶、終止液I瓶、操作說明書一份組裝成ELISA試劑盒。相比現有技術，本發明的有益效果在於本發明採用偶聯的豬肺炎支原體特異多肽抗原作為包被液，能夠有效提高豬肺炎支原體特異多肽與目標抗體的結合率，從而顯著提高檢測靈敏度，同時顯著降低非特異背景讀值，特異性高，具有操作簡單，診斷速度快，在進行大規模檢測中經濟方便等優點，是一種便於普及的好方法，具有廣泛的應用前景。本發明的檢測方法，包被抗原用量可減至10ng/ml，降低了成本，有利於推廣使用。下面結合具體的實施方式對本發明作進一步詳細說明。
具體實施例方式本發明中所採用的偶聯豬肺炎支原體特異多肽的製備方法如下I)豬肺炎支原體特異Mhp多肽的篩選
有效多肽段的選擇和確定，是根據參考文獻(Hopp & Woods, 1981，Proc.Natl.Acad. Sci. USA, vol. 78，p. 3824-3828，Chou & Fassman,1978，Advances inEnzymology, vol. 47，p. 45-148)提供的方法,對豬肺炎支原體膜蛋白的抗原表位進行預測，確定天然抗原的胺基酸序列，然後尋找該肽段所針對的抗原決定簇(印itopes)。使用ELISA檢測不同多肽與豬肺炎支原體抗血清的反應，最後選出具有良好反應原性的豬肺炎支原體特異多肽。本實施例根據豬肺炎支原體膜蛋白序列，篩選出5條具有良好反應原性的豬肺炎支原體特異多肽，序列如下所示 Pl Glu Thr Asp Ser Asp Tyr Lys He Val Lys Arg Trp Leu Val Asp Ser AsnAsnAsn He Arg AsnP2 Ile Tyr Glu Gln Thr Val Ala Phe Ala Lys Gln Ser Asn Leu Leu Val AlaGluPhe Asn Phe Ser Leu Lys LysP3:Ala Ala Lys Pro Glu Ala Ala Lys Pro Val Ala Ala Lys Pro Glu Thr ThrLysPro Val Ala Ala Lys Pro Glu Ala AlaP4:Gln Ala Lys Leu Asp Tyr Gly Asn lie Leu Asn Pro Tyr Asn Thr GlnLeuAla Lys Val Glu Val Glu Ala Leu Phe Lys Lys Gly Asn LysP5:Gln lie Pro Ser Leu Phe Leu Lys Ala Asp Leu Ser Gln Ser Ala Arg GluIleLeu Ala Ser Pro。2)偶聯豬肺炎支原體特異多肽的製備稱取IOmg的上述任一種豬肺炎支原體特異反應原性多肽，加50 μ L DMSO溶解，然後加入IOml雙蒸水，稱取Img的多糖葡糖胺，加Iml PBS溶解，在多糖溶液內加IOmg偶聯劑EDC混勻，然後與多肽溶液混合，室溫攪拌反應3小時。使用透析袋(孔徑MWCO10000-12000)去除未參與結合的偶聯劑(EDC)，純化、凍幹，得到偶聯豬肺炎支原體特異多肽。實施例I一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，通過以下方法製備I)選擇上述任一種偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原用包被液按照(包被液為
I.59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3溶於800mL雙蒸水中，調節pH值至9. 6，並定容至 1000mL)5 μ g/ml的比例稀釋，然後將稀釋的偶聯多肽抗原包被8孔板，每孔100 μ L，4°C過夜包被，次日用PBST洗滌液250 μ I/孔洗滌3次後拍幹，用封閉液150μ I/孔，37°C封閉lh，洗滌液PBST250 μ I/孔洗滌3次後拍幹，放入真空袋中，加入乾燥劑，抽真空，4°C保存；2)抗體稀釋液(AD)配製稱取 I. Og BSA (O. 1%)，加 PBS 至 1000ml，4°C保存；3)底物液顯色液配製4ml TMB(50mg TMB 溶於 IOmL DMSO 中)，9· 8g檸檬酸，I. 2ml30%H202加蒸餾水定容至1000ml，4°C避光保存；4)終止液配製(2mol/L H2S04):雙蒸水178. 3mL，逐滴加入濃硫酸(98%) 21. 7mL ；5)陰陽性血清稀釋用抗體稀釋液按陽性血清/陰性血清與抗體稀釋劑按體積比為1:2稀釋，Iml/管分裝，4°C保存；6)酶標二抗配製用HRP保護液按HRP保護液與辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG體積比為1:2000的比例稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG，4°C保存；
