具有抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物的製備方法及用途的製作方法

2023-10-11 00:51:09

專利名稱：：具有抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物的製備方法及用途的製作方法
技術領域：
：本發明屬於天然髙分子領域，也屬於生化製藥領域，涉及一種天然抗腫瘤新藥，更具體涉及一種具有抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物的製備方法，同時還涉及一種具有抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物在製備治療或預防腫瘤的藥物中的應用。
背景技術：
：L腫瘤已成為威脅人類健康的頭號殺手腫瘤是嚴重威脅人類生命的常見病和多發病之一，其發病率逐年增高。據世界衛生組織調査表明，全世界每年新發現癌症患者近1000萬人。每年因癌症死亡的人數近700萬人。最近統計資料表明，我國每年新發現癌症患者約2000萬人，近150萬人死於癌症。癌症的死亡人數佔總死亡數的1/5。因此防癌、治癌已成為一項迫在眉睫的艱苦任務。2.當前治療腫瘤的方法與相關藥品很多，但都存在一定的局限性治療腫瘤的傳統方法有手術切除、放療和化療。但對於許多病人，在被確診為腫瘤時，就己經失去了手術切除的機會；而放療則存在局限性和對正常組織的損傷性；化療普遍存在細胞毒性作用，特別對肝、腎、骨髓和消化系統的毒副作用非常嚴重，因此，大大制約了它們在臨床上的應用。新興的介入治療對原發灶有一定的作用，但難以對付不斷散發的轉移灶；基因治療給腫瘤患者帶來曙光，但其載體構建、載體與彈頭的交聯及其在機體分布、代謝過程中的變化等諸多問題還在探討之中。3.多糖蛋白複合物的抗腫瘤活性多糖蛋白複合物(Polysaccharide-proteinComplex)廣泛存在於動植物體內，其生理功能除了粘附和支持作用外，在細胞識別、信號傳導、調控機體免疫功能以及控制細胞的遷移、增殖、分化、代謝等方面都有十分重要的作用。近年來，從植物、動物中提取的多糖蛋白複合物類藥物的抗腫瘤活性引起了人們的廣泛關注，通過對其作用機理的研究發現多糖蛋白複合物的抗腫瘤作用主要在於其能增強機體的體液免疫和細胞免疫功能，有的能直接殺傷腫瘤細胞(F.Lkietal.，.ImmunomodulationandAnti-CancerActivityofPolysaccharide-ProteinComplexes,CurrentMedicinalChemistry,2000,7(7),715-729)。已有研究表明一些新型結構的多糖蛋白複合物在增強機體免疫和控制腫瘤細胞增殖方面具有顯著作用①從寧夏枸杞中(Ayd"m^Ac/ram)提取得到的多糖蛋白複合物(LBP)具有具有增強機體免疫功能、抗癌抑瘤的作用及抗氧化抗衰老等作用(LuGanetal.,Immunomodulationandantitumoractivitybyapolysaccharide—proteincomplexfromLyciumbarbarum.2004;4(4):563-9.)，且經研究發現其抗腫瘤作用機理是抑制原癌基因c-myc的表達(趙榮國.冬蟲夏草的藥理研究進展[J].新疆中醫藥，1992,(4):46-49);②從擔子菌綱雲芝菌絲體中提取得到的分子量在50200KD左右的雲芝多糖蛋白複合物(Polysaccharide-proteincomplexesofCoriolusversicolor,PSK)作為一種具有增強免疫作用的生物調節劑，在日本已被廣泛用於臨床。實驗表明，PSK不僅可以通過增強腫瘤抗原的免疫原性而促使機體對腫瘤細胞的識別和殺滅，而且體外、體內給藥均可顯著增強小鼠脾淋巴細胞的轉化和功能，並促進其分泌IL-2和IFN-y等免疫活性因子，且能增強荷瘤小鼠和正常小鼠脾淋巴細胞產生抗體的能力(JianCuietal.,polysaccharide-proteincomplexofCoriolusversicolor:physiologicalactivity,uses,andproduction.2003;21(2):109-22.)。③從螺旋藻中提取得到的多糖蛋白複合物(spirulinaplatensispolysaccharide-proteincomplex,SPP)可提高不同病期白血病患者NK細胞活性，但不影響正常人NK細胞活性。另外，體外研究表明，SPP能抑制B37乳癌細胞和&562白血病細胞；體內研究表明，SPP能抑制H22肝癌細胞、ECA腫瘤細胞以及S咖癌細胞，同時發現SPP能增加脾和胸腺的重量，提高活化的NK細胞的活性和數量以及激活荷瘤小鼠脾淋巴細胞產生IL-2,對化療導致的白細胞下降也有治療作用(曲顯俊，等.螺旋藻多糖抗癌作用的實驗研究[J].中國海洋藥物，2000，19(3):10-14)。④從海洋軟體動物和傳統中藥土鱉蟲中提取的多糖蛋白複合物均具有顯著的抗腫瘤活性(顧謙群等.扇貝糖蛋白的化學組成與抗腫瘤活性的研究[J].中國海洋藥物，1998(3):23—26;韓雅莉,謝昆.土鱉蟲糖蛋白的提取及抗腫瘤活性初步研究.