增強型蛋白及其應用方法

2023-10-11 05:24:09 5

專利名稱：增強型蛋白及其應用方法
本申請要求2001年9月17日提交的美國臨時申請60/322,461的優先權。上述申請全文引入本文作為參考。
本發明主要涉及植物遺傳學和蛋白質化學領域。更具體地，本發明涉及包含了更多必需胺基酸的修飾蛋白。
全面補充胺基酸，在營養上對於所有動物，包括人，都是重要的，並且通常對於產生高質量牲畜和動物產品也是重要的。但是，一般動物膳食可缺乏具體動物不能合成的一或多種胺基酸。因此，所有動物都需要必需胺基酸來進行正常生長和發育。動物與動物之間的胺基酸需求是不同的。典型的胺基酸包括蘇氨酸、異亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、精氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和組氨酸。
在牲畜的膳食中添加必需胺基酸可以增加動物的商業價值。能提供並吸收充分的營養，對於動物產生具有重要商業價值的產物是十分關鍵的。在人的膳食中添加必需胺基酸，可以預防由營養不良或蛋白缺陷導致的一些疾病，並促進正常生長和發育。
已經有人嘗試改變動物的膳食，來增加動物飼料和人類食物(後文中統稱食物)中必需胺基酸的量。例如，食物中常常添加額外的蛋白。
遺傳工程技術提供了製造含有更多量的必需胺基酸的強化食物的更有效方法。例如，可以將食物蛋白中的非必需胺基酸替換為必需胺基酸，從而提高食物中該蛋白的營養價值。此外，這種強化蛋白可以在植物或者在摻入食物中的種子中組成型表達。結果是，該強化蛋白以相對較高水平出現在食物中，導致，例如，動物膳食的營養顯著改善。
顯然該領域存在著對包含更多量的必需胺基酸的強化蛋白的需要。這類蛋白可以顯著改進動物飼料的營養價值，從而提高商業化動物產品的質和量。這類蛋白也可以顯著改進內人類食物的營養價值，從而減少營養不良和相關健康問題的發生，並促進嬰兒和兒童的總體生長和發育。
發明概述本發明包括並提供了一種修飾的多肽，它在具有胺基酸序列SEQ IDNO1的未經修飾的多肽中摻入了一或多個選自異亮氨酸或色氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的多肽能在種子中積累。
本發明包括並提供了一種修飾的多肽，它在未經修飾的胺基酸序列SEQ ID NO1中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的多肽能在種子中積累。
本發明包括並提供了一種修飾的β-伴大豆球蛋白(conglycinin)多肽，它在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
本發明包括並提供了編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽的重組核酸分子，所述多肽在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
本發明包括並提供了一種細胞，在該細胞中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
本發明包括並提供了一種轉基因植物，在該植物中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
本發明包括並提供了一種轉基因植物種子，其中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿蔔，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉(Douglas fir)，桉(Eucalyptus)，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松(Loblolly pine)，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿蔔，Radiatapine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香(Sweetgum)，茶，菸草，番茄，turf，或小麥植物。
本發明包括並提供了從轉基因植物的種子得到的植物，其中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿蔔，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿蔔，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，菸草，番茄，turf，或小麥植物。
本發明包括並提供了含有轉基因植物種子的動物飼料，其中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿蔔，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿蔔，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，菸草，番茄，turf，或小麥植物。
本發明包括並提供了含有轉基因植物的動物飼料，其中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQ IDNO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿蔔，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿蔔，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，菸草，番茄，turf，或小麥植物。
本發明包括並提供了含有從轉基因植物種子得到的植物的動物飼料，其中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿蔔，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿蔔，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，菸草，番茄，turf，或小麥植物。
本發明包括並提供了含有從轉基因植物種子得到的植物的人類食物，其中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿蔔，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿蔔，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，菸草，番茄，turf，或小麥植物。
本發明包括並提供了含有轉基因植物的人類食物，其中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQ IDNO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿蔔，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿蔔，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，菸草，番茄，turf，或小麥植物。
本發明包括並提供了含有從轉基因植物種子得到的植物的人類食物，其中，按照5』到3』的方向，包含異源啟動子以及與其可操作相連的重組核酸分子，所述核酸分子編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，該多肽在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未經修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中摻入了一或多個選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或組氨酸的必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累，且其中所述植物是苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿蔔，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿蔔，Radiata pine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，菸草，番茄，turf，或小麥植物。