7)試劑盒的組裝將偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被的8孔酶標板I塊、Iml/管的陰陽性血清各I管、12ml/瓶的抗體稀釋液I瓶、12ml/瓶的酶標二抗I瓶、12ml/瓶的底物顯色液I瓶、6ml/瓶的終止液I瓶、操作說明書一份組裝成ELISA試劑盒。實施例2一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，通過以下方法製備I)選擇上述任一種偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原用包被液(包被液為I. 59gNa2CO3, 2. 93g NaHCO3溶於800mL雙蒸水中，調節pH值至9· 6，並定容至IOOOmL)按照10 μ g/ml的比例稀釋，然後將稀釋的偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被48孔板，每孔100 μ L，4°C過夜包被，次日用PBST洗滌液250 μ I/孔洗滌3次後拍幹，用封閉液150 μ I/孔，37°C封閉lh，洗滌液PBST 250 μ I/孔洗滌4次後拍幹，放入真空袋中，加入乾燥劑，抽真空，4°C保存； 2)抗體稀釋液(AD)配製稱取 I. Og BSA (O. 1%)，加 PBS 至 1000ml，4°C保存；3)底物液顯色液配製4ml TMB(50mg TMB 溶於 IOmL DMSO 中)，9. 8g檸檬酸，I. 2ml30%H202加蒸餾水定容至1000ml，4°C避光保存；4)終止液配製雙蒸水178. 3mL,逐滴加入濃硫酸(98%) 21. 7mL ；5)陰陽性血清稀釋用抗體稀釋液按陽性血清/陰性血清與抗體稀釋劑按體積比為1:64稀釋，Iml/管分裝，4°C保存；6)酶標二抗配製用HRP保護液按HRP保護液與辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG體積比為1:4000的比例稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG，4°C保存；7)試劑盒的組裝將偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被的48孔酶標板I塊、Iml/管的陰陽性血清各I管、12ml/瓶的抗體稀釋液I瓶、12ml/瓶的酶標二抗I瓶、12ml/瓶的底物顯色液I瓶、6ml/瓶的終止液I瓶、操作說明書一份組裝成ELISA試劑盒。實施例3一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，通過以下方法製備I)選擇上述任一種偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原用包被液(包被液為I. 59gNa2CO3, 2. 93g NaHCO3溶於800mL雙蒸水中，調節pH值至9. 6，並定容至IOOOmL)按照
2.5 μ g/ml的比例稀釋，然後將稀釋的偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被96孔板，每孔100 μ L，4°C過夜包被，包被濃度為8 μ g/ml，次日用PBST洗滌液250 μ I/孔洗滌3次後拍幹，用封閉液150μ I/孔，37°C封閉lh，洗滌液PBST 250 μ I/孔洗滌4次後拍幹，放入真空袋中，加入乾燥劑，抽真空，4°C保存；2)抗體稀釋液(AD)配製稱取 I. Og BSA (O. 1%)，加 PBS 至 1000ml，4°C保存；3)底物液顯色液配製4ml TMB(50mg TMB 溶於 IOmL DMSO 中)，9· 8g檸檬酸，I. 2ml30%H202加蒸餾水定容至1000ml，4°C避光保存；4)終止液配製雙蒸水178. 3mL，逐滴加入濃硫酸(98%) 21. 7mL ；5)陰陽性血清稀釋用抗體稀釋液按陽性血清/陰性血清與抗體稀釋劑按體積比為1:128稀釋，Iml/管分裝，4°C保存；6)酶標二抗配製用HRP保護液按HRP保護液與辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG體積比為1:8000的比例稀釋辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG，4°C保存；7)試劑盒的組裝將偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被的96孔酶標板I塊、Iml/管的陰陽性血清各I管、12ml/瓶的抗體稀釋液I瓶、12ml/瓶的酶標二抗I瓶、12ml/瓶的底物顯色液I瓶、6ml/瓶的終止液I瓶、操作說明書一份組裝成ELISA試劑盒。