汕頭大學學報(自然科學版)，2006(11)，21(4):46-50)。此外，海綿體多糖蛋白複合物，4-硒硫酸酯多糖蛋白複合物(SE-CARRA)，人參多糖蛋白複合物(Ginsengpolysaccharide-proteincomplex,GP)也有抗腫瘤活性。戴氏蟲草多糖蛋白複合物(Cordycepstaiipolysaccharide-proteincomplex,CDP)能引起T、NK以及單核-巨嗜細胞的活化、增殖，同時對小鼠T淋巴細胞分泌IL-2和TNFe具有促進作用。鮑魚多糖(Abalonepolysaccharide-proteincomplex,AP)對裸鼠移植人鼻咽癌細胞具有明顯的抑制作用，能明顯抑制人鼻咽癌的生長，誘導腫瘤細胞凋亡和壞死。4.祖國醫學中蜈蚣的研究進展和研究空白蜈蚣是我國傳統中藥材之一。祖國醫學中，蜈蚣入藥歷史悠久，主要用於息風鎮痙，攻毒散結，通絡止痛。近年來，對蜈蚣及其提取物抗腫瘤作用的研究日趨深入。曲愛兵等研究發現蜈蚣提取物對胃癌細胞、肝癌細胞有一定的抑制作用(曲愛兵，等.蜈蚣組織提取物抗腫瘤活性的初步研究.實用腫瘤學雜誌，2003(7):29-30)。許鳴鏑，柳雪枚等在文獻中提及蜈蚣總鹼性蛋白對人口腔上皮細胞鱗癌(KB細胞)和人結腸癌細胞(HCT細胞)有明顯的抑制作用，且活性穩定(許鳴鏑，等.蜈蚣鹼性蛋白SSmp-d的分離純化及其部分理化性質鑑定.ChineseBiochemicalJournal,1997,1113(15):586-591)。曾紅等將蜈峻脫脂處理後，經柱層析分離出總蛋白成分，用MTT法發現其對人NCI-H23肺癌細胞、UO-31腎癌細胞、KM-12結腸癌細胞、BEL-7402肝癌細胞和SK-OV-3卵巢癌細胞的生長有抑制作用(曾紅，張國剛，程巨龍，等.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.HunanJournalofTraditionalChineseMedicine,2004,120(15):57-58)。焦波等研究發現蜈蚣的水提取物具有顯著的抗腫瘤活性(焦波，等.蜈蚣提取物對小鼠精原細胞的作用.山東醫科大學學報.1999，37(4):358)。但是，迄今為止，經檢索沒有一種具有抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物的製備方法及其用途被公開或使用。
發明內容本發明的目的是在於提供了一種具有抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物的製備方法，方法易行，操作簡便，原料來源廣泛，能有效地殺傷腫瘤細胞和提高機體免疫力，療效顯著，成本低，對人體基本無毒副作用。本發明的另一個目的是在於提供了一種具有抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物在製備治療或預防肺癌、肝癌、口腔表皮癌、結腸癌和乳腺癌的藥物中的應用。為了達到上述目的，本發明採用以下技術措施本發明從少棘蜈蚣全蟲中獲得一種高效抗腫瘤活性組分一蜈蚣多糖蛋白複合物(ScolopendraPolysaccharide-ProteinComplex),簡稱SPPC。蜈虼多糖蛋白複合物(SPPC)為單一組分的多糖蛋白複合物，相對分子質量為128，000D,其多糖含量91.8%，主要為Gal、Fru、Ara、Rha，蛋白含量8.2%,主要為Asp、Glu、Gly、Pro;多糖部分和蛋白部分是通過O-糖肽鍵連接的。同時該多糖蛋白複合物具有良好的水溶性、熱穩定性以及對pH值和離子強度的不敏感性，並且在800ng/ml沒有表現出明顯的溶血和凝集活性。一種具有抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物的製備方法，它包括下列步驟①以少棘蜈蚣作為原料母體，清洗35次，烘乾24小時，烘乾溫度控制在60~80。C;②研磨第1步驟中乾燥後的原料母體並過50200目篩得蜈蚣細粉；③將第2步驟中的蜈蚣細粉用5倍體積蒸餾水抽提13小時，溫度控制在809(TC，紗布過濾(得一份提取液)，取殘渣再用4倍體積蒸餾水重複提取三次(得三份提取液)，合併以上四份提取液，2500r/min離心2030分鐘，獲取上清；④將第3歩驟中的上清減壓至0.1MPa後濃縮，溫度控制在5070°C，加入5倍體積95%乙醇，於4。C靜置過夜，傾去上清，取沉澱，2500r/min離心IO分鐘，收集沉澱；⑤將第4步驟中的沉澱用500ml蒸餾水溶解，計量40%飽和度所需要的固體硫酸銨量，於4'C加入，攪拌4h、10000r/min離心20分鐘後，收集上清並計量體積，重複此步驟的操作(l次)，收集60%飽和度的沉澱物；⑥將第5步驟中的沉澱物用30ml蒸餾水溶解後，上DEAE-50離子交換層析柱(2.6X40cm)純化，以蒸餾水平衡，用0.050.25mol/LNaCl溶液洗脫，收集洗脫液，用透析袋在雙蒸水中透析48小時脫鹽，再用聚乙二醇20000濃縮；⑦將第6步驟中的濃縮液上SephadexG-200層析柱(2.6X60cm)純化，用0.02mol/LpH為7.2的Tris-HCl溶液洗脫後，經真空冷凍乾燥，預凍溫度控制在-45-15°C，加熱溫度控制在2040°C，乾燥812小時後得蜈蚣多糖蛋白複合物純品。