圖1是pMON39328的圖譜。
圖2是pMON39329的圖譜。
圖3是pMON39335的圖譜。
序列描述SEQ ID NO1是野生型大豆(Glycine max)7S-β-伴大豆球蛋白亞單位原蛋白胺基酸序列。
SEQ ID NO2是SEQ ID NO1所示野生型大豆(Glycine max)7S-β-伴大豆球蛋白亞單位原蛋白胺基酸序列，但其中的殘基1-25和416-439未顯示。
SEQ ID NO3 is a wild-type Glycine max 7S-β-伴大豆球蛋白β亞單位的cDNA序列。
SEQ ID NO4是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO5是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO6是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO7是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO8是編碼FLAG表位的DNA序列。
SEQ ID NO9是FLAG胺基酸表位序列。
SEQ ID NO10是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO11是寡核苷酸引物。
SEQ ID NO12是由pMON39328編碼的β-伴大豆球蛋白β亞單位的表位(FLAG)-標記形式。
SEQ ID NO13是pMON39328中編碼β-伴大豆球蛋白β亞單位的表位(FLAG)-標記形式的核苷酸序列。
SEQ ID NO14是由pMON39329編碼的β-伴大豆球蛋白β亞單位胺基酸序列(加上由起始密碼子編碼的甲硫氨酸)的成熟形式，不帶有FLAG表位。
SEQ ID NO15是pMON39329中編碼不帶有FLAG表位的β-伴大豆球蛋白β亞單位成熟形式的核苷酸序列。
SEQ ID NOs16-83是寡核苷酸引物序列。
SEQ ID NO84是突變體39335-14的編碼序列。
SEQ ID NO85是突變體39335-41的編碼序列。
SEQ ID NO86是突變體39335-58的編碼序列。
SEQ ID NO87是突變體39335-78的編碼序列。
SEQ ID NO88是pMON69616中的核苷酸序列。
SEQ ID NO89是pMON69616的胺基酸序列。
SEQ ID NO90是pMON64016中的核苷酸序列。
SEQ ID NO91是pMON64016的胺基酸序列。
SEQ ID NO92是pMON64015中的核苷酸序列。
SEQ ID NO93是pMON64015的胺基酸序列。
SEQ ID NO94是pMON64019中的核苷酸序列。
SEQ ID NO95是pMON019的胺基酸序列。
SEQ ID NO96是pMON69621中的核苷酸序列。
SEQ ID NO97是pMON69621的胺基酸序列。
定義以下定義可以幫助理解對本發明的詳細描述。
本文中「序列同一性」是指，兩個最佳比對的多核苷酸或肽序列在諸如核苷酸或胺基酸等組分的整個比對窗中保持一致的程度。測試序列和參考序列的比對片段的「同一性分數」，是將這兩個比對序列共有的相同組分的數目除以參考序列片段(即整個參考序列或該參考序列的一部分)中組分總數得到的。「同一性百分比」是將同一性分數乘以100得到的。
對於一種具體的生物而言，「必需胺基酸」是該生物本身不能合成、因此必需從其膳食中獲得的那些胺基酸。必需胺基酸在不同動物中是不同的，這取決於動物物種，可包括蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，組氨酸，亮氨酸和苯丙氨酸中的一或多種。
「抗原性表位」是指分子、蛋白、或核酸中能激發免疫應答、從而導致產生與該抗原性表位反應的抗體的任何不連續的片段。
短語「編碼序列」，「開放讀框」，「結構序列」以及「結構核酸序列」是指一種包含有序排列的核酸的物理結構。所述核酸以一組核酸三聯體的形式排列，其中每一個三聯體形成一個密碼子。每一密碼子編碼一種具體的胺基酸。因此，編碼序列、結構序列、和結構核酸序列編碼一系列胺基酸，這些胺基酸形成蛋白、多肽、或肽序列。編碼序列，結構序列，和結構核酸序列可以包含在較大的核酸分子、載體等結構中。此外，這些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附圖、附表、電子媒介等形式進行描述。
術語「DNA序列」，「核酸序列」和「核酸分子」是指一種包含有序排列的核酸的物理結構。所述DNA序列或核酸序列可以包含在較大的核酸分子、載體等結構中。此外，這些序列中核酸的有序排列可以用序列表、附圖、附表、電子媒介等形式進行描述。
術語「表達」是指基因轉錄，產生相應的mRNA，並翻譯該mRNA以產生相應的基因產物(即，肽，多肽，或蛋白)。
術語「反義RNA的表達」是指對DNA進行轉錄，從而產生第一種RNA分子，後者能與第二種RNA分子雜交。
術語「基因」是指編碼肽、多肽、蛋白的染色體DNA、質粒DNA、cDNA、合成的DNA、或其它DNA，或者是RNA分子。
「同源性」是指兩個或多個核酸序列或胺基酸序列之間以位置同一性百分比表示的相似性(即，序列相似性或同一性)。
術語「異源」是指兩個或更多個不同來源的核酸序列或蛋白序列之間的關係。例如，啟動子如果在自然界通常的情況中不與編碼序列組合在一起，那麼該啟動子相對於該編碼序列是異源的。此外，一個具體序列可以相對於它插入至其中的細胞或生物為「異源」的(即，並非該具體細胞或生物所天然具有的)。
「雜交」是指一條核酸鏈與一條互補鏈通過鹼基配對來相連的能力。當兩條核酸鏈中的互補核酸序列在適當條件下彼此相遇，就可發生雜交。
「核酸」是指脫氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA)。
「表型」是指基因型與環境相互作用導致生物表現出的特性。
「聚腺苷酸化信號」或「polyA信號」是指一種核酸，它位於編碼區的3』側，它能啟動腺苷酸添加在由該編碼區轉錄的mRNA的3』末端。
術語「可操作相連」是指兩個或更多個核酸區域或核酸序列的功能性空間排列。例如，啟動子區相對於核酸序列的位置可以使該核酸序列在該啟動子區的指導下進行轉錄。此時，該啟動子區與該核酸序列「可操作相連」。
術語「啟動子」或「啟動子區」是指通常發現於編碼序列上遊(5』)的、能指導該核酸序列轉錄為mRNA的一種核酸序列。啟動子或啟動子區通常提供RNA聚合酶的識別位點以及轉錄的正確起始所需的其它因子。本文中，啟動子或啟動子區包括通過插入或缺失調節區，對啟動子進行隨機或定點誘變等方式而進行改變的啟動子。啟動子的活性或強度如下測量將其在細胞或組織中產生的RNA的量，或積累的蛋白的量，與已經評估過轉錄活性的啟動子進行比較。
術語「重組核酸載體」和「重組載體」是指諸如質粒，粘粒，病毒，自我複製序列，噬菌體，線性單鏈、環狀單鏈、線性雙鏈、或環狀雙鏈DNA或RNA核苷酸序列等任何物質。重組載體可以來自任何來源，它能進行基因組整合或自我複製，它包含與一或多個核酸序列可操作相連的啟動子核酸序列。重組載體通常用於將所述可操作相連的序列引入適當的宿主。
「再生」是指從植物細胞或植物組織(例如植物原生質體或外植體)生長成植物的過程。
「選擇標記」是指一種核酸序列，其表達導致的表型有利於鑑定包含該核酸序列的細胞。選擇標記包括賦於對毒性化合物的抗性(例如，氨苄青黴素抗性，卡那黴素抗性)的那些，能彌補營養缺陷的那些(例如，尿嘧啶，組氨酸，亮氨酸)，或者帶來可以觀察的區別性特徵的那些(例如，顏色改變或螢光)。
「轉錄」是指從DNA模板產生RNA拷貝的過程。
「轉基因」是指整合了外源核酸序列的生物。
「載體」是指將外源DNA帶入宿主生物中的質粒，粘粒，噬菌體或病毒。
「調節序列」是指位於編碼序列上遊(5』)、內部或下遊(3』)的核苷酸序列。編碼序列的轉錄和表達通常受到調節序列存在與否的影響。
術語「充分同源」(substantially homologous)是指，用本文所述BestFit程序(版本10；Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)以默認參數測定，序列同一性至少90％的兩個序列。
術語「轉化」是指將核酸引入受體宿主的過程。術語「宿主」是指細菌細胞，真菌，動物或動物細胞，植物或種子，或植物的任何部分或組織，包括原生質體，愈傷組織，根，塊莖，種子，莖，葉，幼苗，胚和花粉。
本文中術語「轉基因植物」是指一種植物，其中所引入的核酸已經穩定引入該植物的基因組，例如，核基因組或質體基因組中。
本文中術語「基本純」(substantially purified)是指一種分子，它與自然狀態下通常與它相伴的基本上所有其它分子分開。更優選基本純的分子是製劑中的優勢種類。基本純的分子可以是約60％以上，優選約75％以上，更優選約90％以上，最優選約95％以上與天然混合物中其它分子(除了溶劑以外)脫離。術語「基本純」並不想涵蓋處於天然狀態的分子。
具體實施方案本發明包括並提供鏈包含更高水平的必需胺基酸的修飾多肽，其應用方法，設計方法和製備方法。所述修飾多肽的特徵在於，與改造前的未修飾多肽相比，營養含量增加。
多肽序列本發明包括並提供鏈一種修飾的多肽，它所包含的必需胺基酸的水平提高。所述修飾多肽的特徵在於，與未修飾的多肽相比，營養含量增加。所述修飾的多肽通常在未修飾多肽的胺基酸序列中添加或取代鏈至少一個必需胺基酸。所述必需胺基酸選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，或組氨酸。在一個優選實施方案中，所述修飾的多肽通常在未修飾多肽的胺基酸序列中取代至少一個必需胺基酸。在一個更優選的實施方案中，所述修飾的多肽通常在未修飾多肽的胺基酸序列中取代至少一個色氨酸或異亮氨酸殘基。
本文中胺基酸的「取代」是指，將蛋白質中的一種胺基酸用另一種胺基酸代替。故「取代」不改變所修飾的蛋白質中胺基酸的總數。在一個優選實施方案中，所修飾的多肽能在細胞中積累。在另一實施方案中，所修飾的多肽能在種子中積累。本文中「在種子中積累」或者「在細胞中積累」是指，該多肽在種子或細胞中產生和維持的速度大於被降解的速度。在另一個優選實施方案中，所修飾的多肽能形成三聚體。本文中，當一種蛋白在細胞環境中被翻譯時能自我裝配並三聚體化，則該蛋白「能形成三聚體」。在一個優選實施方案中，所修飾的多肽的三聚體化水平是未修飾的多肽的三聚體化水平的10％，更優選20，30，40，50，60，70，80，90，95，和99％，如下文的實施例6所測定的那樣。
修飾的多肽通常可以是適合於摻入動物膳食中的任何多肽。這種多肽優選選自，在給定的植物組織中以相對較高濃度表達的多肽，如種子貯藏蛋白， 營養貯藏蛋白，酶，或結構蛋白。修飾的多肽更優選修飾的β-伴大豆球蛋白，大豆球蛋白，7S貯藏球蛋白，11S貯藏球蛋白，清蛋白，谷醇溶蛋白，arcelin，或豆血紅蛋白多肽。
在本發明的一個實施方案中，修飾的多肽在相對於未修飾多肽而言的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個胺基酸位置具有賴氨酸殘基取代。
在本發明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對於未修飾多肽而言的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個胺基酸位置具有甲硫氨酸殘基取代。
在本發明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對於未修飾多肽而言的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個胺基酸位置具有蘇氨酸殘基取代。
在本發明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對於未修飾多肽而言的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個胺基酸位置具有纈氨酸殘基取代。
在本發明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對於未修飾多肽而言的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個胺基酸位置具有精氨酸殘基取代。
在本發明的另一個實施方案中，修飾的多肽在相對於未修飾多肽而言的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個胺基酸位置具有組氨酸殘基取代。
在一個優選實施方案中，修飾的多肽在相對於未修飾多肽而言的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個胺基酸位置具有色氨酸殘基取代。
在一個優選實施方案中，修飾的多肽在相對於未修飾多肽而言的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，或50個胺基酸位置具有異亮氨酸殘基取代。
在一個更優選方面，修飾的多肽是β-伴大豆球蛋白多肽(SEQ ID NO1)，且該多肽在未修飾的β-伴大豆球蛋白序列(SEQ ID NO1，未顯示出末端時就是SEQ ID NO2)中，選自N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y158；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；或Y411的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或22個胺基酸位置，具有必需胺基酸色氨酸的取代。
修飾的多肽優選是β-伴大豆球蛋白多肽(SEQ ID NO1)，且該多肽在未修飾的β-伴大豆球蛋白序列(SEQ ID NO1，未顯示出末端時就是SEQ IDNO2)中至少兩個，更優選選自N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N117；L118；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K317；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；或V413的至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，或74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，或84個胺基酸位置，具有必需胺基酸異亮氨酸的取代。
在一個優選實施方案中，所述修飾的多肽被進一步修飾，從而至少一種，更優選2，3或4種選自組氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸或苯丙氨酸的必需胺基酸的含量增加。也可以產生其它胺基酸取代，以便能增強該多肽的結構和營養。
在本發明另一個優選實施方案中，修飾的多肽在未修飾的β-伴大豆球蛋白序列中，選自N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y158；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；或Y411的至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，或22個胺基酸位置，具有必需胺基酸色氨酸的取代，並且在未修飾的β-伴大豆球蛋白序列中，選自N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N1 17；L118；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K317；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；或V413的至少1個，更優選至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，或74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，或84個胺基酸位置，具有必需胺基酸異亮氨酸的取代。
在一個優選方面，修飾的β-伴大豆球蛋白多肽相對於未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽包含一或多個必需胺基酸取代。在一個更優選的方面，修飾的β-伴大豆球蛋白多肽包括兩個或更多個必需胺基酸取代，其中所述必需胺基酸是色氨酸和異亮氨酸。在一個優選方面，修飾的多肽具有至少1個，更優選2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106個色氨酸或異亮氨酸取代，為任意組合，其中色氨酸取代是N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y158；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；和Y411中的一個或更多個，異亮氨酸取代是N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N117；L1 18；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K3 1 7；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；和V413中的一個或更多個。
修飾的多肽還可以進一步修飾以便提供額外的所需特性。例如，修飾的多肽可以通過進一步修飾而增加其它必需胺基酸的含量，增強胺基酸序列的翻譯，改變翻譯後修飾(例如，磷酸化或糖基化位點)，將該多肽轉運到細胞內側或外側的空間中，插入或刪除細胞信號傳遞基元，等。
在本發明另一個實施方案中，修飾的多肽在相對於未修飾多肽的至少1個，更優選至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，約30，約35，約40，約45，或約50個胺基酸位置，具有選自異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、精氨酸或組氨酸的一個或更多個，兩個或更多個，或者三個或更多個胺基酸殘基的取代。
在一個優選實施方案中，修飾的蛋白與未修飾的多肽相比，蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，或精氨酸，或它們的任意組合，的含量增加超過0.25％，0.5％，1％，2％，3％，5％，7％，10％，15％或20％(重量比)。
在一個優選實施方案中，修飾的β-伴大豆球蛋白多肽未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽相比，蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，或精氨酸，或它們的任意組合，的含量增加超過0.25％，0.5％，1％，2％，3％，5％，7％，10％，15％或20％(重量比)。
核酸分子本發明包括並提供一種編碼本發明修飾多肽的重組核酸分子，所述多肽的必需胺基酸水平增加。
核酸雜交是DNA操作領域技術人員已知的技術。一對具體核酸的雜交特性可指示它們的相似性或同一性。
核酸分子優選在低度、中度、或高度嚴格條件下，與本發明的任何核酸序列雜交。
雜交條件通常包括在0.1X-約10X SSC(由含有3M氯化鈉和0.3M檸檬酸鈉，pH 7.0的20X SSC原液用蒸餾水稀釋而成)，約2.5X-約5XDenhardt溶液(由含有1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll，和1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮的50X原液用蒸餾水稀釋而成)，約10mg/mL-約100mg/mL魚精DNA，以及約0.02％(w/v)-約0.1％(w/v)SDS中進行核酸雜交，於大約20℃-大約70℃保溫數小時到保溫過夜。優選雜交條件為6X SSC，5XDenhardt溶液，100mg/mL魚精DNA，和0.1％(w/v)SDS，55℃保溫數小時。
雜交之後通常進行數個洗滌步驟。洗滌組合物通常包含0.1X-約10XSSC，以及0.01％(w/v)-約0.5％(w/v)SDS，約20℃-約70℃保溫15分鐘。優選地，當在0.1X SSC中65℃洗滌至少一次以後，核酸片段仍保持雜交。例如，洗滌步驟中的鹽濃度可以從低度嚴格條件的約2.0X SSC、50℃到約高度嚴格條件的0.2X SSC、65℃中選擇。此外，洗滌步驟中的溫度可以從低度嚴格條件的室溫，約22℃，增加到高度嚴格條件的約65℃。溫度和鹽都可以變動，也可以使溫度和鹽濃度這二者之一保持恆定而改變另一個。
低度嚴格條件可用於選擇與靶核酸序列的序列同一性較低的核酸序列。可以採用諸如如下的條件進行洗滌約6.0X SSC-約10X SSC、約20℃-約55℃，優選核酸分子在約6.0X SSC和約45℃的低度嚴格條件下與本發明的一或多種核酸分子雜交。在一個優選實施方案中，核酸分子在約2.0X SSC和約65℃的中度嚴格條件下與本發明的一或多種核酸分子雜交。在一個特別優選的實施方案中，本發明的核酸分子在約0.2X SSC和約65℃的高度嚴格條件下與上述核酸分子雜交。
本發明的核酸序列優選與編碼本文所述任何多肽，其互補序列，或其任意片段的互補核酸序列雜交。
本發明的核酸序列優選在低度嚴格條件下，與編碼本文所述任何多肽，其互補序列，或其任意片段的互補核酸序列雜交。
本發明的核酸序列優選在高度嚴格條件下，與編碼本文所述任何多肽，其互補序列，或其任意片段的互補核酸序列雜交。
序列同一性百分比優選用Sequence Analysis Software PackageTM(版本10；Genetics Computer Group，Inc.，University of Wisconsin BiotechnologyCenter，Madison，WI)的「Best Fit」或「Gap」程序來確定。「Gap」是利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，1970)來找出兩個序列的對比排列，它使匹配數最大並使空隙數最小。「BestFit」是對兩個序列之間的最相似片段進行最佳對比排列，它還利用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)插入空隙以便使匹配數最大。同一性百分比最優選用「Best Fit」程序及其默認參數來確定。
在一個實施方案中，所述片段為本發明核酸分子的3000-1000個連續核苷酸，1800-150個連續核苷酸，1500-500個連續核苷酸，1300-250個連續核苷酸，1000-200個連續核苷酸，800-150個連續核苷酸，500-100個連續核苷酸，300-75個連續核苷酸，100-50個連續核苷酸，50-25個連續核苷酸，或20-10個連續核苷酸。
在另一實施方案中，所述片段包含本發明核酸序列的至少20，30，40或50個連續核苷酸。
啟動子在一個優選實施方案中，本文所公開的任何一種核酸分子可以與啟動子可操作相連。在一個特別優選的實施方案中，啟動子選自11S大豆球蛋白啟動子，USP蠶豆(Vicia faba)啟動子，或7Sα啟動子。在另一個實施方案中，啟動子具有組織或器官特異性，優選種子特異性。
在一個方面，如果mRNA在一種組織或器官中的表達水平比在另一種組織或器官中的表達水平高出至少10倍，優選至少約100倍或至少約1,000倍，則認為該啟動子是特異於該組織或器官的。mRNA的水平可以在單個時間點測量，也可以在多個時間點測量，從而倍數增加可以是平均倍數增加，或者是從實驗測量值外推得到的值。由於這是水平的比較，因此可以使用任何測量mRNA的方法。在一個優選方面，進行比較的組織或器官是種子或帶有葉片或葉片組織的種子組織。在另一個優選方面，對多個組織或器官進行比較。優選的多重比較是將種子或種子組織與選自下組的二、三、四或更多種組織或器官進行比較花組織，花原端，花粉，葉，胚，苗，葉原基，苗端，根，根尖，維管組織和子葉。本文中植物器官的例子是，種子，葉，根等，組織的例子是葉原基，苗端，維管組織等。
啟動子的活性或強度可用mRNA的量或該RNA所特別產生的蛋白的積累量相對於mRNA或蛋白的總量來定量。所述啟動子優選表達可操作連接的核酸序列，其水平佔總mRNA的2.5％以上；更優選佔5，6，7，8，或9％以上；還更優選佔10，11，12，13，14，15，16，17，18，或19％以上；最優選佔20％以上。
或者，啟動子的活性或強度可表示為已知啟動子(其轉錄活性已經過評估)的相對量。例如，可將目標啟動子與報告序列(例如，GUS)可操作相連，並將其引入特定類型的細胞。用類似方法製備已知啟動子，將其引入相同的細胞內環境中。通過比較相對於已知啟動子而言的報告分子表達量，可確定目標啟動子的轉錄活性。細胞內環境優選大豆。
修飾的結構核酸序列本發明的核酸還可與異源的修飾型結構核酸序列相連。可以對結構核酸序列進行修飾，以便提供各種所需特性。例如，可以對結構核酸序列進行修飾以增加必需胺基酸的含量，促進對胺基酸序列的翻譯，改變翻譯後修飾(例如，磷酸化位點)，將翻譯出的產物轉運至細胞的內側或外側的空間中，增加蛋白的穩定性，插入或刪除細胞信號傳遞基序，等等。
核酸序列中的密碼子應用特點由於遺傳密碼的簡併性，可以用不同的核苷酸密碼子編碼給定的胺基酸。宿主細胞常常表現出優選的密碼子應用模式。優選結構核酸序列經過構建能利用具體宿主細胞的密碼子應用模式。這通常能增強該結構核酸序列在轉化的宿主細胞中的表達。可對上述任一種核酸和胺基酸序列進行修飾，以反映容納它們的宿主細胞或生物所優選的密碼子應用特性。在植物中修飾結構核酸序列，使密碼子應用最優化的方法可參見美國專利5,689,052。
對結構核酸序列的其它修飾上述結構核酸序列中的其它變化可編碼出與改造前的蛋白相比等效或更優秀的蛋白。突變包括對基序序列進行缺失，插入，截短，取代，融合，改組等。
對結構核酸序列的突變可通過特定方式或隨機方式引入，這兩種方式都是分子生物學領域技術人員已知的。定點誘變技術有很多種，它們通常利用寡核苷酸將突變引入結構核酸序列中的特定位置。實例包括單鏈拯救(Kunkel等，1985)，唯一位點的消除(Deng和Nickloff，1992)，切口(nick)保護(Vandeyar等，1988)，及PCR(Costa等，1996)。隨機或非特異性突變可通過化學試劑產生(綜述參見，Singer和Kusmierek，1982)，如亞硝基胍(Cerda-Olmedo等，1968；Guerola等，1971)和2-氨基嘌呤(Rogan和Bessman，1970)；或通過生物學方法產生，如由突變株傳代(Greener等，1997)。
對核酸序列的修飾可以導致或不導致胺基酸序列中的改變。由於遺傳密碼簡併性導致的改變不影響改變後的密碼子所編碼的胺基酸。在一個優選實施方案中，編碼修飾蛋白的核酸有5-500個這樣的改變，更優選10-300個改變，還更優選25-150個改變，最優選1-25個改變。在另一優選實施方案中，本發明核酸分子包括與如此修飾的核酸分子有80，85，90，95或99％的序列同一性的那些核酸分子。在另一實施方案中，本發明的核酸分子包括與如此修飾的核酸分子雜交的那些核酸分子，以及在低度或高度嚴格條件下與如此修飾的核酸分子雜交的那些核酸分子。
第二種改變包括在核酸序列中進行添加、刪除和取代，它們可導致改變胺基酸序列。在一個優選實施方案中，編碼修飾蛋白的核酸有5-500個這樣的改變，更優選10-300個改變，還更優選25-150個改變，最優選1-25個改變。在另一優選實施方案中，本發明核酸分子包括與如此修飾的核酸分子有80，85，90，95或99％的序列同一性的那些核酸分子。在另一實施方案中，本發明的核酸分子包括與如此修飾的核酸分子雜交的那些核酸分子，以及在低度或高度嚴格條件下與如此修飾的核酸分子雜交的那些核酸分子。
產生上述改變的其它方法參見Ausubel等(1995)；Bauer等(1985)；Craik(1985)；Frits Eckstein等(1982)；Sambrook等(1989)；Smith等(1981)；Osuna等(1994)。
可以對本發明的蛋白序列以及編碼它們的核酸節段進行修飾但保留所述分子的所需特性。以下是關於對蛋白的胺基酸序列進行改變來產生等效，或者可能更優良的第二代分子的討論。胺基酸改變可以通過改變結構核酸序列的密碼子來實現，密碼子參見表1。
表1胺基酸的密碼子簡併性