利用本發明的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒檢測抗體的使用方法如下I)偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被液包被的酶標板中每孔內加入100 μ L已經稀釋好的各樣本，每個樣品必須使用一個獨立的槍頭，每塊板中陰陽性對照血清各設兩孔室溫下孵育30分鐘，再將各孔的液體棄入廢液缸內；2)用微量移液器取洗滌液，洗滌酶標板，約250 μ L/孔，洗滌6次，最後一次加入洗滌液後浸泡洗滌5min，再將板中殘留的洗滌液棄入廢液缸內，然後用力扣拍到吸水材料上，注意應避免包被板孔乾燥；3)然後在每孔加入100 μ L辣根過氧化物酶標記的羊抗豬抗體，室溫下孵育30分
鍾，並重複該步驟；4)每孔加入100 μ L TMB底物液，避光顯色10分鐘，每孔加入50 μ L終止液，使反應終止,輕震酶標板,使板內液體混勻；5)使用酶標儀測定並記錄樣本和對照樣本的A45tl吸收值，IOmin完成測定；本實驗結果應符合下列條件Mhp陽性對照的平均值(P)減去陰性對照的平均值(N)必須大於O. 15。陰性對照平均值(N)必須小於或等於O. 15。如果試驗無效應重做。Mhp抗體的陽性/陰性通過計算樣品與陽性對照(S/P)的比值進行判定。具體計算方法如下①如果S/P值小於O. 20，樣品應判定為Mhp抗體陰性(_)。②如果S/P值在O. 20-0. 25之間判定為樣品Mhp可疑(+/_)，如果S/P值大於O. 25,貝U判定為樣品Mhp抗體陽性(+ )。應用實施例I :豬肺炎支原體特異Mhp Ρ97抗原表位特異性間接ELISA試驗I)材料待測血清豬偽狂犬病毒陽性血清I份、豬瘟病毒(CSFV)陽性血清I份、豬呼吸與繁殖症候群病毒(PRRSV)陽性血清I份、豬圓環病毒(PCV)陽性血清I份、豬鏈球菌的陽性血清I份、Mhp陽性血清2份、Mhp陰性血清2份，空白對照2份。其他包被好的酶標板、多道移液器、滅菌吸頭、酶標儀(0D450nm) ；HRP標記羊抗豬抗體；TMB ;終止液2M H2SO4 ;洗滌液PBST。2)方法①將包被好的酶標板加入1:40陰陽性血清或被檢樣品100 μ L，室溫30min ；②洗滌PBST，250 μ L/孔，洗滌6次，每次5min ；③每孔加入100 μ L辣根過氧化物酶標記的羊抗豬抗體(I: 3000)，室溫30min ；④重複②洗滌步驟；⑤底物每孔加入100 μ LTMB,避光顯色IOmin ；⑥終止液2MH2SO4, 50 μ L/ 孔；⑦酶標儀測定0D450nm讀取結果。表2為特異性檢測結果，表2的結果表明偽狂犬病毒、豬瘟病毒、PCV檢測為陰性，PRRSV和豬鏈球菌為弱陽性。表I
權利要求
1.一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，其特徵在於包括被非蛋白多聚體定向偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原作為包被液包被的固相載體；陽性血清和陰性血清各I管，其中陽性血清為Mhp標準陽性血清稀釋液，陰性血清為Mhp標準陰性血清稀釋液；用辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG的稀釋液的酶標二抗I瓶；抗體稀釋液I瓶；底物顯色液I瓶；終止液I瓶。
2.根據權利要求I所述的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，其特徵在於所述的非蛋白多聚體定向偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原作為包被液是由偶聯多肽抗原用包被液按照5μ g/ml-ΙΟμ g/ml的濃度稀釋，其中偶聯多肽抗原是通過以下方法製備得到的 1)選取豬肺炎支原體特異反應原性多肽溶解，得到多肽溶液； 2)取非蛋白多聚體溶解，得到非蛋白多聚體溶液； 3)在豬肺炎支原體特異多肽溶液或非蛋白多聚體溶液中加入偶聯劑，混合均勻； 4)將豬肺炎支原體特異多肽溶液與非蛋白多聚體溶液混合均勻，攪拌反應，使豬肺炎支原體特異多肽偶聯到非蛋白多聚體上； 5)用透析袋去除未參與結合的偶聯劑，純化，凍幹，得到偶聯豬肺炎支原體特異多肽； 其中豬肺炎支原體特異反應原性多肽為SEQ ID NO: I SEQ ID N0:5系列多肽中的一種。