以上所述的SPPC:①明顯提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能和胸腺指數，恢復荷瘤動物低下的遲發性變態反應(DTH)，通過影響T細胞數量、增強NK細胞毒性和1—L-2的活性，達到調節機體免疫功能的作用；②具有對人A549肺癌細胞、口腔表皮癌KB細胞、KM-12結腸癌細胞、BEL-7402肝癌細胞和MCF-7乳腺癌細胞生長的抑制作用；③與環磷醯胺聯合使用可顯著提高抑瘤作用，並對大鼠血小板減少和骨髓有核細胞數量減少具有保護作用，具有一定的減毒增效作用。一種具有天然抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)，以少棘蜈蚣全蟲為原料母體水浴抽提，將提取液濃縮後，經醇提，硫酸銨鹽析，DEAE-50纖維素離子交換層析，SephadexG-200柱層析後獲得多糖蛋白複合體。一種從少棘蜈蚣(Sco/印e"draSwfopz'm;/7MMwri/am'Z.Xoc/0中提取、分離、純化得到的蜈虼多糖蛋白複合物(ScolopendraPolysaccharide-ProteinComplex),簡稱SPPC。所述的sPSPC的分子量為128,000道爾頓。所述的蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)，①多糖與蛋白質的含量分別為91.8%和8.2%;②糖組成特點主要由半乳糖、果糖、阿拉伯糖、鼠李糖和甘露糖組成。③胺基酸組成特點主要由天冬氨酸、穀氨酸、甘氨酸和脯氨酸組成。④連接鍵多糖部分和蛋白部分是通過O-糖肽鍵連接的。⑤溶解性溶於水。⑥熱穩定性穩定。⑦pH值和離子強度的敏感性不敏感。⑧溶血和凝集活性在800ng/ml沒有明顯的溶血和凝集活性。本發明的優點1.本發明採用的蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)是以少棘蜈蚣作為原料母體經提取、分離和純化得到的，原料來源廣泛且質量優良。2.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的提取、分離、純化工藝簡單易行，技術成熟。3.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)具有良好的水溶性、熱穩定性以及對pH值和離子強度的不敏感性，無明顯的溶血和凝集活性。4.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)可通過增強巨噬細胞吞噬能力、影響T細胞數量、增強NK細胞毒性和IL-2的活性等作用提高機體的免疫功能。5.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)可直接有效地殺傷腫瘤細胞，產生抑瘤效應。6.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)與環磷醯胺等化療藥物聯合應用具有減毒增效作用。7.本發明採用常規給藥劑型，技術成熟，生產工藝簡單易行。8.本發明採用常規給藥方式，給藥方便，無痛苦，沒有後遺症。圖1表示蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的SephadexG-100凝膠層析洗脫曲線。圖中橫坐標表示洗脫液的洗脫體積，縱坐標表示於490nm處的吸光度。圖2表示蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的考馬斯亮藍R-250染色(B)和過碘酸-Schiff染色(C)。圖3表示蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的紅外光譜圖。圖中橫坐標表示紅外光的掃描波數，縱坐標表示透過率。圖4表示蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的紫外光譜圖。圖中橫坐標表示紫外光的掃描波長，縱坐標表示於吸光度。圖5表示蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)經P-消除反應後的紫外光譜圖。具體實施例方式現結合以下具體實例對本發明的技術方案作進一步說明，但本發明的內容不完全限於此。實施例l:蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的製備①取新鮮的蜈蚣成蟲100g，清洗3次，6(TC烘乾2小時；②研磨第1步驟中乾燥後的原料母體並過50目篩得蜈蚣細粉；③將第2步驟中的蜈蚣細粉用500ml蒸餾水於8(TC抽提1小時，紗布過濾(得一份提取液)，取殘渣再用400ml蒸餾水重複提取三次(得三份提取液)，合併以上四份提取液，2500r/min離心20分鐘，獲取上清；④將第3步驟中的上清在5(TC下減壓濃縮，加入5倍體積95%乙醇，於4'C靜置過夜，傾去上清，取沉澱，2500r/min離心IO分鐘，收集沉澱；⑤將第4步驟中的沉澱用500ml蒸餾水溶解，計量40%飽和度所需要的固體硫酸銨量，於4。