可以在不明顯損失所需活性的前題下，將蛋白序列中特定的胺基酸取代為其它胺基酸。從這一點上來看，可以在所公開的蛋白序列的肽序列，或它們的相應核酸序列中進行多種改變而不明顯損失生物活性。
在製造這類改變時，可考慮胺基酸的疏水/親水傾向性指數。胺基酸的疏水/親水傾向性指數在賦於蛋白質以交互式生物功能方面的重要性已為領域內廣泛理解(Kyte和Doolittle，1982)。可以接受的是，胺基酸的相對疏水/親水傾向性決定所得蛋白的二級結構，而後者又限定了該蛋白與其它分子，如酶，底物，受體，DNA，抗體，抗原等的相互作用。
每種胺基酸基於其疏水性和荷電特性而分配了一個疏水/親水傾向性指數。具體是異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；穀氨酸/穀氨醯胺/天冬氨酸/天冬醯胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。
本領域已知，特定胺基酸可以被具有相似疏水/親水傾向性指數或評分的其它胺基酸取代，所得蛋白質仍具有相似的生物活性，即，仍能獲得生物功能性蛋白。在製造這類改變時，疏水/親水傾向性指數在±2以內的胺基酸的取代為優選，在±1以內的為更優選，在±0.5以內的為最優選。
本領域也能理解，可以在親水性的基礎上有效地進行相似胺基酸的取代。美國專利4,554,101(Hopp，T.P，1985年11月19日授權)稱，一種蛋白質上受其鄰接胺基酸的親水性控制的最大局部平均親水性與該蛋白的生物學特性相關。胺基酸的親水值如下精氨酸/賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸/穀氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬醯胺/穀氨醯胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸/組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸/異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
可理解，一種胺基酸可以被具有相似的親水評分值的另一種胺基酸取代，所得蛋白質仍具有相似的生物活性，即，仍能獲得生物功能性蛋白。在製造這類改變時，疏水/親水傾向性指數在±2以內的胺基酸的取代為優選，在±1以內的為更優選，在±0.5以內的為最優選。
綜上所述，胺基酸取代因此是基於胺基酸側鏈取代基的相對相似性，例如，它們的疏水性，親水性，電荷，大小，等等。涉及上述多種特性的取代實例為本領域眾所周知，它們包括精氨酸和賴氨酸；穀氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；穀氨醯胺和天冬醯胺；纈氨酸，亮氨酸，和異亮氨酸。對於不能預計有利的那些改變，如果能使所得的蛋白質與原始未經改造的多肽相比，瘤胃抗性增強和/或對蛋白裂解性降解作用的抗性增強，則也可以使用。
重組載體上述任何啟動子和結構核酸序列都可提供在重組載體中。重組載體通常按5』至3』方向依次包含能指導結構核酸序列轉錄的啟動子，以及結構核酸序列。重組載體還可根據需要而包含3』轉錄終止子，3』聚腺苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉位及靶向核酸序列，選擇標記，增強子，和操縱子。
製備重組載體的方式為本領域已知。製備特別適於植物轉化的重組載體的方法可參見美國專利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。對這些類型的載體已有綜述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)。
用於在高等植物中進行核酸表達的典型載體為本領域已知，包括來自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的腫瘤誘導(Ti)質粒的載體(Rogers等，1987)。其它可用於植物轉化的重組載體，包括pCaMVCN轉移控制載體，也已有記載(Fromm等，1985)。
重組載體中的附加啟動子重組載體中還可提供一個或更多個附加啟動子。這些啟動子可以，例如，但不限於，與上述任何結構核酸序列可操作相連。或者，所述啟動子可與其它核酸序列，如編碼轉位肽、選擇標記蛋白的那些序列、或反義序列，可操作相連。
這些附加啟動子可根據載體所要插入的細胞的類型來選擇。在細菌、酵母和植物中具有功能的啟動子為本領域已知。附加的啟動子還可以根據它們的調節特性來選擇。這些特性的實例包括對轉錄活性、誘導能力、組織特異性、以及發育階段特異性的強化作用。已有文獻描述了植物中的誘導型啟動子，病毒來源的或合成的啟動子，組成型啟動子，時間調節型啟動子，以及空間調節型啟動子(Poszkowski等，1989；Odell等，1985；Chau等，1989)。
常用的組成型啟動子包括CaMV 35S啟動子(Odell，J.T.等，1985)，增強型CaMV 35S啟動子，玄參花葉病毒(FMV)啟動子(Richins等，1987)，甘露氨酸合成酶(mas)啟動子，胭脂氨酸合成酶(nos)啟動子，以及章魚氨酸合成酶(ocs)啟動子。
有用的誘導型啟動子包括由水楊酸或聚丙烯酸誘導的啟動子(PR-1；Williams，S.W.等，1992)，由於應用安全劑而誘導的啟動子(取代的苯磺醯胺除草劑；Hershey and Stoner.，1991)，熱休克啟動子(Ou-Lee等，1986；Ainley等，1990)，來源於菠菜亞硝酸根還原酶結構核酸序列的硝酸根誘導型啟動子(Back等，1991)，激素誘導型啟動子(Yamaguchi-Shinozaki等，1990；Kares等，1990)，與RuBP羧化酶和LHCP家族的小亞單位結合的光誘導型啟動子(Kuhlemeier等，1989；Feinbaum等，1991；Weisshaar等，199l；Lam and Chua，1990；Castresana等，1988；Schulze-Lefert等，1989)。
有用的組織特異性或器官特異性啟動子的實例包括β-伴大豆球蛋白7Sα』啟動子(Doyle，J.J.等，1986；Slighton and Beachy，1987)，和其它種子-特異性啟動子(Knutzon等，1992；Bustos等，1991；Lam and Chua，1991；Stayton等，1991)。可用於在種子質體中優先表達的植物功能性啟動子，包括來自植物貯藏蛋白的啟動子，以及來自與含油種子中脂肪酸生物合成有關的蛋白的啟動子。這類啟動子的實例包括下列結構核酸序列的5』調節區napin(Kridl等，1991)，菜豆蛋白，玉米醇溶蛋白，大豆胰蛋白酶抑制劑，ACP，硬脂醯-ACP去飽和酶，和油質蛋白。對種子-特異性調節作用的描述可參見EP 0 255 378。
另一例種子特異性啟動子是凝集素啟動子。大豆種子中的凝集素蛋白由單個結構核酸序列(Lel)編碼，該序列僅在種子成熟期表達。凝集素結構核酸序列和種子特異性啟動子已被鑑定出，並用於指導轉基因菸草植物中的種子特異性表達(Vodkin等，1983；Lindstrom等，1990)。
重組載體中特別優選的附加啟動子包括攜帶在根癌土壤桿菌腫瘤誘導質粒上的胭脂氨酸合成酶(nos)啟動子，甘露氨酸合成酶(mas)啟動子，以及章魚氨酸合成酶(ocs)啟動子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動子；增強型CaMV 35S啟動子；玄參花葉病毒(FMV)35S啟動子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亞單位的光誘導型啟動子；菸草EIF4A啟動子(Mandel等，1995)；穀物蔗糖合成酶1(Yang和Russell，1990)；谷醇脫氫酶1(Vogel等，1989)；穀物光收穫複合物(Simpson，1986)；穀物熱休克蛋白(Odell等，1985)；擬南芥殼多糖酶啟動子(Samac等，1991)；花椰菜LTP(脂轉移蛋白)啟動子(Pyee等，1995)；矮牽牛查耳酮異構酶(Van Tunen等，1988)；菜豆甘氨酸富集蛋白1(Keller等，1989)；土豆patatin(Wenzler等，1989)；玉米遍在蛋白啟動子(Christensen等，1992)；以及水稻肌動蛋白啟動子(McElroy等，1990)。
附加啟動子優選具有種子選擇性，組織選擇性，為組成型或誘導型。最優選的啟動子為胭脂氨酸合成酶(nos)，章魚氨酸合成酶(ocs)，甘露氨酸合成酶(mas)，花椰菜花葉病毒19S和35S(CaMV19S，CaMV35S)，增強型CaMV(eCaMV)，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)，玄參花葉病毒(FMV)，CaMV衍生的AS4，菸草RB7，小麥POX1，菸草EIF-4，凝集素蛋白(Lel)，或水稻RC2的啟動子。
帶有附加的結構核酸序列的重組載體重組載體還可包含一或多個附加的結構核酸序列。這些附加結構核酸序列通常為適於在重組載體中使用的任何序列。這樣的結構核酸序列包括，但不限於，上述任一種結構核酸序列及其修飾形式。附加結構核酸序列還可與上述任一種啟動子可操作相連。所述一或多個結構核酸序列可分別與不同(separate)啟動子可操作相連。或者，多個結構核酸序列可與單個啟動子可操作相連(即，單個操縱子)。
附加結構核酸序列優選編碼種子貯藏蛋白，除草劑抗性蛋白，疾病抗性蛋白，脂肪酸生物合成酶，維生素E生物合成酶，胺基酸生物合成酶，或殺蟲蛋白。優選的結構核酸序列包括，但不限於，γ甲基轉移酶、葉綠基異戊烯轉移酶、β-酮脂醯-CoA合酶、脂醯CoA還原酶、脂醯CoA脂醇轉醯酶、鄰氨基苯甲酸合酶、蘇氨酸脫氨酶、乙醯羥酸合成酶、天冬氨酸激酶、二羥酸合成酶、天冬氨酸激酶、二氫吡啶甲酸合成酶、硫酯酶、7Sa種子貯藏蛋白、11S種子貯藏蛋白、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、菜豆蛋白、玉米球蛋白-1、玉米醇溶蛋白、種子清蛋白、或種子凝集素。
或者，可將第二種結構核酸序列設計成能下調特定的核酸序列。這通常通過將第二種結構胺基酸按照反義方向與啟動子可操作相連來實現。本領域技術人員很熟悉這類反義技術。該方法也已在上文中簡述。任何核酸序列都可能以這種方式進行負調節。優選的目標核酸序列包含低含量的必需胺基酸、但在特定組織中以相對較高水平表達。例如，β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白都在種子中大量表達，但在營養方面缺少必需胺基酸。這種反義方法也可用於有效除去植物來源的食物中其它不想要的蛋白，如拒食劑(例如，凝集素)，清蛋白，和變應原。
選擇標記重組載體還可包含選擇標記。能用作選擇標記的核酸序列產生細胞表型，使這些細胞比不含該標記的細胞更容易被鑑定。
選擇標記的實例包括，但不限於neo基因(Potrykus等，1985)，它編碼卡那黴素抗性基因，可用卡那黴素，G418等進行篩選；bar基因，它編碼bialaphos抗性；突變的EPSP合成酶基因(Hinchee等，1988)，它編碼草甘膦抗性；腈水解酶基因，它賦予對溴苯腈的抗性(Stalker等，1988)；突變的乙醯乳酸合成酶基因(ALS)，它賦予對咪唑啉酮或磺脲的抗性(歐洲專利申請0154204)；綠色螢光蛋白(GFP)；以及氨甲喋呤抗性DHFR基因(Thillet等，1988)。
選擇標記的其它實例包括β-葡萄糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，它編碼一種酶，該酶的多種顯色底物是已知的(Jefferson(I)，1987；Jefferson(II)等，1987)；一種R-座基因，它編碼一種產物，該產物調節植物組織中花色素苷(紅色)的產生(Dellaporta等，1988)；β-內醯胺酶基因(Sutcliffe等，1978)，它編碼一種酶，該酶的多種顯色底物是已知的(例如，PADAC，一種顯色的頭孢菌素)；螢光素酶基因(Ow等，1986)；xy1E基因(Zukowsky等，1983)，它編碼一種兒茶酚雙加氧酶，此酶可轉化顯色型兒茶酚；α-澱粉酶基因(Ikatu等，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等，1983)，它編碼一種能將酪氨酸氧化為DOPA和多巴醌(dopaquinone，進一步濃縮為黑色素)的酶；α-半乳糖苷酶，可使α-半乳糖底物顏色發生轉變。
術語「選擇標記」還包括編碼選擇標記的基因，所述選擇標記是指其檢測可作為鑑定或篩選轉化細胞的手段的那些。實例包括編碼可通過抗體相互作用予以鑑定的分泌型抗原的標記物，或甚至可通過催化檢測的分泌型酶。分泌型選擇標記蛋白可分為數類，包括可通過(例如，ELISA)檢測的小分子可擴散型蛋白，可在胞外溶液中檢測到的小分子活性酶(例如，α-澱粉酶，β-內醯胺酶，膦絲菌素轉移酶)，或者插入或陷落在細胞壁中的蛋白(如包含前導序列的蛋白，如發現於延伸的表達單元中的蛋白，或菸草PR-S)。其它可能的選擇標記基因對本領域技術人員而言是顯而易見的。
選擇標記優選為GUS，綠色螢光蛋白(GFP)，新黴素磷酸轉移酶II(nptII)，螢光素酶(LUX)，抗生素抗性編碼序列，或除草劑(例如，草甘膦)抗性編碼序列。選擇標記最優選卡那黴素，潮黴素，或除草劑抗性標記。
重組載體中的其它元件各種具有順式作用的非翻譯5』和3』調節序列也可以包括在重組核酸載體中。任何這類調節序列可在重組載體中伴有其它調節序列。可通過設計或改變這類組合來產生所需的調節特徵。
3』非翻譯區通常提供轉錄終止信號，聚腺苷酸化信號，後者在植物中能導致腺苷酸添加在mRNA的3』末端。這可通過下述序列的3』區實現胭脂氨酸合成酶(nos)編碼序列，大豆7Sα』貯藏蛋白編碼序列，Arcelin-5編碼序列，清蛋白編碼序列，以及豌豆ssRUBISCO E9編碼序列。特別優選的3』核酸序列包括Arcelin-5 3』，nos 3』，E9 3』，adr12 3』，7Sα 3』，11 S 3』，USP3』，以及清蛋白3』。
位於距聚腺苷酸化位點數百個鹼基對的下遊處的核酸序列通常可終止轉錄。這些區是轉錄的mRNA進行有效腺苷酸化所必需的。
重組載體中還可摻入翻譯增強子。因此，重組載體優選包含一或多個5』非翻譯前導序列，以便增強核酸序列的表達。這類增強子序列預計能增強或改變所得mRNA的翻譯效力。優選的5』核酸序列包括dSSU 5』，PetHSP705』，和GmHSP17.95』。
重組載體還可包含編碼轉位肽的核酸序列。這種肽可用於將蛋白引到胞外空間，葉綠體，或細胞內側或外側的其它空間中(參見，例如歐洲專利申請公開號0218571)。
重組載體中的結構核酸序列可包含內含子。這些內含子可以與結構核酸序列有不同來源。優選的內含子包括水稻肌動蛋白內含子和穀物HSP70內含子。
融合蛋白上述任一種結構核酸序列及其修飾形式可與附加的核酸序列相連，以編碼融合蛋白。所述附加的核酸序列優選編碼至少一個胺基酸，肽，或蛋白。融合蛋白的製備是本領域的常規技術，有多種可能的融合組合。
例如，融合蛋白可提供便於檢測該融合蛋白的「標記」表位，如GST，GFP，FLAG或polyHIS。這類融合優選編碼1-50個胺基酸，更優選5-30個附加的胺基酸，還更優選5-20個胺基酸。
或者，所述融合可提供調節功能、酶活性、細胞信號傳遞功能、或細胞內轉運功能。例如，可添加編碼葉綠體轉運肽的序列，以便將融合蛋白引向植物細胞內部的葉綠體。這類融合配對物優選編碼1-1000個附加的胺基酸，更優選5-500個附加的胺基酸，還更優選10-250個胺基酸。
序列分析本發明中，序列相似性或同一性優選用Sequence Analysis SoftwarePackage(Version 10；Genetics Computer Group，Inc.，University of WisconsinBiotechnology Center，Madison，WI)中的「Best Fit」或「Gap」程序來確定。「Gap」程序利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch，1970)尋找兩個序列之間能使匹配數最大而使空隙數最小的對比排列。「BestFit」程序是對兩個序列之間相似性的最佳節段進行最佳對比排列。用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman，1981；Smith等，1983)，通過插入空隙，使匹配數最大化，可找出最佳對比排列。
上述Sequence Analysis Software Package還包含數個另外的序列分析工具，它們可用於鑑定本發明核苷酸和胺基酸序列的同源性。例如，「BLAST」程序(Altschul等，1990)在特定的資料庫(例如，National Center forBiotechnology Information(NCBI)，Bethesda，Maryland，USA的資料庫)中搜索與查詢(query)序列(肽或核酸)相似的序列；「FastA」(Lipman和Pearson，1985；see also Pearson and Lipman，1988；Pearson等，1990)對查詢序列與一組相同類型的序列(核酸或蛋白)之間的相似性進行Pearson and Lipman搜索；「TfastA」對查詢序列與任意組核苷酸序列之間的相似性進行Pearson andLipman搜索(它先翻譯出所有6個讀碼框中的核苷酸序列，然後進行比較)；「FastX」對核苷酸查詢序列與一組蛋白序列之間的相似性進行Pearson andLipman搜索，它考慮了移碼效應；「TfastX」對蛋白查詢序列與任意組核苷酸序列之間的相似性進行Pearson and Lipman搜索，它考慮了移碼效應(它先對核酸序列的兩條鏈都進行翻譯，然後進行比較)。