3.根據權利要求I所述的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，其特徵在於所述非蛋白多聚體定向偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原作為包被液包被的固相載體是將偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原用包被液稀釋，然後將稀釋的偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被至少8孔的酶標板，每孔100 μ L，4°C過夜包被，用PBST洗滌液250 μ I/孔洗滌2_4次後拍幹，用封閉液150μ I/孔，37°C封閉lh，洗滌液PBST 250 μ I/孔洗滌2_4次後拍幹，放入真空袋中，加入乾燥劑，抽真空，4°C保存；所述包被液為I. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3溶於800mL雙蒸水中，調節pH值至9. 6，並定容至1000mL。
4.根據權利要求I所述的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，其特徵在於所述辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG的稀釋液是用HRP保護液按照辣根過氧化物酶標記羊抗豬IgG與HRP保護液體積比為I : 2000-10000的比例稀釋，酶標二抗每瓶量為12ml ;所述HRP保護液為O.1%BSA I. Og, O. 25%EDTA 2.5g，加 PBS 至 1000ml。
5.根據權利要求I所述的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，其特徵在於所述Mhp標準陽性血清稀釋液是用抗體稀釋液按照體積比為1:2-128的比例將Mhp標準陽性血清稀釋，每管量為Iml ;Mhp標準陰性血清稀釋液用抗體稀釋液按照體積比為I: 2-128的比例將Mhp標準陰性血清稀釋，每管量為1ml。
6.根據權利要求I所述的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，其特徵在於所述抗體稀釋液為 O. 1%BSA I. Og 加入 PBS 至 IOOOrnl ;每瓶量為 12ml。
7.根據權利要求I所述的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，其特徵在於所述底物顯色液為50mg TMB，IOmL DMS0，9. 8g檸檬酸和I. 2ml 30% H2O2加蒸餾水定容至IOOOrnl ;每管量為 12ml。
8.根據權利要求I所述的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，其特徵在於所述終止液包括雙蒸水178. 3mL和98%的濃硫酸21. 7mL,每管量為6ml。
9.根據權利要求I所述的豬肺炎支原抗體檢測試劑盒，其特徵在於其還包括I瓶洗滌液，所述洗滌液為 O. 2g KH2PO4, 2. 9g Na2HPO4 · 12Η20，8· Og NaCl，0.2g KCl，0.5mLTween-20 (0. 05% V/V)，加雙蒸水定容至 100ml, pH 值為 7. 4。
10.一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒的製備方法，其特徵在於包括以下步驟 O非蛋白多聚體定向偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被的固相載體的包被； 2)抗體稀釋液配製； 3)底物液顯色液配製； 4)終止液配製； 5)陰陽性血清稀釋； 6)酶標二抗配製； 7)試劑盒的組裝將偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原包被至少8孔的酶標板I塊、陰陽性血清各I管、抗體稀釋液I瓶、酶標二抗I瓶、底物顯色液I瓶、終止液I瓶、操作說明書一份組裝成ELISA試劑盒。
全文摘要
本發明屬於生物技術檢測領域，具體涉及一種豬肺炎支原抗體檢測試劑盒及其製備方法，利用偶聯的豬肺炎支原體特異多肽抗原包被固相載體，製備的豬肺炎支原體特異多肽抗原ELISA檢測試劑盒用於豬肺炎支原體感染的臨床檢測，流行病學調查及免疫監測。本發明採用非蛋白多聚體定向偶聯豬肺炎支原體特異多肽抗原作為包被液，有效提高多肽與目標抗體的結合效率，從而顯著提高可檢測靈敏度，同時顯著降低非特異背景讀值，特異性高，具有操作簡單，診斷速度快，在進行大規模檢測中經濟方便等優點，是一種便於普及的好方法，具有廣泛的應用前景。採用本發明的試劑盒檢測樣品，包被抗原用量可減至10ng/ml，降低了成本，有利於推廣使用。
文檔編號G01N33/543GK102928585SQ201210429480
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月31日 優先權日2012年10月31日
發明者李其昌, 白方方, 邵國青, 陳善真, 李中聖, 劉小琴, 羅均, 趙焱, 陳克宏, 王貴平 申請人:廣東現代農業集團研究院有限公司, 江蘇省農業科學院