C緩慢加入，攪拌4h、10000r/min離心20分鐘後，收集上清並計量體積，重複此步驟操作，收集60%飽和度的沉澱物；⑥將第5步驟中的沉澱物用30ml蒸餾水溶解，上DEAE-50離子交換層析柱(2.6X40cm)純化，以蒸鎦水平衡，用500ml0.05mol/LNaCl溶液洗脫，收集洗脫液，用透析袋在雙蒸水中透析48小時脫鹽，再用聚乙二醇20000濃縮；⑦將第6步驟中的濃縮液上SephadexG-200層析柱(2.6X60cm)純化，用200ml0.02mol/LpH為7.2的Tris-HCl溶液洗脫後，經真空冷凍乾燥，預凍溫度控制在-45'C，加熱溫度控制在2(TC，乾燥8小時後得蜈蚣多糖蛋白複合物純品0.315g。實施例2:蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的製備①取新鮮的蜈蚣成蟲100g，清洗4次，70。C烘乾3小時；②研磨第1步驟中乾燥後的原料母體並過100目篩得蜈蚣細粉；③將第2步驟中的蜈蚣細粉用500ml蒸餾水於85'C抽提2小時，紗布過濾(得一份提取液)，取殘渣再用400ml蒸餾水重複提取三次(得三份提取液)，合併以上四份提取液，2500r/min離心25分鐘，獲取上清；④將第3步驟中的上清在6(TC下減壓濃縮，加入5倍體積95%乙醇，於4'C靜置過夜，傾去上清，取沉澱，2500r/min離心10分鐘，收集沉澱；⑤將第4步驟中的沉澱用500ml蒸餾水溶解，計量40%飽和度所需要的固體硫酸銨量，於4'C緩慢加入，攪拌4h、10000r/min離心20分鐘後，收集上清並計量體積，重複此步驟操作，收集60%飽和度的沉澱物；⑥將第5步驟中的沉澱物用30ml蒸餾水溶解，上DEAE-50離子交換層析柱(2.6X40cm)純化，以蒸餾水平衡，用500ml0.10mol/LNaCl溶液洗脫，收集洗脫液，用透析袋在雙蒸水中透析48小時脫鹽，再用聚乙二醇20000濃縮；⑦將第6步驟中的濃縮液上SephadexG-200層析柱(2.6X60cm)純化，用200ml0.02mol/LpH為7.2的Tris-HCl溶液洗脫後，經真空冷凍乾燥，預凍溫度控制在-30°C，加熱溫度控制在3(TC，乾燥10小時後得蜈蚣多糖蛋白複合物純品0,300go實施例3:蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的製備①取新鮮的蜈蚣成蟲100g，清洗5次，7(TC烘乾4小時；②研磨第1步驟中乾燥後的原料母體並過200目篩得蜈蚣細粉；③將第2步驟中的蜈蚣細粉用500ml蒸餾水於90'C抽提3小時，紗布過濾(得一份提取液)，取殘渣再用400ml蒸餾水重複提取三次(得三份提取液)，合併以上四份提取液，2500r/min離心30分鐘，獲取上清；④將第3步驟中的上清在7(TC下減壓濃縮，加入5倍體積95%乙醇，於4。C靜置過夜，傾去上清，取沉澱，2500r/min離心10分鐘，收集沉澱；(D將第4步驟中的沉澱用500ml蒸餾水溶解，計量40%飽和度所需要的固體硫酸銨量，於4。C緩慢加入，攪拌4h、10000r/min離心20分鐘後，收集上清並計量體積，重複此步驟操作，收集60%飽和度的沉澱物；⑥將第5歩驟中的沉澱物用30ml蒸餾水溶解，上DEAE-50離子交換層析柱(2.6X40cm)純化，以蒸餾水平衡，用0.25mol/LNaCl溶液洗脫，收集洗脫液，用透析袋在雙蒸水中透析48小時脫鹽，再用聚乙二醇20000濃縮；⑦將第6步驟中的濃縮液上SephadexG-200層析柱(2.6X60cm)純化，用200ml0.02mol/LpH為7.2的Tris-HCl溶液洗脫後，經真空冷凍乾燥，預凍溫度控制在-15"，加熱溫度控制在40'C，乾燥12小時後得蜈蚣多糖蛋白複合物純品0.295g。實施例4:1、蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)中多糖、蛋白質含量組成以及純度、分子量測定(1)測定方法①純度鑑定及分子量測定將蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)純品溶解後進行SephadexG-100凝膠過濾層析，層析柱(2.6X60cm)，用0.02mol/LpH為7.2的Tris-HCl溶液洗脫，洗脫速度為1ml/min，分步收集器收集，6ml/管，並通過苯酚-硫酸反應於4卯nm檢測洗脫峰，得其凝膠層析洗脫曲線；另外，採用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，分離膠pH為8.9，分離膠濃度為12%，濃縮膠pH為8.9，濃縮膠濃度為12%，電極緩衝液為Tris-甘氨酸電泳緩衝液，樣品溶解於上樣緩衝液後，在IO(TC中煮3-5min，上樣濃度為2mg/ml，上樣量為20lU，恆壓90-180V,染色液為甲醇染色液儲備液(1:4)，染色2h，使用水乙醇醋酸(17:1:2)的脫色液脫色，脫色5-10h，之後分別經過考馬斯亮藍R-250試劑和過碘酸-Schiff試劑(PAS)染色後，通過凝膠成像分析系統觀測結果；SPPC的分子量測定採用雷射光散射法(LLS)。