探針和引物本發明中，可製備並利用能與互補核酸序列特異性雜交的短核酸序列。這些短核酸分子可作為探針用於鑑定給定的樣品中互補核酸序列的存在。因此，通過構建與特定核酸序列的一小部分互補的核酸探針，可檢測和評估該核酸序列的存在。
本文公開的任何核酸序列都可以用作引物或探針。這些探針的應用可大大促進對含本文公開之啟動子和結構核酸序列的轉基因植物的鑑定。這些探針還可用於在cDNA文庫或基因組文庫中篩選與本文公開之啟動子和結構核酸序列相關或同源的其它核酸序列。
或者，可用上述短核酸序列作為寡核苷酸引物，利用PCR技術使互補核酸序列擴增或突變。這些引物還可促進對相關互補核酸序列的擴增(例如來自其它物種的相關核酸序列)。
短核酸序列可用作探針，尤其是作為PCR探針。PCR探針是在與另一核酸所形成的雙鏈結構中能啟動聚合酶活性的核酸分子。確定PCR探針的結構的各種方法以及PCR技術都是本領域已知的。例如，可用諸如Primer3(www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi)，STSPipeline(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/www.STS_Pipeline)，或GeneUp(Pesole等，1998)等計算機搜索程序來鑑定潛在的PCR引物。
引物或探針通常與將要被鑑定、擴增、或突變的核酸序列的一部分互補。引物或探針的長度應足以與其互補體形成穩定的序列特異性雙鏈分子。引物或探針的長度優選為約10-200個核苷酸，更優選為約10-100個核苷酸，還更優選為約10-50個核苷酸，最優選為約14-30個核苷酸。
引物或探針可直接化學合成，通過PCR(美國專利4,683,195和4,683,202)製備，或通過從較大的核酸分子中切出特異性核酸片段而製備。
轉基因植物和經過轉化的植物宿主細胞本發明還涉及轉基因植物和轉化植物細胞，它們按照5』至3』方向包含啟動子以及與其可操作相連的異源結構核酸序列。其它核酸序列也可與上述啟動子和結構核酸序列一起引入植物或宿主細胞中。所述其它序列可包括3』轉錄終止子，3』聚腺苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉位或靶向序列，選擇標記，增強子，和操縱子。本發明優選的核酸序列包括重組載體，結構核酸序列，啟動子，及其它調節元件，都已在上文中描述。
製備這樣的重組載體的方法是本領域已知的。例如，製備特別適於植物轉化的重組載體的方法可參見美國專利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011。這些載體已有相關綜述(Rodriguez等，1988；Glick等，1993)並且已在上文中描述。
可用細胞和高等植物中的表達的典型載體是本領域已知的，如衍生自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)腫瘤誘導(Ti)質粒的載體(Rogers等，1987)。其它可用於植物轉化的重組載體也已有描述(Fromm等，1985)。這類重組載體的元件如上文所述。
被轉化的植物細胞或植物通常可以是能容於本發明的任何細胞或植物。
植物或植物細胞優選苜蓿，蘋果，香蕉，大麥，菜豆，花椰菜，甘藍，胡蘿蔔，蓖麻，芹菜，柑桔，三葉草，椰子，咖啡，玉米(corn)，棉花，黃瓜，道格拉斯冷杉，桉，大蒜，葡萄，亞麻子，火炬松，甜瓜，燕麥，油橄欖，洋蔥，棕櫚，防風，豌豆，花生，胡椒，楊樹，馬鈴薯，蘿蔔，Radiatapine，油菜籽，稻，黑麥，高梁，狹葉羽扇豆，Southern pine，菠菜，草莓，甜菜，甘蔗，向日葵，楓香，茶，菸草，番茄，turf，或小麥植物或細胞。在還更優選的實施方案中，所述植物或植物細胞是大豆。
大豆細胞或大豆植物優選大豆優良品系。「優良品系」是經過育種和篩選而得到的具有出色的農藝表現的任何品系。優良品系的實例有面向農民或大豆種植者出售的品系，如HARTZTM品種H4994，HARTZTM品種H5218，HARTZTM品種H5350，HARTZTM品種H5545，HARTZTM品種H5050，HARTZTM品種H5454，HARTZTM品種H5233，HARTZTM品種H5488，HARTZTM品種HLA572，HARTZTM品種H6200，HARTZTM品種H6104，HARTZTM品種H6255，HARTZTM品種H6586，HARTZTM品種H6191，HARTZTM品種H7440，HARTZTM品種H4452 Roundup Ready，HARTZTM品種H4994 Roundup Ready，HARTZTM品種H4988 Roundup Ready，HARTZTM品種H5000 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5147 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5247 Roundup Ready，HARTZTM品種H5350 RoundupReadyTM，HARTZTM品種H5545 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5855Roundup Ready，HARTZTM品種H5088 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5164 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5361 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5566 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5181 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5889 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H5999 RoundupReadyTM，HARTZTM品種H6013 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H6255Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H6454 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H6686 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H7152 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H7550 Roundup ReadyTM，HARTZTM品種H8001 Roundup Ready(HARTZ SEED，Stuttgart，Arkansas，U.S.A.)；A0868，AG0901，A1553，A1900，AG1901，A1923，A2069，AG2101，AG2201，A2247，AG2301，A2304，A2396，AG2401，AG2501，A2506，A2553，AG2701，AG2702，A2704，A2833，A2869，AG2901，AG2902，AG3001，AG3002，A3204，A3237，A3244，AG3301，AG3302，A3404，A3469，AG3502，A3559，AG3601，AG3701，AG3704，AG3750，A3834，AG3901，A3904，A4045 AG4301，A4341，AG4401，AG4501，AG4601，AG4602，A4604，AG4702，AG4901，A4922，AG5401，A5547，AG5602，A5704，AG5801，AG5901，A5944，A5959，AG6101，QR4459和QP4544(Asgrow Seeds，DesMoines，Iowa，U.S.A.)；DeKalb品種CX445(DeKalb，Illinois)。
本發明還涉及製備轉化的植物的方法，所述植物包含按照5』至3』方向排列的本發明核酸序列。還可將其它序列與啟動子和結構核酸序列一起引入所述植物中。所述其它序列可包括3』轉錄終止子，3』聚腺苷酸化信號，其它非翻譯序列，轉位或靶向序列，選擇標記，增強子，以及操縱子。優選的重組載體，結構核酸序列，啟動子，和其它調節元件，如本文所述。
所述方法通常包括選擇合適的植物，用重組載體轉化該植物，和獲得轉化的宿主細胞。
有多種方法可將核酸引入植物。適當的方法包括細菌感染(例如土壤桿菌)，二元細菌人工染色體載體，DNA的直接運送(例如經由PEG-介導的轉化，乾燥/抑制作用-介導的DNA攝入，電穿孔，用碳化矽纖維進行的攪拌，以及對核酸包被的粒子進行加速，等等(見Potrykus等，1991的綜述)。
將核酸引入細胞的技術為本領域技術人員所熟知。這些方法通常被歸類為4類(1)化學方法(Graham和van der Eb，1973；Zatloukal等，1992)；(2)物理方法如顯微注射(Capecchi，1980)，電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985；美國專利5,384,253)和粒子加速(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988)；以及(4)受體-介導的機制(Curiel等，1992；Wagner等，1992)。或者，可以直接將核酸引入花粉，方法是直接注射植物的繁殖器官(Zhou等，1983；Hess，1987；Luo等，1988；Pena等，1987)。也可以將核酸注入未成熟的胚(Neuhaus等，1987)。
用於轉化所述宿主細胞的重組載體通常按5』至3』方向依次包含能指導結構核酸序列轉錄的啟動子，結構核酸序列，3』轉錄終止子，3』聚腺苷酸化信號。重組載體還可以包含非翻譯核酸序列，轉位及靶向核酸序列，選擇標記，增強子，或操縱子。
適當的重組載體，結構核酸序列，啟動子，和其它調節元件如上文所述。
從轉化植物的原生質體或外植體再生、發育和培養植物的方法為本領域熟知(Weissbach和Weissbach，1988；Horsch等，1985)，在該方法中，通常在能選擇成功轉化的細胞並誘導植物苗枝再生的選擇培養基存在的條件下培養轉化體(Fraley等，1983)。這些苗枝通常在2-4個月內獲得。
然後將苗枝轉移至合適的根-誘生培養基中，該培養基中包含選擇試劑以及阻止細菌生長的抗生素。大多數苗枝將發育出根。然後將它們移植到土壤或其它基質中，以使根繼續發育。方法常常根據所用具體植物株系的不同而有變動。
優選再生的轉基因植物能自花授粉，從而提供純合型轉基因植物。或者，可將所述再生轉基因植物的花粉與非-轉基因植物雜交，優選農藝上重要的物種的近交系。反過來，可用非-轉基因植物的花粉對所述再生轉基因植物授粉。
轉基因植物可將編碼抗真菌蛋白的核酸傳給它的後代。轉基因植物優選為抗真菌蛋白的編碼核酸的純合型，能通過有性繁殖將該序列傳遞給它的所有後代。後代可以從轉基因植物所產生的種子發育而成。這些另外的植物然後可通過自花授粉產生純種植物品系。
可對這些植物的後代進行評估，例如，評估其基因表達。基因表達可通過多種常用方法來檢測，如western印跡，northern印跡，免疫沉澱，和EIISA。
種子容器可以將本發明的植物種子或植物放置在容器中。本文中，容器是指任何能夠容納所述種子的物體。容器優選包含1,000，5,000，或25,000個以上的種子，其中至少10，25，50，75或100％的種子來自本發明的植物。
飼料(feed)，粗粉，蛋白和油製品本發明的任何植物或其部分可以經過加工製成飼料，粗粉，蛋白或油製品。為此目的的一個特別優選的植物部分是種子。在一個優選實施方案中，飼料，粗粉，蛋白或油製品是設計用於反芻動物的。製備飼料，粗粉，蛋白和油製品的方法是已知的。參見，例如，美國專利4,957,748、5,100,679、5,219,596、5,936,069、6,005,076、6,146,669和6,156,227。在一個優選實施方案中，所述蛋白製品是高蛋白製品。這種高蛋白製品優選蛋白含量5％w/v以上，更優選10％w/v，還更優選15％w/v。在優選的油製品中，油製品可以是高油製品，其中來源於本發明植物或其一部分的油的含量為5％w/v以上，更優選10％w/v以上，還更優選15％w/v。在一個優選實施方案中，油製品是液體，體積超過1升，5升，10升，或50升。在另一實施方案中，所述油製品可以是混合物，並且可以在該混合物總體積中佔10％以上，25％以上，35％以上，50％以上，或75％以上。
其它生物可將上述任一種啟動子和結構核酸序列引入任何細胞或生物，如哺乳動物細胞，哺乳動物，魚的細胞，魚，鳥的細胞，鳥，藻類的細胞，藻類，真菌的細胞，真菌，或細菌的細胞。優選的宿主和轉化體包括真菌細胞如麴黴菌，酵母，哺乳動物(尤其牛和豬)，昆蟲，細菌和藻類。特別優選的細菌細胞為土壤桿菌和大腸桿菌。
在另一特別優選的實施方案中，所述細胞選自細菌細胞，哺乳動物細胞，昆蟲細胞和真菌細胞。
轉化這類細胞或生物的方法是本領域已知的(EP 0238023；Yelton等，1984；Malardier等，1989；Becker和Guarente；Ito等，1983；Hinnen等，1978；Bennett和LaSure，1991)。從這類生物體產生本發明的蛋白的方法也是已知的(Kudla等，1990；Jarai and Buxton，1994；Verdier，1990；MacKenzie等.，1993；Hartl等，1994；Bergeron等，1994；Demolder等，1994；Craig，1993；Gething and Sambrook，1992；Puig and Gilbert，1994；Wang and Tsou，1993；Robinson等，1994；Enderlin and Ogrydziak，1994；Fuller等，1989；Julius等，1984；Julius等，1983).
本發明應用舉例本發明的應用包括動物(包括人)的營養添加劑。動物營養添加劑的形式包括飼料配給，粗粉，和源自穀物的蛋白製劑。人類添加劑的形式包括大豆蛋白製劑和嬰兒配方食品。
在一個優選實施方案中，本發明的蛋白，種子，和植物應用在人類食品中。本文中「人類食品」是指，適合於人類消費的任何食品。在一個優選實施方案中，人類食品是農業生產獲得的任何食品，包括直接的植物產物形式的食品，以及間接由農業植物餵養的動物獲得的動物產物形式。在一個更優選的實施方案中，人類食品是來源於本發明的植物或種子的任何食品，包括直接的植物產物形式的食品，以及間接由農業植物餵養的動物獲得的動物產物形式。在另一實施方案中，人類食品是來源於本發明大豆植物或種子的任何食品，包括直接的本發明大豆植物產物形式的食品，以及間接由本發明大豆植物餵養的動物獲得的動物產物形式。
以下實施例僅用於舉例。不應理解為本發明的範圍僅限於所舉例的實施方案。
實施例以下實施例僅用於舉例，並非限制本發明的範圍。
實施例1製備早期大豆種子mRNA從大豆種子分離細胞總RNA，其中包含從β-伴大豆球蛋白的β亞單位基因轉錄得到的mRNA。將未成熟的大豆種子碾成粉末(～180mg)，加入50ml的微量離心管中。加2.5ml TRIZOLTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)，混合物在PoltronTM(型號PT 1200，Brinkmann Instruments，Inc.，Westbury，NY)中勻漿20-30秒。經過勻漿的混合物在室溫中保溫5分鐘。向勻漿物中加入0.5ml氯仿，將該試管蓋緊。劇烈搖動該試管，並使其在室溫中靜置2-3分鐘。將樣品在4℃以12,000Xg離心15分鐘。將澄清的水相轉移到一個新鮮的50ml試管中，將霧狀有機相棄去。在水相中加入1.25ml異丙醇，充分混合，室溫保溫10分鐘。將試管在4℃以12,000Xg離心10分鐘。除去上清，將沉澱用2.5ml 75％乙醇洗滌。通過渦旋使沉澱混合在乙醇中。將試管在4℃以7,500Xg離心5分鐘。除去上清，將沉澱風乾5-10分鐘。再將沉澱重新懸浮在400μl DEPC H2O中。將樣品稀釋1∶100，通過測定OD260/280來確定RNA的濃度。RNA的存在通過進行非變性凝膠電泳並在UV光下觀察來證實。
實施例2早期大豆種子mRNA中β-伴大豆球蛋白β亞單位基因的RT-PCR針對出現在實施例1所分離的細胞總RNA中的β-伴大豆球蛋白β亞單位mRNA，用TitanTMOne Tube RT-PCR系統(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)製備其互補DNA序列。製備以下寡核苷酸引物，將它們脫鹽，凍幹，以100mM的終濃度重懸在水中，作為原液。
BetaC-5′A
5′-ATA CTA TGA TGA GAG TGC GG-3′(SEQ ID NO4)BetaC-5′B5′-CAC TCC ATG TTT CAT CGT CC-3′(SEQID NO5)BetaC-3′A5′-GTT ATT CAG TAG AGA GCA CC-3′(SEQ ID NO6)BetaC-3′B5′-TCA CGA TGA GCT CTT ACA GC-3′(SEQ ID NO7)為了進行RT-PCR，將引物稀釋為最終工作濃度20mM。製備RT-PCR反應的以下反應混合物主混合物11234