②多糖含量測定釆用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作為參比。具體為，準確稱取蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)10mg，加適量雙蒸水溶解，轉移至100ml容量瓶中定容；吸取該溶液1.0ml、2.0ml分別加雙蒸水至20ml，得兩份樣品待測液(濃度分別為5wg/ml、10ug/ml);取上述兩種濃度待測液各2.0ml，雙管平行，分別加入50g/L水飽和酚溶液0.5ml，混勻後迅速加入濃硫酸5ml,充分混合，室溫靜置5min，置於沸水浴中15min，冷卻至室溫，UV-1601紫外分光光度計於490nm處比色；讀取吸光度，對照以葡萄糖為參比製得的標準曲線，求得相應多糖濃度值，計算多糖含量。③單糖組成分析將蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)多糖部分充分水解後，採用高效液相色譜(HPLC)法分析。具體為，準確稱取sPSPC20mg，加入2MH2S046ml,充分溶解後移入刻度試管，密封，於10(TC水浴中水解10h;水解液以固體碳酸鋇中和，4000rpm離心，留取上清；上清液冷凍乾燥濃縮至0.5ml，收集濃縮液；將濃縮液進行高效液相色譜分析，分析柱ZorbaxCarbohydrateAnalysisColumn,流動相為乙腈水=78/22(v/v)，流速為1.5ml/min，進樣量20ml，柱溫30。C，採用示差折光檢測器檢測，對照單糖標準品的保留時間確定單糖的種類，根據各組分的峰面積比值計算摩爾比。④蛋白含量測定採用Folin-酚試劑法，以牛血清白蛋白為標準製作標準曲線，牛血清白蛋白用凱氏定氮法測定其蛋白含量。⑤胺基酸組成分析儀器為日立-835型胺基酸自動分析儀。將蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)蛋白部分充分酸解後，用胺基酸自動分析儀進行分析。具體為，準確稱取SPPC20mg，加入含有20mg苯酚的6MH2SO44ml，充分溶解後移入安瓿瓶，密封，於l(TC水解24h;水解液在真空濃縮器充分濃縮乾燥後，重新溶解在2ml的檸檬酸鹽緩衝液，過0.45um的尼龍微孔濾膜，收集濾液；將濾液注入胺基酸自動分析儀進行胺基酸組成分析。⑥紅外光譜分析儀器為FT-IR型傅立葉變換-紅外光譜儀(美國尼高力)。具體為，準確稱取蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)10mg，加入200mg乾燥的KBr晶體，在紅外燈照射下於研缽中輕輕研磨至極細，用壓片機壓片，紅外光譜在4004000cm—1掃描，測定透光率曲線。⑦核磁共振譜(NMR)分析用重水(D20)作溶劑，進行核磁共振譜分析。⑧e-消除反應及紫外光譜分析儀器為UV-3000。具體為，將蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)配成5mg/mL的溶液，再將SPPC溶液用0.2mo1/LNaOH於6(TC處理30min，對照樣品按同樣方法配製，配好後立即放入4'C冰箱，分別用UV-3000在200400nm之間進行掃描。(2)測定結果①蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的SephadexG-100凝膠層析洗脫曲線如圖1，只在60ml附近出現一個洗脫峰；並且，SPPC經過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，進一步用考馬斯亮藍R-250試劑和過碘酸-Schiff試劑染色，在凝膠成像分析系統中只顯示單一條帶，且純度》95%，見圖2。以上結果表明，SPPC為單一組分的多糖蛋白複合物。另外，用雷射散射法(LLS)測定SPPC的分子量為128，000D。②苯酚-硫酸法測得蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)多糖部分含量為91.8%;多糖部分水解液高效液相色譜(HPLC)的分析結果表明，水解液出峰的保留時間分別與Gal、Fm、Ara、Rha和Man準確地對應，說明SPPC中含有這五種單糖，具體如表1所示。表l.sPSPC的單糖組成及含量tableseeoriginaldocumentpage12③Folin-酚試劑法測得蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)蛋白部分含量為8.2%;蛋白部分酸解後經過胺基酸自動分析儀分析結果表明，SPPC蛋白部分胺基酸組成種類豐富，其中Asp、Glu、Gy、Pro含量較高，具體如表2所示。表2.SPPC的胺基酸組成及含量AminoAcidContent(%)天冬氨酸(Asp)11.2蘇氨酸(Thr)5.9絲氨酸(Ser)4.9穀氨酸(Glu)10.3脯氨酸(Pro)9.1甘氨酸(Gly)9.3丙氨酸(Ala)8.3半胱氨酸(Cys)8.0纈氨酸(Val)0.6甲硫氨酸(Met)0.4異亮氨酸(lie)5.6亮氨酸(Leu)1.1酪氨酸(Tyr)6.6苯丙氨酸(Phe)6.0組氨酸(His)1.4賴氨酸(Lys)3.4精氨酸(Arg)7.9④蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的紅外光譜分析結果見見圖3，紅外光譜在4004000cm—1掃描，sPSPC顯示具有多糖蛋白複合物一般特徵吸收。在3420cm"附近有強吸收，示有O-H鍵的伸縮振動(Y-oH);在2930cm—1附近有中強吸收，示有C-H鍵的伸縮振動(YC.H);在1640cm"附近有強吸收，示有醯胺鍵的C=0鍵伸縮及N-H鍵的變角振動；在1154cm'1、1082cm"和1024cm"處還有3個強吸收峰，提示組成的單糖可能為吡喃環結構；在851cm'1有吸收峰，在890cm'1附近無吸收峰，示SPPC的多糖部分以a-糖苷鍵連接。⑤在蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的tHNMR譜中，可見到半乳糖端質子信號為55.360，甘露糖端基質子信號為S5.185;在糖的'HNMR譜中，端基質子信號在S5.0以下的一般為e-構型，在S5.0以上的一般為a-構型，推斷半乳糖和甘乳糖殘基為a-枇喃型，與紅外光譜的分析一致；半乳糖端基質子信號強度遠大於甘露糖端基質子信號，與其含量大小有關，葡萄糖端基質子信號未能檢測出可能因為含量太低，與其它的氫的信號堆積在一起，難以歸屬。⑥e-消除反應及紫外光譜分析結果得圖4和圖5，在200400nm之間進行掃描，蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)在260nm處無吸收,在280nm左右有一肩形峰，這是多糖蛋白複合體的特徵吸收峰；糖肽鍵的2種類型，N-型糖肽鍵和O-型糖肽鍵，前者對鹼穩定，後者極易被鹼打開；在糖肽連接處，若為絲氨酸即轉變成a-氨基丙烯酸，若為蘇氨酸，則轉變為a-氨基丁烯酸，這兩種不飽和胺基酸，均在230240nm處有特徵吸收峰；SPPC經鹼處理後，在240nm處產生明顯的特徵吸收峰，說明SPPC中多糖部分和蛋白部分是通過O-糖肽鍵連接。綜上所述，蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)為單一組分的多糖蛋白複合物，相對分子質量為128，OOOD，其多糖含量91.8%，主要為Gal、Fru、Ara、Rha，蛋白含量8.2%，主要為Asp、Glu、Gly、Pro;且多糖部分和蛋白部分是通過O-糖肽鍵連接的。2、SPPC理化性質測定(1)測定方法①蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)對溫度的穩定性取sPSPC分別置於-20°C121。C的溫度範圍內設計的10個不同溫度(-20'C、4。C、15'C、25'C、37°C、50°C、70°C、90°C、100°C和121。C)處理30min，10000r/min離心lOmin，用MTT法檢測其對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響，以未經誘導的SPPC作對照。②蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)對pH值的穩定性:將SPPC在不同pH值(pH2.2、pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0禾BpH8.0)的0.02mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝溶液中放置48h(4°C)後，用MTT法檢測其對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響，以雙蒸水處理組作對照。③蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)對離子強度的穩定性:將SPPC分別在pH6.0，0.2、0.02和0.002mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝溶液，以及pH8.0，0.2、0.02和0.002mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝溶液中放置48h(4°C)後，用MTT法檢測其對小鼠脾淋巴細胞轉化的影響。④蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)的溶血和凝集活性檢測以1mlpH7.5，50mmol/LTris-HCl(含0.15mol/LNaCl)分別溶解SPPC800ug、400ixg、200ixg、100Ug和50lig，分別和等體積小鼠紅細胞懸液(緩衝液同前，終濃度1。/。(V/V))混勻，37'C振蕩1h，離心取上清液，測其546nm的OD值，即紅細胞釋放的血紅素量；陽性對照為小鼠紅細胞懸液與等體積蜂毒肽melittin的pH7.5、50mmol/LTris-HCl(含0.15mol/LNaC)溶液混和；陰性對照(不溶血)為小鼠紅細胞懸液與等體積上述緩衝液混和。