主混合物2

將每一份主混合物1樣品加入0.2ml厚的PCR試管中。製備另一份不含任何模板RNA的平行反應混合物作為對照。每一試管中加入24μl主混合物2。在PTC-200 Peltier熱循環儀中進行RT-PCR，按照以下程序的順序操作1)50℃30分鐘；2)94℃2分鐘；3)94℃30秒；4)45℃30秒；5)68℃90秒；6)回到步驟(3)，重複額外9個循環；7)94℃30秒；8)45℃30秒；9)68℃90秒；10)回到步驟7，重複額外9個循環，每個循環加5秒；11)68℃7分鐘；12)冷卻到4℃，終止程序。
將PCR反應產物在瓊脂糖凝膠上分開。從凝膠上切取PCR片段，用標準方法純化。所得cDNA之一為SEQ ID NO3。該cDNA的翻譯產物為SEQID NO1。
實施例3製備含有編碼β-伴大豆球蛋白β亞單位的序列的重組核酸載體將實施例2所分離得到的PCR產物用TATM克隆試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)連接到pCRIITM載體中。連接反應按照廠家的方案進行，使用以下10μl連接反應混合物

1凝膠純化的PCR產物2直接PCR產物(未經凝膠純化)實施例4製備轉化的宿主細胞，其包含編碼野生型β-伴大豆球蛋白β亞單位的載體將連接而成的包含所述PCR產物的pCRII載體轉化到One ShotTM感受態細胞(大腸桿菌INVαF』株)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，按照廠家方案離心。
按照廠家方案從QIAprepTM(Qiagen Inc.，Valencia，CA)微量製備試劑盒製備DNA。將每一份DNA微量製品的樣品用EcoRI/XbaI消化，得到DNA片段。EcoRI消化產生3.9，0.58，和0.75kb的片段。XbaI消化或者產生0.59和4.62kb的片段(pMON54419)，或者產生0.72和4.44kb的片段(pMON54418)。與β-伴大豆球蛋白β亞單位基因的DNA片段對應的正確大小的片段的存在通過凝膠電泳證實。選出具有β-伴大豆球蛋白β亞單位基因的DNA微量製品和轉化細胞。將β-伴大豆球蛋白β亞單位DNA的序列與已經公開的野生型序列比較，選出與已經公開的野生型β-伴大豆球蛋白β亞單位基因序列100％匹配的序列。
實施例5製備轉基因植物和種子設計轉化載體，使其能引入編碼修飾的β-伴大豆球蛋白β亞單位的核酸序列，所述載體通常包含一或多個目的核酸編碼序列，它們的翻譯受到5』和3』調節序列的控制。這類載體包含以下元件，它們按照5』-3』的方向可操作相連指導下遊結構核酸序列在植物中轉錄的啟動子；5』非翻譯序列；編碼修飾的β-伴大豆球蛋白β亞單位序列的核酸序列，以及提供聚腺苷酸化信號和終止信號的3』非翻譯區。
將每一個修飾的β-伴大豆球蛋白序列插入植物轉化載體中，並轉化植物組織如大豆子葉。在適當的選擇性生長培養基中培養轉化的植物組織，以便產生含有修飾的β-伴大豆球蛋白序列的轉基因植物。
有多種不同的方法可以用於將這類載體引入植物原生質體、細胞、愈傷組織、葉盤、分生組織，及其它植物組織，從而產生轉基因植物。用所述植物載體轉化植物細胞或植物組織，方式可以是土壤桿菌介導的轉化，粒子槍運送，顯微注射，電穿孔，聚乙二醇介導的原生質體轉化，脂質體介導的轉化，等等(綜述見Potrykus，1991)。植物細胞或組織因此而被含有β-伴大豆球蛋白β亞單位序列的植物載體轉化。
轉基因植物是這樣產生的如上所述用植物載體轉化植物細胞；選出已經被轉化的植物細胞或組織；使已經被轉化的植物細胞再生，產生轉基因植物；選出表達所需β-伴大豆球蛋白β亞單位序列的轉基因植物。
篩選轉基因植物中必需胺基酸的含量增加了的所需多肽的蛋白表達。也可以篩選植物中其它必需胺基酸(如組氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，和苯丙氨酸)的含量增加了的多肽。
實施例6在大腸桿菌中表達並自我裝配帶有表位標籤的β-伴大豆球蛋白β亞單位。
為了將β-伴大豆球蛋白β亞單位的修飾形式與積累在未轉化的大豆中的內源形式相區別，將「FLAG」表位編碼序列與代表β亞單位成熟形式(缺乏信號肽)氨基末端的編碼序列連接。FLAG表位由8個殘基組成Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQID NO9)(5′GAC TAC AAG GACGAC GAT GAC AAG 3′(SEQ ID NO8)。用pMON54418作為模板，按照廠家(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN，Expand High Fidelity PCR System)建議，通過標準PCR技術，將FLAG編碼序列，以及用作翻譯起始密碼子的附加甲硫氨酸密碼子，添加在成熟β亞單位編碼序列的氨基末端，所用的引物是5』ATAGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGTTAAAGGTGAGAGAGGATGAG 3』(SEQ ID NO10)和5』GTAAAACGA CGGCCAG3』(SEQ ID NO11)。所得1.4kb PCR產物用NcoI+NotI消化，克隆到大腸桿菌表達載體pET21d(+)的NcoI和NotI位點(Novagen，Madison，WI)，得到pMON39328，如圖1所示。
由pMON39328編碼的帶有(FLAG)標籤的β-伴大豆球蛋白β亞單位具有胺基酸序列SEQ ID NO12。
pMON39328中編碼帶有(FLAG)標籤的β-伴大豆球蛋白β亞單位的核苷酸序列具有SEQ ID NO13所示序列。
製備第二種質粒pMON39329，如圖2所示，它包含pET21d(+)中成熟形式的β亞單位(不帶FLAG表位)的編碼序列。
由pMON39329編碼的成熟形式β-伴大豆球蛋白β亞單位(外加起始密碼子編碼的甲硫氨酸)具有胺基酸序列SEQ ID NO14。
pMON39329中編碼β-伴大豆球蛋白β亞單位成熟形式的核苷酸序列具有SEQ ID NO15所示序列。
按照廠家(Strategene，La Jolla CA)建議，將質粒pMON39328和pMON39329轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中。用單菌落接種2ml LB培養基。在37℃進行培養，直到細胞密度達到A600＝0.6。加入異丙基-1-硫代-β-D-半乳吡喃糖苷(IPTG)至終濃度為1mM，以便誘導蛋白表達，將培養物在20-37℃以225rpm保溫最多20個小時。4℃5,000rpm離心15分鐘，收穫細胞。將細胞沉澱重懸在蛋白提取液中，所述蛋白提取液組成如下20mMTris-HCI，pH 7.4，0.4M NaCl，0.1％TritonX-100，40μl/ml蛋白酶抑制劑混合物，(原液1片/2ml，Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。然後在用冰維持的冷環境中，通過超聲處理(Branson Sonifier 450，Branson PrecisionProcessing，Danbury，CT)破碎細胞。通過13,000rpm離心5分鐘，將可溶性蛋白與不溶的組分分離。考馬斯蘭染色和用抗-FLAG抗體進行的Western印跡表明，天然形式和FLAG-標記形式的溶解度和表達水平沒有差別。當表達在37℃被誘導時，兩種蛋白主要以不溶形式積累，當在20℃或30℃誘導時，約有50％的蛋白積累在可溶性級分中。
為了確定大腸桿菌中由pMON39328和pMON39329表達的β亞單位的重組形式是否可以自我裝配，形成三聚體，將源自大腸桿菌裂解物的可溶性蛋白級分的等份試樣覆蓋在12ml 5-25％蔗糖密度梯度的上層，在20℃以36,000rpm離心17.5小時(Sorvall TH-641轉子；Sorvall Ultra Pro 80超速離心機)。離心後，用Labconco Autodensi-Flow儀(Labconco，Kansas City，Missouri)將梯度分為多個級分，每個級分用抗-FLAG M2抗體(StratageneCorporation，LaJolla，CA)進行Western印跡分析，確定哪些級分包含β-伴大豆球蛋白β亞單位。7S和11S大豆蛋白級分，以及卵白蛋白(45kD)和醛縮酶(158kD)都作為分子量標誌物在不同梯度上運行。結果表明，天然形式和FLAG-標記形式與從大豆分離的7S級分以及與醛縮酶標準品共沉澱，這說明，兩種重組蛋白都能自我裝配形成三聚體。
實施例7修飾β-伴大豆球蛋白β亞單位序列以便編碼水平增加的色氨酸進行定點誘變，在β-伴大豆球蛋白β亞單位序列中的以下一或多個位置進行色氨酸密碼子取代N32；Y35；N40；N50；Y72；H88；Y116；H119；Y132；Y133；P137；Y1 58；Y172；E200；P239；Y249；P265；P324；Y330；Y346；N368；和Y411。這些反應中所用的引物見下表，其中序列ID號和相應胺基酸以及密碼子取代在右欄中。胺基酸取代是在SEQ ID NO1所示未經修飾的β-伴大豆球蛋白β亞單位序列中進行取代，用以下形式表示被替換的胺基酸的單字母代碼/在SEQ ID NO1中的位置/加入的胺基酸的單字母代碼。例如，SEQ ID NO16是將SEQ ID NO1中第35位的胺基酸從酪氨酸更換為色氨酸。括號內的核苷酸取代用類似的形式表示，SEQ ID NO3所示β-伴大豆球蛋白β亞單位cDNA中的改變表示為以下形式的三聯體取代未經修飾的三聯體/SEQ ID NO3中三聯體的第一個核苷酸的位置/修飾的三聯體。例如，SEQID NO16是將SEQID NO3的位置103，104，和105的三聯體TAC變為TGG。
每一色氨酸取代的引物序列

用質粒pMON39328作為所有上述反應的模板。ID從39328-1到39328-28的突變用QuickChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene Corporation，La Jolla，CA)基本按照說明書來製備，ID從39328-31到39328-66的突變用GeneEditorTM體外定點誘變系統試劑盒(Promega Corporation，Madison，WI)來製備。每一誘變引物被設計為將編碼色氨酸殘基的核苷酸插入上述所列位置。引物從Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)獲得，並在5』端磷酸化，經聚丙稀醯胺凝膠電泳純化。色氨酸突變體和突變位點，按照上述表示法，列於下表中



關於β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列如何經過修飾而包含多重色氨酸取代，下面給出一個實例，它描述了突變體ID 39328-57的製備將2μg質粒pMON39328的DNA與2M NaOH和2mM EDTA混合，室溫保溫10分鐘，使質粒變性。接著，在變性的模板DNA中加入10μl 3M乙酸鈉(pH5.2)和75μl 100％乙醇，使DNA沉澱。離心後，將DNA沉澱溶於100μl TE緩衝液中。迅速使變性的DNA與誘變引物雜交，如下將10μl變性的pMON39328與1μl頂端選擇引物(top selection primer)(2.9ng/μl，來自試劑盒)，下述誘變引物各1.25pmolSEQ ID NO16，SEQ ID NO21，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ IDNO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQID NO30，和SEQID NO32，2μl 10x退火緩衝液和ddH2O在20μl反應體積中混合。反應在75℃加熱5分鐘，然後在桌面上(bench-top)緩慢冷卻到37℃。突變鏈在20μl反應液中合成(並將新合成的DNA鏈中的缺口連接起來)，所述反應液包含5μl去離子水，3μl 10x合成緩衝液，1μl T4 DNA聚合酶(5-10U)，和1μlDNA連接酶(1-3U)。在37℃反應90分鐘。接著，將1.5μl反應液轉化到大腸桿菌菌株BMH71-18mutS(Promega Corporation，Madison，WI)中，轉化的細胞在4ml LB中培養，所述LB包含50μl GeneEditor抗生素選擇混合物(Promega Corporation，Madison，WI)。從該培養物的1.5ml等份試樣中分離質粒DNA(用Qiagen Miniprep試劑盒，Qiagen Inc.Valencia，CA)。分離的質粒DNA隨後被轉化到大腸桿菌JM109中，單個菌落在含有125μg/ml氨苄青黴素和50μl GeneEditor抗生選擇混合物(Promega Corporation，Madison，WI)的LB瓊脂平板上進行培養。從10個菌落分離質粒DNA(Qiagen Miniprep試劑盒，Qiagen Inc.，Valencia，CA)，測定β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼區的序列。其中一個序列被鑑定為突變體ID 39328-32。用39328-32作為模板，進行第二輪誘變，所用引物為SEQ ID NO20，SEQ ID NO25，SEQ ID NO28，SEQ ID NO31和SEQ ID NO32。所有操作如上文所述。從該輪產生的突變體中鑑定出突變體ID 39328-57。
實施例8修飾β-伴大豆球蛋白β亞單位序列以編碼水平增加的異亮氨酸進行定點誘變，以便用異亮氨酸密碼子取代β-伴大豆球蛋白β亞單位序列中的以下一或多個位置N32；L36；F46；G51；L56；F59；Q65；L66；Y72；R73；V75；Q76；L85；H88；F94；L95；L96；F97；V98；L99；R102；L105；L107；N117；L118；D121；Q124；R125；P127；Y132；Y133；L134；V135；P137；L143；K147；L148；P151；Y158；F162；Q169；L173；L181；V209；P239；F240；P247；F256；E258；T264；P265；L267；F273；L274；L285；L286；H288；N290；V295；L297；V298；N300；L308；V309；K317；K319；P324；L334；V339；F340；V341；Y346；F348；V350；L356；F358；L359；F361；N368；F372；F393；Y411；F412；和V413。
這些反應中所用的引物見下表，其中序列ID號和相應胺基酸以及密碼子取代在右欄中，說明同實施例7每一異亮氨酸取代的引物序列


突變體ID 39328-67到39328-74用pMON39328作模板來製備，突變體ID 39335-1到39335-81用pMON39335作模板來製備。質粒pMON39335與pMON39328相同，區別僅在於，β-伴大豆球蛋白β亞單位蛋白序列(SEQ IDNO1)中編碼Leu24的核苷酸從TTA突變為CTT，產生一個AflII限制酶位點。pMON39335見圖3。
所有突變體用GeneEditorTM體外定點誘變系統試劑盒(PromegaCorporation，Madison，WI)基本按照說明書來製備。每一誘變引物被設計為將編碼異亮氨酸殘基的核苷酸插入上述所列位置。引物從Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)獲得，並在5』端磷酸化，經聚丙稀醯胺凝膠電泳純化。詳細的誘變過程如實施例7中引入色氨酸取代的過程一樣。
異亮氨酸突變體以及突變位點見下表，說明同實施例7

在約2.5小時內於封閉的小室內評價二氧化氯的產生(ppm)，使用正常的室內螢光照明進行活化並使用電化學電池測定二氧化氯的濃度。數據報導於以下表2。
表2








關於β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列如何經過修飾而包含多重異亮氨酸取代，下面給出一個實例，它描述了突變體ID 93995-14的製備將雙鏈質粒pMON39335變性，並與以下誘變引物雜交SEQ ID NO37，SEQ IDNO43，SEQ ID NO46，SEQ ID NO52，SEQID NO55，SEQ ID NO58和SEQ ID NO62。將誘變反應的等份試樣轉化到大腸桿菌菌株BMH 71-18mutS中，從耐受GeneEditor抗生素選擇混合物(Promega Corporation，Madison，WI)的細胞中分離質粒，然後轉化大腸桿菌菌株JM109。對來自轉化體的質粒DNA測序，鑑定出多個修飾形式，其中之一為突變體ID39335-14。
關於β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列如何經過修飾而包含多重異亮氨酸取代，下面給出一個實例，它描述了用突變體ID39335-14作為模板製備突變體ID 39328-57的過程，如下在將包含突變體ID 39335-14的質粒(pMON39334-14)作為第二輪誘變的模板使用之前，回復(restore)氨苄青黴素抗性基因的GeneEditor(Promega Corporation，Madison，WI)抗生素混合敏感形式(mix-sensitive form)(它在第一輪誘變期間轉換為GeneEditor抗性形式)。為此，將突變體ID 39335-14的編碼序列從pMON39335-14中切出，為一個1.4kb的DNA片段，用它代替pMON39335中的β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列。用所得質粒作為誘變反應(如上述)的模板，用誘變引物SEQ IDNO80進行反應，鑑定出突變體ID 39335-33。
實施例9。證實經過修飾而包含一或多個色氨酸或異亮氨酸殘基的β-伴大豆球蛋白β亞單位在大腸桿菌中的摺疊和自我裝配本實施例證實鏈修飾型β-伴大豆球蛋白β亞單位克隆的表達的蛋白結構。β亞單位(以突變體ID號表示)的以下修飾形式(各自包含不同的色氨酸取代)的裝配特性如所述實施例6確定。按照實施例6所述，用-FLAG抗體對蔗糖梯度級分進行Western印跡分析。結果見下表。
Ile突變體的大腸桿菌裝配結果



Trp突變體的大腸桿菌裝配結果


實施例10本實施例證實經過修飾而包含多重異亮氨酸殘基的β-伴大豆球蛋白β亞單位在轉化植物的種子中積累。
載體構建對應於表位(FLAG)-標記的β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列的DNA序列，以及對應於突變體39335-14，39335-41，3933558和39335-78(分別是上述SEQ ID NO84-87)的編碼序列的DNA序列，通過將β亞單位前25個殘基的編碼序列置於FLAG表位編碼序列的上遊，而進行修飾。加入這25個殘基使β亞單位信號肽被恢復，並將修飾的β-伴大豆球蛋白β亞單位靶向植物種子中的蛋白貯藏液泡。所得編碼序列然後被克隆到植物轉化載體中，受arcelin 5啟動子的控制。
舉例來說，用於製備pMON64015的克隆技術在本文中簡短描述。將質粒pMON39335-41用HindIII和PstI消化。所得1.27kb片段包含β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列，其中有16個異亮氨酸取代，電泳後從瓊脂糖凝膠中分離該片段。穿梭載體pMON68006包含Arcelin5啟動子-FLAG-βCG-10-Ile-Arc 3』UTR表達盒，它也用HindIII和PstI消化，產生5.7kb的片段。該5.7kb片段缺乏β-伴大豆球蛋白β亞單位成熟形式的編碼序列，但保留了arcelin 5啟動子的編碼序列，β亞單位信號肽，FLAG表位，以及arcelin 5 3』UTR。該5.7kb片段在電泳後從瓊脂糖凝膠中分離。然後將來自pMON39335-41的1.27kb片段與該5.7kb片段連接，得到載體pMON64017。再用NotI消化pMON64017，分離出Arc5啟動子-FLAG-βCG-16-Ile-Arc3』UTR表達盒，所得3.8kb片段在電泳後從瓊脂糖凝膠中分離。用於土壤桿菌介導的轉化的植物轉化骨架載體pMON38207包含FMV啟動子驅動的CP4基因作為選擇標記，將它NotI消化，連接來自pMON64017的3.8kb片段，得到質粒pMON64015。
用上述針對pMON64015的策略，製備以下植物轉化載體