同時鑑定凝集活性，陰性對照同上，陽性對照為不加樣品，改加植物血球凝集素，肉眼觀察紅細胞有無凝集現象。(2)測定結果①在10個不同溫度條件處理下，蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)均表現出明顯的免疫調節功能，即使121'C、1.5XlSpa的高溫高壓處理30inin，仍有免疫調節活性，可見SPPC具有對熱穩定的特性。②蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)溶解在7種不同pH值溶液中48h後，仍具有免疫調節活性，說明SPPC對酸和弱鹼的耐受性較強。③蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)在不同離子強度的pH6.0和pH8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝溶液處理下，均產生了免疫調節活性，說明離子強度對SPPC的活性影響不大。④通過溶血實驗，可見蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)在800ng/ml以下，與陰性對照相似，沒有表現出溶血活性，而作為陽性對照的蜂毒肽在1400ng/ml，溶血活性已達100%(完全溶血)；凝集實驗也未發現SPPC在800lag/ml以下對小白鼠的紅細胞有凝集作用，而陽性對照紅細胞凝集現象非常明顯。為了公開本發明的實質，以下從免疫調節、抑瘤作用、減毒增效等三個方面對蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)進行藥效學研究，現將具體實驗方法及實驗結果詳細說明如下，但本發明的內容完全不限於此。(一)實驗材料1、藥品少棘蜈蚣(&o/o，"^m5"wZw/7/"i^^i/W/""jA/:oc/z)成體由湖北當陽市養殖場提供，體重3g左右，由中國科學院武漢植物研究所江明喜研究員鑑定。呋喃氟脲嘧啶(FT207)由濟南製藥廠生產，批號031003;環磷醯胺由江西恆瑞醫藥股份有限公司生產，批號21156—21160;複方阿膠漿由山東阿膠股份有限公司生產，批號040672。2、動物昆明種小鼠、BALB/c小鼠、SD種大鼠，雌雄兼用，由武漢大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK(鄂)2003—0004。3、癌細胞株和靶細胞S則瘤株、艾氏腹水癌細胞，A549肺癌細胞、口腔表皮癌KB細胞、KM-12結腸癌細胞、BEL-7402肝癌細胞和MCF-7乳腺癌細胞株由中國醫科院藥物所引進、傳代；NK敏感細胞Yac-l株和IL-2依賴株CTLL細胞引自武漢大學典型生物保藏中心。4、試劑MTT(Sigma);IL-2由中國軍事醫學科學院提供，效價400IU/Amp;CD4(L3T4抗體)和CD8(Lyt-2抗體)試劑盒，由北京醫科大學免疫教研室提供；5、儀器450型酶標儀由美國BioRad生產；ZT-N型多頭細胞收集器由浙江東浦醫療器械廠生產；EG2101型液體閃爍計數器，國產；螢光顯微鏡(Olimpus)。(二)實驗方法與結果1.免疫試驗(1)ConA/LPS刺激荷瘤小鼠脾淋巴細胞體外增殖實驗分別製備NS組和50mg.kg"、lOOmg.kg-1、200mg.kg"sSPPC給藥組的荷瘤小鼠脾淋巴細胞。頸椎脫臼處死以上各實驗組荷瘤小鼠(每組5隻)，75%乙醇浸泡l-2分鐘，在無菌操作臺內迅速取出脾臟，置於盛有5-10m冷Hanks液的平皿內，平皿內預先放置一塊略大於平皿的孔徑為400目的尼龍篩網。用無菌針芯輕捻脾組織，使單個脾細胞濾過篩網進入平皿內。吸取冷Hanks衝洗篩網，將細胞懸液吸入離心管。4°C離心(1500r/min,5min)，棄上清，加入適量的Tris-NH4Cl(0.16mol丄"，pH7.2)以溶解紅細胞，吹打均勻，靜置1-2分鐘。再次離心並用冷Hanks液懸浮並離心洗滌細胞2次，棄上清，用完全RPMI-1640培養基懸浮細胞，作細胞計數，調細胞濃度至lX10^mU1。取96孔平底細胞培養板，每組每孔加入IX106個荷瘤小鼠脾淋巴細胞及終濃度為2.5ng.ml'1的ConA或5嗎.ml"的LPS共孵育，各組處理均作6個平行孔。在5%02、37。C水蒸氣飽和的二氧化碳培養箱內培養68小時，培養結束後用MTT法檢測細胞增殖。表l.SPPC對荷瘤小鼠脾淋巴細胞體外增殖的影響(i土s，77=10)tableseeoriginaldocumentpage17與正常對照組比較，AAP<0.01;與荷瘤對照組比較，'P<0.01由表l結果可見，荷瘤對照組的脾淋巴細胞體外增殖明顯低於正常對照組，表明荷瘤組小鼠的脾淋巴細胞功能低下，而SPPC大、中、小三個劑量組的淋巴細胞增殖均明顯高於荷瘤對照組，說明SPPC可明顯刺激荷瘤小鼠的脾淋巴細胞體外增殖。