轉基因的序列(arcelin 5啟動子-編碼序列-arcelin 5 3』非翻譯區)和相應的蛋白編碼序列顯示在序列表中。為了更全面描述這些構建體，本文給出對應於上述質粒的核苷酸序列和胺基酸序列的以下重點說明pMON69616盒DNA序列(SEQ ID NO88)核苷酸1-3808包含在pMON69616中的完整表達盒核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523包含FLAG表位的β-伴大豆球蛋白編碼序列核苷酸2550-3808Arcelin 5 3』非翻譯區(UTR)pMON69616β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO89)胺基酸1-449完整的β-伴大豆球蛋白編碼序列，含有信號肽和插入的FLAG表位標籤胺基酸1-25野生型β-伴大豆球蛋白的前25個胺基酸，包括信號肽胺基酸26-33FLAG表位胺基酸34-449野生型(未修飾的)β-伴大豆球蛋白的成熟形式pMON64016盒DNA序列(SEQ ID NO90)核苷酸1-3808包含在pMON64016中的完整表達盒核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含FLAG表位核苷酸2550-3808Arcelin 5 3』非翻譯區(UTR)pMON64016β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO91)胺基酸1-449完整的修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含信號肽和插入的FLAG表位標籤胺基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25個胺基酸，包括信號肽胺基酸26-33FLAG表位胺基酸34-449修飾的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含10個異亮氨酸取代(對應於突變體39335-14)pMON64015盒DNA序列(SEQ ID NO92)核苷酸1-3808完整表達盒，包含在pMON64015中核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含FLAG表位核苷酸2550-3809Arcelin 5 3』非翻譯區(UTR)pMON64015β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO93)胺基酸1-449完整的β-伴大豆球蛋白編碼序列，含有信號肽和插入的FLAG表位標籤胺基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25個胺基酸，包括信號肽胺基酸26-33FLAG表位胺基酸34-449修飾的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含16個異亮氨酸取代(對應於突變體39335-41)pMON64019盒DNA序列(SEQ ID NO94)核苷酸1-3808完整表達盒，包含在pMON64019中核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含FLAG表位核苷酸2550-3809Arcelin 5 3』非翻譯區(UTR)pMON64019修飾的β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO95)胺基酸1-449完整的修飾型β-伴大豆球蛋白編碼序列，含有信號肽和插入的FLAG表位標籤胺基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25個胺基酸，包括信號肽胺基酸26-33FLAG表位胺基酸34-449修飾的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含21個異亮氨酸取代(對應於突變體39335-58)pMON69621盒DNA序列(SEQ ID NO96)核苷酸1-3808完整表達盒，包含在pMON69621中核苷酸1-1161截短的Arcelin 5啟動子核苷酸1174-2523修飾的β-伴大豆球蛋白編碼序列，包含FLAG表位核苷酸2550-3809Arcelin 5 3』非翻譯區(UTR)pMON69621β-伴大豆球蛋白蛋白序列(SEQ ID NO97)胺基酸1-449完整的修飾型β-伴大豆球蛋白編碼序列，含有信號肽和插入的FLAG表位標籤胺基酸1-25β-伴大豆球蛋白的前25個胺基酸，包括信號肽胺基酸26-33FLAG表位胺基酸34-449修飾的β-伴大豆球蛋白的成熟形式，包含21個異亮氨酸取代(對應於突變體39335-78)植物轉化擬南芥屬植物用上述載體轉化，方法採用Bechtold等(CR Acad Sci ParisSciences di la vie/life sciences 3161194-1199，1993)或Clough，S.和Bent，A.(The Plant Journal 16(6)，735-743，1998)所述的標準的根癌土壤桿菌介導性植物轉化方法。
簡言之，通過將次生木料(secondary bolt)和花瓣(rosette)浸沒在根癌土壤桿菌(ABI)溶液中並渦旋10-20秒，來轉化28-35日齡的擬南芥(Arabidopsisthaliana)生態型Columbia植物。從在YEP(5g/L氯化鈉，10g/L酵母浸出物和10g/L蛋白腖，pH 7.0)上過夜生長的培養物中獲得根癌土壤桿菌(ABI)，於次日早晨用保溫培養基(5％蔗糖加0.05％Silwet L77表面活性劑)稀釋，使600nm的光密度達到約0.8。轉化前，用植物繁殖室(plant propagation dome)將植物在高溼度條件中保持24小時，保持水份，共達5天。
然後用亞灌溉方法(sub-irrigation method)將植物培養在標準的一周兩次澆水和施肥的條件下。將bolts裝在授粉袋中，以便容納種子。將植物播種後(浸漬約4周後)，從水中取出，使種子乾燥約一周，然後收穫。接著將種子置於氯氣環境中過夜以便進行表面除菌，再置於含有草甘膦(30-50μM)的選擇性培養基中或種植於土壤中並用Roundup Ultra(Monsanto Company，St.Louis，MO)噴灑，以便鑑定單個陽性植物。選擇平板在4℃培養48小時，然後轉移到設定為23.5℃的Percival培養室中(16:8小時光周期)。在約18-21天內，鑑定出具有伸展的初級和次極葉以及分支的根的陽性單個植物。相應的陰性單個植物的初級和次極葉不伸展，且根較矮小。
代表T2代的種子從單個草甘膦抗性植物中收穫。用本領域抑制的標準技術從種子中提取蛋白。然後用Western印跡分析所提取的蛋白。用於Western印跡的抗血清是從注射了修飾型β-伴大豆球蛋白β亞單位(10個帶有FLAG表位的異亮氨酸取代插入在氨基末端)的兔子中分離的，所述亞單位是從pMON39335-14(Cocalico Biologicals，Inc.，Reamstown，PA)轉化的大腸桿菌中分離的。野生型β-伴大豆球蛋白β亞單位，以及代表每一種修飾形式的β亞單位，都在轉基因種子中檢測到，但每種形式中的積累水平有差異。每種形式的相對積累水平通過檢查Western印跡中帶的強度來確定，結果見下表。

大豆植物用pMON69616和pMON64016轉化，採用Martinell等在美國專利6,384,301中所述的根癌土壤桿菌介導的植物轉化方法。從所得轉基因植物獲得種子，對單個種子進行SDS-PAGE分析，用與FLAG表位反應的抗體(抗-FLAG M2抗體；Stratagene)或者用與野生型β-伴大豆球蛋白β亞單位反應的抗血清(上述)進行Western印跡分析。表位(FLAG)-標記的未修飾形式和修飾形式(10個異亮氨酸取代；突變體39335-14)都是在總提取蛋白的7％以上的水平積累，這可通過對SDS PAGE凝膠進行密度計量，然後用膠體蘭染色試劑盒(Colloidal Blue Stain Kit，Invitrogen)染色來評估。密度計量用Biorad Gel Doc儀器實施。
表達修飾β亞單位(對應於突變體39335-14)的轉基因種子，用SDS-PAGE進行分析，並用膠體蘭染色試劑盒(Invitrogen)來觀察。結果表明，修飾蛋白的表達與對一或多個內源性β-伴大豆球蛋白亞單位(α亞單位，α』亞單位，β亞單位)的抑制相關。修飾型β亞單位的積累水平與內源性β亞單位的積累水平之間存在明顯的反相關性。故，修飾型β-伴大豆球蛋白在種子中的表達確實代表了一種降低內源性β-伴大豆球蛋白水平的方法。
實施例11修飾β-伴大豆球蛋白β亞單位序列以編碼水平增加的蘇氨酸、賴氨酸、和甲硫氨酸進行定點誘變，以便在β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列(SEQID NO1)中的一或多個以下位置進行蘇氨酸密碼子取代S54，S225，S250，S251，S75，S90，S202，S16，S38，S139，S149，S197，S385，A65，A67，A78，A98，A124，A258，A279，A307，A327，A335，A268，A340，A367，V83，V284，V324，V186，V375，L171，L348，N275，N326，N346，N92，N216，N280，N332，N35，N168，Q53，Q303，Q32，R304，K201，K230，E276，E282，D68，D135，D89，D253，D389，D313，F136，P262，P62，P222，P318，P240。
進行定點誘變，以便在β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列(SEQ ID NO1)中的一或多個以下位置進行賴氨酸密碼子取代R169，R194，R243，R361，R377，R37，R357，R304，R45，R132，R179，R199，R205，R883，S75，S202，S13，S210，S329，S371，T328，N84，N117，N225，N339，Q192，Q149，Q241，Q116，Q142，Q145，H153，V363，L379，L300，I155，I208，I223，I286，D89，E157，E166，E191，E365，E376。
進行定點誘變，以便在β-伴大豆球蛋白β亞單位編碼序列(SEQ ID NO1)中的一或多個以下位置進行甲硫氨酸密碼子取代L41，L156，L242，L245，L188，L379，I167，I193，I208，F34，Y386，N239，Q364，Q241。
所有突變體都用GeneEditorTM體外定點誘變系統試劑盒(PromegaCorporation，Madison，WI)基本按照說明書來製備。每一誘變引物被設計為將編碼蘇氨酸、賴氨酸或甲硫氨酸殘基的核苷酸插入上述所列位置。引物從Invitrogen(Invitrogen，Carlsbad，CA)獲得，並在5』端磷酸化，經聚丙稀醯胺凝膠電泳純化。詳細的誘變過程如實施例7中引入色氨酸取代的過程一樣。
參考文獻Ainley et al.，Plant Mol.Biol.，14949，1990.
Altschul et al.，Journal of Molecular Biology，215403-410，l990.
Andreas et al.，Theor.Appl.Genet.，72123-128，1986.
Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，1995.
Battraw and Hall，Plant Sci.，86(2)191-202，1992.
Back et al.，Plant Mol.Biol.，179，1991.
Bauer et al.，Gene，3773，1985.
Becker and Guarente，InAbelson and Simon(eds.)，Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology，Methods Enzymol.，Vol.194，pp.182-187，Academic Press，Inc.，New York.
Bennett and LaSure(eds.)，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA，1991.
Bent et al.，Science，2651856-1860，1994.
Bergeron et al.，TIBS，19124-128，1994.
Bol et al.，Ann.Rev.Phytophathol，2813-138，1990.
Bowles，Ann.Rev.Biochem，59873-907，1990.
Braun and Hemenway，Seeds，4(6)735-744，1992.
Broekaert et al.，Critical Reviews in Plant Sciences，16(3)297-323，1997.
Bustos et al.，EMBO J.，101469-1479，1991.
Castresana et al.，EMBO J.，71929-1936，1988.
Capecchi，Cell，22(2)479-488，1980.
Cashmore et al.，Gen.Eng.of Plants，Plenum Press，New York，29-38，1983.
Cerda-Olmedo et al.，J.Mol.Biol.，33705-719，1968.
Chau et al.，Science，244174-181.1989.
Christensen et al.，Plant Mol.Biol.，18675，689，1992.
Christou et al.，Plant Physiol.，87671-674，1988.
Christou et al.，Bio/Technology，9957，1991.
Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)155-168，1993.
Costa et al.Methods Mol.Biol.，5731-44，1996.
Craik，BioTechniques，312-19，1985.
Craig，Science，2601902-1903，1993.
Curiel et al.，Hum.Gen.Ther.，3(2)147-154，1992.
Davey et al.，Symp.Soc.Exp.Biol.，4085-120，1986.
Davey et al.，Plant Mol.Biol.，13(3)273-285，1989.
De Kathen and Jacobsen，Seeds Rep.，9(5)276-9，1990.
Dellaporta et al.，Stadler Symposium，11263-282，1988.
De la Pena et al.，Nature，325274，1987.
Demolder et al.，J.Biotechnology，32179-189，1994.
Deng and Nickloff，Anal.Biochem.，20081，1992.
Doyle et al.，J.Biol.Chem.，2619228-9238，1986.
Eglitis and Anderson，Biotechniques，6(7)608-614，1988.
Ellis et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，924185，1995.
Enderlin and Ogrydziak，Yeast，1067-79，1994.
Feinbaum et al.，Mol.Gen.Genet.，226449-456，1991.
Fiedler et al.，Plant Molecular Biology，22669-679，1993.
Fitchen and Beachy，Ann.Rev.Microbiol.，47739-763，1993.
Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，804803，1983.
Frits Eckstein et al.，Nucleic Acids Research，106487-6497，1982.
Fromm et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)5824-5828，1985.
Fromm et al.，Bio/Technology，8833，1990.
Fuller et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，861434-1438，1989.
Fynan et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(24)11478-11482，1993.
Gasser and Fraley，Science，2441293，1989.
Gething and Sambrook，Nature，35533-45，1992.
Glick et al.，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，CRC Press，BocaRaton，Fla.，1993.
Goossens et al.，Eur.J.Biochem.，225787-95，1994.
Goossens et al.，Plant Physiol.，1201095-1104，1999.
Gordon-Kamm et al.，Seeds，2603，1990.
Graham and Van der Eb，Virology，54(2)536-539，1973.
Grant et al.，Seeds Rep.，15(3/4)254-258 1995.
Grant et al.，Science，269843-846，1995.
Greener et al.，Mol.Biotechnol.，7189-195，1997.
Guerola et al.，Nature New Biol.，230122-125，1971.
Harlow and Lane，InAntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，ColdSpnng Harbor，New York，1988.
Hartl et al.，TIBS，1920-25，1994.
Hershey and Stoner，Plant Mol.Biol.，17679-690，1991.
Hess，Intern Rev.Cytol.，107367，1987.
Hinchee et al.，Bio/Technology，6915-922，1988.
Hinnen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，751920，1978.
Horsch et al.，Science，2271229-1231，1985.
Ikatu et al.，Bio/Technol.，8241-242，1990.
Ito et al.，J.Bacteriology，153163，1983.
Jarai and Buxton，Current Genetics，262238-2244，1994.
Jefferson(I)，Plant Mol.Biol，Rep.，5387-405，1987.
Jefferson(II)et al.，EMBO J.，63901-3907，1987.
Johnston and Tang，Methods Cell Biol.，43(A)353-365，1994.
Jones et al.，Science，266789-793，1994.
Julius et al..Cell.32839-852，1983.
Julius et al.，Cell，371075-10-89，1984.
Kares et al.，Plant Mol.Biol.，15905，1990.
Katz et al.，J.Gen.Microbiol.，1292703-2714，1983.
Kawasaki，InPCRTM Protocols，A Guide to Methods and Applications，Innis et al.，Eds.，Academic Press，San Diego，21-27，1990.
Kay et al.，Science，2361299，1987.
Keller et al.，EMBO L.，81309-1314，1989.
Knutzon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，892624-2628，1992.
Koziel et al.，Bio/Technology，11194，1993.
Kridl et al.，Seed Sci.Res.，1209，1991.
Kuby，Immunology，2d Edition.W.H.Freeman and Company，New York，1994.
Kudla et al.，EMBO，91355-1364，1990.
Kuhlemeier et al.，Seeds，1471，1989.
Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82488-492，1985.
Kyte and Doolittle，J.Mol.Biol.，157105-132，1982.
Lam and Chua，J.Biol.Chem.，26617131-17135，1990.
Lam and Chua，Science，248471，1991.
Laemmli，Nature，227680-685，1970.
Lioi and Bollini，Bean Improvement Cooperative，3228，1989.
Lipman and Pearson，Science，2271435-1441，1985.
Lindstrom et al.，Developmental Genetics，11160，1990.
Linthorst，Crit.Rev.Plant Sci.，10123-150，1991.
Logemann et al.，Seeds，1151-158，1989.
Lu et al.，J.Exp.Med.，178(6)2089-2096，1993.
Luo et al.，Plant Mol Biol.Reporter，6165，1988.
MacKenzie et al.，Journal of Gen.Microbiol.，1392295-2307，1993.
Mahadevan，et al.，J.Animal Sci.50723-728，1980.
Malardier et al.，Gene，78147-156，1989.
Maloy et al.，Microbial Genetics 2nd Edition，Jones and Barlett Publishers，Boston，MA，1994.
Mandel et al.，Plant Mol.Biol，29995-1004，1995.
Marraccini et al.，Palnt Physiol.Biochem.(Paris)，37(4)273-282，1999.
McCabe et al.，Biotechnolgy，6923，1988.
McElroy et al.，Seeds，2163-171，1990.
Needleman and Wunsch，Journal of Molecular Biology，48443-453，1970.
Neuhaus et al.，Theor.Appl.Genet.，7530，1987.
Odell et al.，Nature， 313810，1985.
Osbom et al.，Theor.Appl.Genet.，71847-55，1986.
Osuna et al.，Critical Reviews In Microbiology，20107-116，1994.
Ou-Lee et al.，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，836815，1986.
Ow et al.，Science，234856-859，1986.
Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，852444-2448，1988.
Pearson，「Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA.」Methods inEnzymology，(R.Doolittle，ed.)，183，63-98，Academic Press，San Diego，California，USA，1990.
Pearson，Protein Science，41145-1160，1995.
Pena et al.，Nature，325274，1987.
Perlak et al.，Bio/Technology，8939-943，1990.
Perlak et al.，Plant Molecular Biology，22313-321，1993.
Pesole et al.，BioTechniques，25112-123，1998.
Poszkowski et al.，EMBO J.，32719，1989.
Potrykus et al.，Ann.Rev，Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，42205，1991.
Potrykus et al.，Mol.Gen.Genet.199183-188，1985.
Puig and Gilbert，J.Biol.Chem.，2697764-7771，1994.
Pyee et al.，Plant J.，749-59，1995.
Rhodes et al.，Science，240204，1988.
Richins et al.，Nucleic Acids Res.，208451，1987.
Robinson et al.，Bio/Technology，1381-384，1994.
Rodnguez et al.，VectorsA Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses，Butterworths，Boston，1988.
Rogan and Bessman，J.Bacteriol.，103622-633，1970.
Rogers et al.，Meth.In Enzymol，153253-277，1987.
Samac et al.，Seeds，31063-1072，1991.
Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989.
Schroeder et al.，Plant J.，2161-172，1992.
Schroeder et al.，Plant Physiol.，101(3)751-757，1993.
Schulze-Lefert et al.，EMBO J.，8651，1989.
Sequence Analysis Software Package Manual(Version 1.0；Genetics Computer Group，Inc.，University of Wisconsin Biotechnology Center，Madison，Wisconsin)Simpson，Science，23334，1986.
Singer and Kusmierek，Ann.Rev.Biochem.，52655-693，1982.
Slighton and Beachy，Planta，172356，1987.
Smith，et al.InGenetic EngineeringPrinciples and Methods，Setlow et al.，Eds.，PlenumPress，NY，1-32，1981.
Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics，2482-489，1981.
Smith et al.，Nucleic Acids Research，112205-2220，1983.
Somers et al.，Bio/Technology，101589，1992.
Stalker et al.，J.Biol.Chem.，2636310-6314，1988.
Sutcliffe et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.A.A.)，753737-3741，1978.
Thillet et al.，J.Biol.Chem.，26312500-12508，1988.
Vandeyar et al.Gene，65129-133，1988Van Tunen et al.，EMBO J.，71257，1988.
Vasil，Biotechnology，6397，1988.
Vasil et al.，Bio/Technology，10667，1992.
Verdier，Yeast，6271-297，1990.
Vodkin et al.，Cell，341023，1983.
Vogel et al.，J.Cell Biochem.，(Suppl)13D312，1989.
Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)6099-6103，1992.
Wallace et al.，British J.Nutrition，50345-355，1983.
Wang and Tsou，FASEB Journal，71515-1517，1993.
Watkins，Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers，Second Edition，DarlandBooks，Caldwell，N.J.
Weissbach and Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，(Eds.)，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1988.
Weisshaar et al.，EMBO J.，101777-1786，1991.
Wenzler et al.，Plant Mol.Biol.，1241-50，1989.
Whitham et al.，Cell，781101-1115，1994.
Williams，et al，Biotechnology，10540-543，1992.
Winnacker-Kuchler，Chemical Technology，4th Ed.，Vol.7，Hanser Verlag，Munieh，1986.
Wolf et al.，Compu.Appl.Biosci，4(1)187-91，1988.
Wong and Neumann，Biochim.Biophys.Res.Commun.，107(2)584-587，1982.
Wu et al.，Seeds，7(9)1357-1368，1995.
Yang et al.，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，874144-48，1990.
Yamaguchi-Shinozaki et al.，Plant Mol.Biol.，15905，1990.
Yelton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，811470-1474，1984.
Zatloukal et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，660136-153，1992.
Zhang and Wu，Theor.Appl.Genet.，76835，1988.
Zhou et al.，Methods in Enzymology，101433，1983.
Zukowsky et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)，801101-1105，1983.
U.S.Patent.Nos.3,959,493；4,533,557；4,554,101；4,683,195；4,683,202；4,713,245；4,757,011；4,769,061；4,826,694；4,940,835；4,957,748；4，971,908；5,100,679；5,219,596；5,384,253；5,689,052；5,936,069；6,005,076；6,146,669 and 6,156,227.
EP Application Nos.0 154 204；0 218 571；0 238 023；0 255 378 and 0 385 962.
序列表110威廉.D.拉普(Rapp，William)彭潔心(Peng，Jiexin)高薩姆.納迪格(Nadig，Gautham)蒂亞麻岡德路.文卡泰什(Venkatesh，T)120增強型蛋白及其應用方法13016515.00316083170PatentIn version 3.12101211439212PRT213大豆(Glycine max)4001Met Met Arg Val Arg Phe Pro Leu Leu Val Leu Leu Gly Thr Val Phe1 5 10 15Leu Ala Ser Val Cys Val Ser Leu Lys Val Arg Glu Asp Glu Asn Asn20 25 30Pro Phe Tyr Phe Arg Ser Ser Asn Ser Phe Gln Thr Leu Phe Glu Asn35 40 45Gln Asn Val Arg Ile Arg Leu Leu Gln Arg Phe Asn Lys Arg Ser Pro50 55 60Gln Leu Glu Asn Leu Arg Asp Tyr Arg Ile Val Gln Phe Gln Ser Lys65 70 75 80
Pro Asn Thr Ile Leu Leu Pro His His Ala Asp Ala Asp Phe Leu Leu85 90 95Phe Val Leu Ser Gly Arg Ala Ile Leu Thr Leu Val Asn Asn Asp Asp100 105 110Arg Asp Ser Tyr Asn Leu His Pro Gly Asp Ala Gln Arg Ile Pro Ala115 120 125Gly Thr Thr Tyr Tyr Leu Va1 Asn Pro His Asp His Gln Asn Leu Lys130 135 140Ile Ile Lys Leu Ala Ile Pro Val Asn Lys Pro Gly Arg Tyr Asp Asp145 150 155 160Phe Phe Leu Ser Ser Thr Gln Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Gln Gly Phe165 170 175Ser His Asn Ile Leu Glu Thr Ser Phe His Ser Glu Phe Glu Glu Ile180 185 190Asn Arg Val Leu Phe Gly Glu Glu Glu Glu Gln Arg Gln Gln Glu Gly195 200 205Val Ile Val Glu Leu Ser Lys Glu Gln Ile Arg Gln Leu Ser Arg Arg210 215 220Ala Lys Ser Ser Ser Arg Lys Thr Ile Ser Ser Glu Asp Glu Pro Phe225 230 235 240Asn Leu Arg Ser Arg Asn Pro Ile Tyr Ser Asn Asn Phe Gly Lys Phe245 250 255Phe Glu Ile Thr Pro Glu Lys Asn Pro Gln Leu Arg Asp Leu Asp Ile260 265 270Phe Leu Ser Ser Val Asp Ile Asn Glu Gly Ala Leu Leu Leu Pro His275 280 285Phe Asn Ser Lys Ala Ile Val Ile Leu Val Ile Asn Glu Gly Asp Ala290 295 300Asn Ile Glu Leu Val Gly Ile Lys Glu Gln Gln Gln Lys Gln Lys Gln305 310 315 320
Glu Glu Glu Pro Leu Glu Val Gln Arg Tyr Arg Ala Glu Leu Ser Glu325 330 335Asp Asp Val Phe Val Ile Pro Ala Ala Tyr Pro Phe Val Val Asn Ala340 345 350Thr Ser Asn Leu Asn Phe Leu Ala Phe Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn355 360 365Gln Arg Asn Phe Leu Ala Gly Glu Lys Asp Asn Val Val Arg Gln Ile370 375 380Glu Arg Gln Val Gln Glu Leu Ala Phe Pro Gly Ser Ala Gln Asp Val385 390 395 400Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gln Arg Glu Ser Tyr Phe Val Asp Ala Gln405 410 415Pro Gln Gln Lys Glu Glu Gly Ser Lys Gly Arg Lys Gly Pro Phe Pro420 425 430Ser Ile Leu Gly Ala Leu Tyr4352102211390212PRT213大豆(Glycine max)4002Val Arg Glu Asp Glu Asn Asn Pro Phe Tyr Phe Arg Ser Ser Asn Ser1 5 10 15Phe Gln Thr Leu Phe Glu Asn Gln Asn Val Arg Ile Arg Leu Leu Gln20 25 30Arg Phe Asn Lys Arg Ser Pro Gln Leu Glu Asn Leu Arg Asp Tyr Arg35 40 45Ile Val Gln PheGln Ser Lys Pro Asn Thr Ile Leu Leu Pro His His50 55 60
Ala Asp Ala Asp Phe Leu Leu Phe Val Leu Ser Gly Arg Ala Ile Leu65 70 75 80Thr Leu Val Asn Asn Asp Asp Arg Asp Ser Tyr Asn Leu His Pro Gly85 90 95Asp Ala Gln Arg Ile Pro Ala Gly Thr Thr Tyr Tyr Leu Val Asn Pro100 105 110His Asp His Gln Asn Leu Lys Ile Ile Lys Leu Ala Ile Pro Val Asn115 120 125Lys Pro Gly Arg Tyr Asp Asp Phe Phe Leu Ser Ser Thr Gln Ala Gln130 135 140Gln Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser His Asn Ile Leu Glu Thr Ser Phe145 150 155 160His Ser Glu Phe Glu Glu Ile Asn Arg Val Leu Phe Gly Glu Glu Glu165 170 175Glu Gln Arg Gln Gln Glu Gly Val Ile Val Glu Leu Ser Lys Glu Gln180 185 190Ile Arg Gln Leu Ser Arg Arg Ala Lys Ser Ser Ser Arg Lys Thr Ile195 200 205Ser Ser Glu Asp Glu Pro Phe Asn Leu Arg Ser Arg Asn Pro Ile Tyr210215 220Ser Asn Asn Phe Gly Lys Phe Phe Glu Ile Thr Pro Glu Lys Asn Pro225 230 235 240Gln Leu Arg Asp Leu Asp Ile Phe Leu Ser Ser Val Asp Ile Asn Glu245 250 255Gly Ala Leu Leu Leu Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Ile Val Ile Leu260 265 270Val Ile Asn Glu Gly Asp Ala Asn Ile Glu Leu Val Gly Ile Lys Glu275 280285Gln Gln Gln Lys Gln Lys Gln Glu Glu Glu Pro Leu Glu Val Gln Arg290 295 300
Tyr Arg Ala Glu Leu Ser Glu Asp Asp Val Phe Val Ile Pro Ala Ala305 310 315 320Tyr Pro Phe Val Val Asn Ala Thr Ser Asn Leu Asn Phe Leu Ala Phe325 330 335Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn Gln Arg Asn Phe Leu Ala Gly Glu Lys340 345 350Asp Asn Val Val Arg Gln Ile Glu Arg Gln Val Gln Glu Leu Ala Phe355 360 365Pro Gly Ser Ala Gln Asp Val Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gln Arg Glu370 375 380Ser Tyr Phe Val Asp Ala385 39021032111320212DNA213大豆(Glycine max)4003atgatgagag tgcggtttcc tttgttggtg ttgctgggaa ctgttttcct ggcatcagtt 60tgtgtctcat taaaggtgag agaggatgag aataaccctt tctacttgag aagctctaac120agcttccaaa ctctctttga gaaccaaaac ggtcgcattc gtctcctcca gagattcaac180aaacgctccc cacaacttga gaaccttcga gactaccgga ttgtccagtt tcagtcaaaa240cccaacacaa tccttctccc ccaccatgct gacgccgatt tcctcctctt tgtccttagc300gggagagcca tacttacctt ggtgaacaac gacgacagag actcctacaa ccttcaccct360ggcgatgccc agagaatccc agctggaacc acttactatt tggttaaccc tcacgaccac420cagaatctca aaataatcaa acttgccata cccgtcaaca aacctggcag atatgatgat480ttcttcttat ctagcactca agcccaacag tcctacttgc aaggcttcag ccataatatt540ctagagacct ccttccatag cgaattcgag gagataaaca gggttttgtt gggagaggaa600gaggagcaga ggcagcaaga gggagtgatc gtggaactct caaaggaaca aattcggcaa660ctgagcagac gtgccaaatc tagttcaagg aaaaccattt cctccgaaga tgaaccattc720aacttgagaa gccgcaaccc catctattcc aacaactttg gaaagttctt tgagatcacc780
cctgagaaaa ccccacagct tcgggacttg gatatcttcc tcagttctgt ggatatcaac 840gaaggagctc ttcttctacc acacttcaat tcaaaggcca tagtgatact agtgattaat 900gaaggagatg caaacattga acttgttggc attaaagaac aacaacagaa gcagaaacag 960gaagaggaac ctttggaagt gcaaaggtac agagctgaat tgtctgaaga cgatgtattt1020gtaattccag cagcttatcc atttgtcgtc aacgctacct caaacctcaa tttccttgct1080tttggtatca atgctgagaa caaccagagg aacttccttg caggcgagaa agacaatgtg1140gtaaggcaga tagaaagaca agtgcaggag cttgcgttcc ctgggtctgc acaagatgtt1200gagaggctat taaagaagca gagggaatcc tactttgttg atgctcagcc tcagcagaag1260gaggagggga gtaagggaag aaagggtcct tttccttcaa tcttaggtgc tctctactga1320210421120212DNA213合成的4004atactatgat gagagtgcgg 20210521120212DNA213合成的4005cactccatgt ttcatcgtcc 20210621l20212DNA213合成的4006gttattcagt agagagcacc 20
210721120212DNA213合成的4007tcacgatgag ctcttacagc 20210821124212DNA213Sequence4008gactacaagg acgacgatga caag2421092118212PRT213合成的4009Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys1 52101021154212DNA213合成的40010atagccatgg actacaagga cgacgatgac aagttaaagg tgagagagga tgag 5421011
21116212DNA213合成的40011gtaaaacgac ggccag1621012211425212PRT213合成的40012Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Lys Val Arg Glu Asp Glu1 5 10 15Asn Asn Pro Phe Tyr Leu Arg Ser Ser Asn Ser Phe Gln Thr Leu Phe20 25 30Glu Asn Gln Asn Gly Arg Ile Arg Leu Leu Gln Arg Phe Asn Lys Arg35 40 45Ser Pro Gln Leu Glu Asn Leu Arg Asp Tyr Arg Ile Val Gln Phe Gln50 55 60Ser Lys Pro Asn Thr Ile Leu Leu Pro His His Ala Asp Ala Asp Phe65 70 75 80Leu Leu Phe Val Leu Ser Gly Arg Ala Ile Leu Thr Leu Val Asn Asn85 90 95Asp Asp Arg Asp Ser Tyr Asn Leu His Pro Gly Asp Ala Gln Arg Ile100 105 110Pro Ala Gly Thr Thr Tyr Tyr Leu Val Asn Pro His Asp His Gln Asn115 120 125Leu Lys Ile Ile Lys Leu Ala Ile Pro Val Asn Lys Pro Gly Arg Tyr130 135 140
Asp Asp Phe Phe Leu Ser Ser Thr Gln Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Gln145 150 155 160Gly Phe Ser His Asn Ile Leu Glu Thr Ser Phe His Ser Glu Phe Glu165 170 175Glu Ile Asn Arg Val Leu Leu Gly Glu Glu Glu Glu Gln Arg Gln Gln180 185 190Glu Gly Val Ile Val Glu Leu Ser Lys Glu Gln Ile Arg Gln Leu Ser195 200 205Arg Arg Ala Lys Ser Ser Ser Arg Lys Thr Ile Ser Ser Glu Asp Glu210 215 220Pro Phe Asn Leu Arg Ser Arg Asn Pro Ile Tyr Ser Asn Asn Phe Gly225 230 235 240Lys Phe Phe Glu Ile Thr Pro Glu Lys Thr Pro Gln Leu Arg Asp Leu245 250 255Asp Ile Phe Leu Ser Ser Val Asp Ile Asn Glu Gly Ala Leu Leu Leu260 265 270Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Ile Val Ile Leu Val Ile Asn Glu Gly275 280 285Asp Ala Asn Ile Glu Leu Val Gly Ile Lys Glu Gln Gln Gln Lys Gln290 295 300Lys Gln Glu Glu Glu Pro Leu Glu Val Gln Arg Tyr Arg Ala Glu Leu305 310 315 320Ser Glu Asp Asp Val Phe Val Ile Pro Ala Ala Tyr Pro Phe Val Val325 330 335Asn Ala Thr Ser Asn Leu Asn Phe Leu Ala Phe Gly Ile Asn Ala Glu340 345 350Asn Asn Gln Arg Asn Phe Leu Ala Gly Glu Lys Asp Asn Val Val Arg355 360 365Gln Ile Glu Arg Gln Val Gln Glu Leu Ala Phe Pro Gly Ser Ala Gln370 375 380
Asp Val Glu Arg Leu Leu Lys Lys Gln Arg Glu Ser Tyr Phe Val Asp385 390 395 400Ala Gln Pro Gln Gln Lys Glu Glu Gly Ser Lys Gly Arg Lys Gly Pro405 410 415Phe Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu Tyr420 425210132111278212DNA213合成的40013atggactaca aggacgacga tgacaagtta aaggtgagag aggatgagaa taaccctttc 60tacttgagaa gctctaacag cttccaaact ctctttgaga accaaaacgg tcgcattcgt 120ctcctccaga gattcaacaa acgctcccca caacttgaga accttcgaga ctaccggatt 180gtccagtttc agtcaaaacc caacacaatc cttctccccc accatgctga cgccgatttc 240ctcctctttg tccttagcgg gagagccata cttaccttgg tgaacaacga cgacagagac 300tcctacaacc ttcaccctgg cgatgcccag agaatcccag ctggaaccac ttactatttg 360gttaaccctc acgaccacca gaatctcaaa ataatcaaac ttgccatacc cgtcaacaaa 420cctggcagat atgatgattt cttcttatct agcactcaag cccaacagtc ctacttgcaa 480ggcttcagcc ataatattct agagacctcc ttccatagcg aattcgagga gataaacagg 540gttttgttgg gagaggaaga ggagcagagg cagcaagagg gagtgatcgt ggaactctca 600aaggaacaaa ttcggcaact gagcagacgt gccaaatcta gttcaaggaa aaccatttcc 660tccgaagatg aaccattcaa cttgagaagc cgcaacccca tctattccaa caactttgga 720aagttctttg agatcacccc tgagaaaacc ccacagcttc gggacttgga tatcttcctc 780agttctgtgg atatcaacga aggagctctt cttctaccac acttcaattc aaaggccata 840gtgatactag tgattaatga aggagatgca aacattgaac ttgttggcat taaagaacaa 900caacagaagc agaaacagga agaggaacct ttggaagtgc aaaggtacag agctgaattg 960tctgaagacg atgtatttgt aattccagca gcttatccat ttgtcgtcaa cgctacctca1020aacctcaatt tccttgcttt tggtatcaat gctgagaaca accagaggaa cttccttgca1080ggcgagaaag acaatgtggt aaggcagata gaaagacaag tgcaggagct tgcgttccct1140
gggtctgcac aagatgttga gaggctatta aagaagcaga gggaatccta ctttgttgat1200gctcagcctc agcagaagga ggaggggagt aagggaagaa agggtccttt tccttcaatc1260ttaggtgctc tctactga 127821014211417212PRT213合成的40014Met Leu Lys Val Arg Glu Asp Glu Asn Asn Pro Phe Tyr Leu Arg Ser1 5 10 15Ser Asn Ser Phe Gln Thr Leu Phe Glu Asn Gln Asn Gly Arg Ile Arg20 25 30Leu Leu Gln Arg Phe Asn Lys Arg Ser Pro Gln Leu Glu Asn Leu Arg35 40 45Asp Tyr Arg Ile Val Gln Phe Gln Ser Lys Pro Asn Thr Ile Leu Leu50 55 60Pro His His Ala Asp Ala Asp Phe Leu Leu Phe Val Leu Ser Gly Arg65 70 75 80Ala Ile Leu Thr Leu Val Asn Asn Asp Asp Arg Asp Ser Tyr Asn Leu85 90 95His Pro Gly Asp Ala Gln Arg Ile Pro Ala Gly Thr Thr Tyr Tyr Leu100 105 110Val Asn Pro His Asp His Gln Asn Leu Lys Ile Ile Lys Leu Ala Ile115 120 125Pro Val Asn Lys Pro Gly Arg Tyr Asp Asp Phe Phe Leu Ser Ser Thr130 135 140Gln Ala Gln Gln Ser Tyr Leu Gln Gly Phe Ser His Asn Ile Leu Glu145 150 155 160Thr Ser Phe His Ser Glu Phe Glu Glu Ile Asn Arg Val Leu Leu Gly165 170 175
Glu Glu Glu Glu Gln Arg Gln Gln Glu Gly Val Ile Val Glu Leu Ser180 185 190Lys Glu Gln Ile Arg Gln Leu Ser Arg Arg Ala Lys Ser Ser Ser Arg195 200 205Lys Thr Ile Ser Ser Glu Asp Glu Pro Phe Asn Leu Arg Ser Arg Asn210 215 220Pro Ile Tyr Ser Asn Asn Phe Gly Lys Phe Phe Glu Ile Thr Pro Glu225 230 235 240Lys Thr Pro Gln Leu Arg Asp Leu Asp Ile Phe Leu Ser Ser Val Asp245 250 255Ile Asn Glu Gly Ala Leu Leu Leu Pro His Phe Asn Ser Lys Ala Ile260 265 270Val Ile Leu Val Ile Asn Glu Gly Asp Ala Asn Ile Glu Leu Val Gly275 280 285Ile Lys Glu Gln Gln Gln Lys Gln Lys Gln Glu Glu Glu Pro Leu Glu290 295 300Val Gln Arg Tyr Arg Ala Glu Leu Ser Glu Asp Asp Val Phe Val Ile305 310 315 320Pro Ala Ala Tyr Pro Phe Val Val Asn Ala Thr Ser Asn Leu Asn Phe325 330 335Leu Ala Phe Gly Ile Asn Ala Glu Asn Asn Gln Arg Asn Phe Leu Ala340 345 350Gly Glu Lys Asp Asn Val Val Arg Gln Ile Glu Arg Gln Val Gln Glu355 360 365Leu Ala Phe Pro Gly Ser Ala Gln Asp Val Glu Arg Leu Leu Lys Lys370 375 380Gln Arg Glu Ser Tyr Phe Val Asp Ala Gln Pro Gln Gln Lys Glu Glu385 390 395 400Gly Ser Lys Gly Arg Lys Gly Pro Phe Pro Ser Ile Leu Gly Ala Leu405 410 415
Tyr210152111254212DNA213合成的40015atgttaaagg tgagagagga tgagaataac cctttctact tgagaagctc taacagcttc 60caaactctct ttgagaacca aaacggtcgc attcgtctcc tccagagatt caacaaacgc 120tccccacaac ttgagaacct tcgagactac cggattgtcc agtttcagtc aaaacccaac 180acaatccttc tcccccacca tgctgacgcc gatttcctcc tctttgtcct tagcgggaga 240gccatactta ccttggtgaa caacgacgac agagactcct acaaccttca ccctggcgat 300gcccagagaa tcccagctgg aaccacttac tatttggtta accctcacga ccaccagaat 360ctcaaaataa tcaaacttgc catacccgtc aacaaacctg gcagatatga tgatttcttc 420ttatctagca ctcaagccca acagtcctac ttgcaaggct tcagccataa tattctagag 480acctccttcc atagcgaatt cgaggagata aacagggttt tgttgggaga ggaagaggag 540cagaggcagc aagagggagt gatcgtggaa ctctcaaagg aacaaattcg gcaactgagc 600agacgtgcca aatctagttc aaggaaaacc atttcctccg aagatgaacc attcaacttg 660agaagccgca accccatcta ttccaacaac tttggaaagt tctttgagat cacccctgag 720aaaaccccac agcttcggga cttggatatc ttcctcagtt ctgtggatat caacgaagga 780gctcttcttc taccacactt caattcaaag gccatagtga tactagtgat taatgaagga 840gatgcaaaca ttgaacttgt tggcattaaa gaacaacaac agaagcagaa acaggaagag 900gaacctttgg aagtgcaaag gtacagagct gaattgtctg aagacgatgt atttgtaatt 960ccagcagctt atccatttgt cgtcaacgct acctcaaacc tcaatttcct tgcttttggt1020atcaatgctg agaacaacca gaggaacttc cttgcaggcg agaaagacaa tgtggtaagg1080cagatagaaa gacaagtgca ggagcttgcg ttccctgggt ctgcacaaga tgttgagagg1140ctattaaaga agcagaggga atcctacttt gttgatgctc agcctcagca gaaggaggag1200gggagtaagg gaagaaaggg tccttttcct tcaatcttag gtgctctcta ctga 125421016
21134212DNA213合成的40016gaataaccct ttctggttta gaagctctaa cagc 342101721132212DNA213合成的40017gaaccttcga gactggcgga ttgtccagtt tc 322101821136212DNA213合成的40018acaatccttc tcccctggca tgctgacgcc gatttc 362101921131212DNA213合成的40019acgacagaga ctcctggaac cttcaccctg g 312102021131212DNA
213合成的40020cagctggaac cacttggtat ttggttaacc c 312102121128212DNA213合成的40021ggaaccactt actggttggt taaccctc 282102221134212DNA213合成的40022tactatttgg ttaactggca cgaccaccag aat 342102321128212DNA213合成的40023caaacctggc agatgggatg atttcttc 282102421126212DNA213合成的
40024cccaacagtc ctggttgcaa ggcttc 262102521127212DNA213合成的40025ttgtttggag agtgggagga gcagagg272102621133212DNA213合成的40026tcctccgaag atgaatggtt caacttgaga agc 332102721128212DNA213合成的40027gcaaccccat ctggtccaac aactttgg 282102821133212DNA213合成的40028acccctgaga aaaactggca gcttcgggac ttg 33
2102921133212DNA213合成的40029aaacaggaag aggaatggtt ggaagtgcaa agg 332103021134212DNA213合成的40030ttggaagtgc aaaggtggag agctgaattg tctg 342103121133212DNA213合成的40031gtaattccag cagcttggcc atttgtcgtc aac 332103221130212DNA213合成的40032ctgagcatca acaaaccagg attccctctg 302103321125
212DNA213合成的40033ttgagaacca atggggtcgc attcg 252103421133212DNA213合成的40034gaggatgaga atattccttt ctacttgaga agc332103521120212DNA213合成的40035cctttctaca ttagaagct c 202103621123212DNA213合成的40036gagaaccaaaacatt cgcat tcg 232103721127212DNA213合成的40037
cgcattcgtc tcattcagag attcaac272103821119212DNA213合成的40038tccccacaaa ttgagaacc 192103921132212DNA213合成的40039accttcgaga ctacattatt gtccagtttc ag 322104021136212DNA213合成的40040cgagactacc ggattattat tattcagtca aaaccc 362104121136212DNA213合成的40041cgagactaca ttattgtcat ttttcagtca aaaccc 36
2104221117212DNA213合成的40042attgtccaga ttcagtc 172104321119212DNA213合成的40043aacacaatca ttctccccc 192104421127212DNA213合成的40044atccttctcc ccattcatgc tgacgcc272104521122212DNA213合成的40045gacgccgatt tcattctctt tg 222104621142
212DNA213合成的40046gctgacgccg atttcattat tattattctt agcgggagag cc 422104721124212DNA213合成的40047attattatta ttagcgggag agcc 242104821130212DNA213合成的40048gtccttagcg ggattgccat acttaccttg302104921119212DNA213合成的40049agagccataa ttaccttgg192105021127212DNA213合成的
40050gccataatta ccattgtgaa caacgac272105121127212DNA213合成的40051agagactcct acattcttca ccctggc 272105221120212DNA213合成的40052tcctacaaca ttcaccctgg 202105321127212DNA213合成的40053cttcaccctg gcattgccca gagaatc 272105421128212DNA213合成的40054cctggcgatg ccattagaat cccagctg28
2105521134212DNA213合成的40055tggaaccact tactatatta ttaaccctca cgac 342105621127212DNA213合成的40056tatttggtta acattcacga ccaccag 272105721126212DNA213合成的40057caaaataatc attcttgcca tacccg 262105821122212DNA213合成的40058ataatcaaaa ttgccatacc cg 222105921130
212DNA213合成的40059aaacttgcca taattgtcaa caaacctggc 302106021127212DNA213合成的40060cagcaagagg gaattatcgt ggaactc272106121130212DNA213合成的40061agaagccgca acattatctg gtccaacaac 302106221129212DNA213合成的40062aactttggaa agatttttga gatcacccc 292106321136212DNA213合成的
40063atcacccctg agaaaattat tcagcttcgg gacttg 362106421118212DNA213合成的40064aacccacaga ttcgggac 182106521119212DNA213合成的40065ggagctctta ttctaccac 192106621128212DNA213合成的40066cgaaggagct cttattattc cacacttc 282106721121212DNA213合成的40067ccacacttca tttcaaaggc c 21
2106821128212DNA213合成的40068gccatagtga taattgtgat taatgaag 282106921140212DNA213合成的40069caaaggccat agtgataatt attattaatg aaggagatgc 402107021123212DNA213合成的40070ctagtgatta ttgaaggaga tgc 232107121121212DNA213合成的40071gcaaacattg aaattgttgg c 212107221130
212DNA213合成的40072acaggaagag gaaattttgg aagtgcaaag 302107321125212DNA213合成的40073tacagagctg aaatttctga agacg 252107421132212DNA213合成的40074tctgaagacg atatttttgt aattccagca gc 322107521132212DNA213合成的40075tctgaagacg atattattgt aattccagca gc 322107621121212DNA213合成的
40076gcttatccaa ttgtcgtcaa c212107721126212DNA213合成的40077tatccatttg tcattaacgc tacctc 262107821126212DNA213合成的40078gctacctcaa acattaattt ccttgc 262107921120212DNA213合成的40079ctcaatttca ttgcttttgg 202108021148212DNA213合成的40080gctacctcaa acctcaatat tattgctatt ggtatcaatg ctgagaac 48
2108121128212DNA213合成的40081aatgctgaga acattcagag gaacttcc 282108221120212DNA213合成的40082gaatcctaca ttgttgatgc 202108321123212DNA213合成的40083tcctacttta ttgatgctca gcc 2權利要求
1.一種修飾的多肽，它在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未修飾多肽中包含選自異亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸，或色氨酸的一或多個必需胺基酸的取代，其中所述修飾的多肽能在種子中積累。
2.權利要求1的修飾的多肽，其中加入2個或更多個所述必需胺基酸。
3.權利要求1的修飾的多肽，其中所述修飾的多肽中包含，相對於所述未修飾的多肽而言，異亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸或色氨酸，或其任意組合增加0.25％(重量比)以上。
4.一種修飾的β-伴大豆球蛋白多肽，它在具有胺基酸序列SEQ IDNO1的未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中包含選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，或組氨酸的一或多個必需胺基酸的取代，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽能在種子中積累。
5.權利要求4的β-伴大豆球蛋白多肽，其中加入2個或更多個所述必需胺基酸。
6.權利要求4的β-伴大豆球蛋白多肽，其中所述修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中包含，相對於所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽而言，蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，組氨酸，或其任意組合增加0.25％(重量比)以上。
7.權利要求4的β-伴大豆球蛋白多肽，其中用色氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個胺基酸N32，Y35，N40，N50，Y72，H88，Y116，H119，Y132，Y133，P137，Y158，Y172，E200，P239，Y249，P265，P324，Y330，Y346，N368，或Y411。
8.權利要求4的修飾的多肽，其中用異亮氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個胺基酸N32，L36，F46，G51，L56，F59，Q65，L66，Y72，R73，V75，Q76，L85，H88，F94，L95，L96，F97，V98，L99，R102，L105，L107，N117，L118，D121，Q124，R125，P127，Y132，Y133，L134，V135，P137，L143，K147，L148，P151，Y158，F162，Q169，L173，L181，V209，P239，F240，P247，F256，E258，T264，P265，L267，F273，L274，L285，L286，H288，N290，V295，L297，V298，N300，L308，V309，K317，K319，P324，L334，V339，F340，V341，Y346，F348，V350，L356，F358，L359，F361，N368，F372，F393，Y411，F412，或V413。
9.權利要求4的修飾的多肽，其中用蘇氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個胺基酸S54，S225，S250，S251，S75，S90，S202，S16，S38，S139，S149，S197，S385，A65，A67，A78，A98，A124，A258，A279，A307，A327，A335，A268，A340，A367，V83，V284，V324，V186，V375，L171，L348，N275，N326，N346，N92，N216，N280，N332，N35，N168，Q53，Q303，Q32，R304，K201，K230，E276，E282，D68，D135，D89，D253，D389，D313，F136，P262，P62，P222，P318，或P240。
10.權利要求4的修飾的多肽，其中用賴氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個胺基酸R169，R194，R243，R361，R377，R37，R357，R304，R45，R132，R179，R199，R205，R883，S75，S202，S13，S210，S329，S371，T328，N84，N117，N225，N339，Q192，Q149，Q241，Q116，Q142，Q145，H153，V363，L379，L300，I155，1208，I223，I286，D89，E157，E166，E191，E365，或E376。
11.權利要求4的修飾的多肽，其中用甲硫氨酸殘基取代所述未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中選自下組的至少一個胺基酸L41，L156，L242，L245，L188，L379，I167，I193，I208，F34，Y386，N239，Q364，或Q241。
12.一種編碼修飾的β-伴大豆球蛋白多肽的重組核酸分子，所述多肽在具有胺基酸序列SEQ ID NO1的未修飾的β-伴大豆球蛋白多肽中包含選自蘇氨酸，異亮氨酸，色氨酸，纈氨酸，精氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，或組氨酸的一或多個必需胺基酸的取代，其中所述修飾的多肽能在細胞中積累。
13.權利要求12的重組核酸分子，還包括，在5』到3』的方向，與所述核酸分子可操作相連的異源啟動子。
14.一種細胞，它包含權利要求13的重組分子。
15.權利要求14的細胞，其中所述細胞選自細菌細胞，哺乳動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，或真菌細胞。
16.權利要求14的細胞，其中所述細胞是大豆細胞。
17.一種轉基因植物，包含權利要求14的細胞。
18.權利要求17的轉基因植物，其中所述植物為大豆植物。
19.一種種子，來自權利要求18的轉基因植物。
20.一種動物飼料，包含權利要求19的種子。
全文摘要
本發明主要涉及植物遺傳學和蛋白質化學領域。更具體地，本發明涉及包含了更多必需胺基酸的修飾蛋白。本發明提供了經過修飾具有更多數量的必需胺基酸的蛋白，編碼該強化蛋白的核酸，以及設計、製備和應用該蛋白的方法。本發明還包括含有該強化蛋白的組合物、轉化植物細胞、轉基因植物和種子，及其製備和應用方法。
文檔編號C07K14/415GK1638785SQ02818159
公開日2005年7月13日 申請日期2002年9月17日 優先權日2001年9月17日
發明者威廉·D·拉普, 彭潔心, 高薩姆·納迪格, 蒂亞馬岡德路·文卡泰什 申請人:孟山都技術公司