(2)對荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響取體重2024g健康小鼠，參照文獻《新藥(西藥)臨床前研究指導原則彙編》方法進行實驗，計算巨噬細胞吞噬百分率和吞噬指數，結果見表2。由表2結果可見，荷瘤對照組的腹腔巨噬細胞吞噬率與吞噬指數均明顯低於正常對照組，表明荷瘤組小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能低下，而SPPC大、中、小三個劑量組的上述指標均明顯高於荷瘤對照組，說明SPPC可明顯提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬功能表2.SPPC對荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響(i±s,"=10)tableseeoriginaldocumentpage17SPPC中劑量組1057.22±6.38''0.80±0.10**SPPC高劑量組2040.40±4.17*0.55±0.09**與正常對照組比較，AAP<0.01;與荷瘤對照組比較，''P<0.01吞噬百分率=[吞噬CRBC的吞噬細胞數/200個巨噬細胞數(吞與未吞)]X100%吞噬指數=被吞噬的CRBC數/200個巨噬細胞(3)對荷瘤小鼠遲發性變態反應的影響表3結果顯示，荷瘤對照組的DTH值明顯低於正常對照組，與未致敏的荷瘤空白組基本相同；而SPPC三個劑量組的DTH值則明顯高於荷瘤對照組，與正常對照組比較無顯著性差異；表明SPPC可提高荷瘤小鼠的DTH反應，使其受損的免疫功能恢復正常。表3.SPPC對荷瘤小鼠DTH反應的影響U土s,/3=10)tableseeoriginaldocumentpage18取1822g昆明種小鼠，無菌抽取傳代7天的S削肉瘤細胞混懸液，用生理鹽水稀釋(約相當於1Xl(^個瘤細胞/ml),將小鼠右腋皮膚碘酒消毒後，皮下注入瘤細胞稀釋懸液0.2ml/只；24小時後隨機分為模型對照組、FT207陽性對照組(0.15g/kg)和SPPC大、中、小(20、10、5mg/kg)三個劑量組，除模型對照組灌胃生理鹽水外，其餘各組動物每日灌胃給藥一次，連續9天(灌胃體積均為0.25ml/10g)，於末次給藥後2日，脫頸椎處死小鼠，取胸腺、脾臟，稱重，計算胸腺指數與脾指數，結果見表4:化療藥FT207可使荷瘤小鼠的胸腺和脾指數明顯降低，而SPPC則可明顯提高荷瘤小鼠的胸腺和脾指數。表4.SPPC對荷瘤小鼠免疫器官重量的影響(f±&/=10)tableseeoriginaldocumentpage19與FT207組比較，#P<0.05，"P<0.01(5)對荷瘤小鼠IL-2活性的影響結果見表5。SPPC可使荷瘤小鼠的IL-2水平明顯升高，對調節荷瘤小鼠機體免疫功能，抑制腫瘤有積極的作用表5.SPPC對荷瘤小鼠IL-2水平的影響(i±&/7=10)tableseeoriginaldocumentpage19與空白對照組比較，AP<0.05;與荷瘤對照組比較，'P<0,01(6)對荷瘤小鼠NK細胞活性的影響結果見表6。荷瘤對照組的NK細胞活性明顯低於正常對照組，而SPPC大、中、小三個劑量組的上述指標均明顯高於荷瘤對照組，NK細胞活性的增強，表明對抑制腫瘤生長發揮了積極作用。表6.SPPC對荷瘤小鼠NK細胞活性的影響(5±s)tableseeoriginaldocumentpage20與空白對照組比較，AP<0.05;與荷瘤對照組比較，''P<0.01(7)對荷瘤小鼠T細胞亞群的影響在T淋巴細胞靜活化期，其細胞膜表面出現的抗原性不同的糖蛋白分子，其作用也不同。存在於小鼠成熟的殺傷(TC)/抑制(TS)T細胞表面的Lyt-2抗原，稱為CDs分子，它能增強抗原識別受體(TCR)對外來抗原和自身MHCI類抗原的結合，以增強識別；存在於小鼠成熟的殺傷/抑制T細胞表面的L3T4分子稱為CD4分子，它能增強抗原識別受體(TCR)對外來抗原和自身MHCII類抗原的結合。檢測T細胞亞群中的CD4、CDs表面分子的表達與比例關係，有助於了解藥物的抗腫瘤活性與免疫功能之間的關係，因此，我們進行了SPPC對純系荷瘤小鼠(S化o)的T細胞亞群影響的試驗，結果見表710。表7結果顯示，各荷瘤組小鼠CD4亞群和CD8亞群與正常組比較均有顯著性差異，說明接種腫瘤後，對動物的輔助性T細胞是有影響的。SPPC各給藥組對CD4的變化影響不大，而SPPC各劑量組與荷瘤對照組比較，CD8有顯著性差異，說明SPPC對荷瘤動物的細胞毒性T細胞CD8亞群有明顯影響；由於荷瘤小鼠體內受到瘤細胞的侵蝕，其正常的T細胞亞群比例因受到多方面因素的影響而失去平衡，而給藥後CD4/CDs恢復較明顯，SPPC大、中、小劑量組與荷瘤對照組比較均有顯著性差異。表7.SPPC對T細胞亞群CD4、CD8,CD4/CD8的影響(3f±s，/=10)tableseeoriginaldocumentpage21與空白對照組比較，##P<0.01;與荷瘤對照組比較，*P<0.05，**P<0.01上述試驗結果顯示，SPPC具有較好的機體免疫調節作用；通過增強荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能、調節機體免疫功能、影響T細胞亞群的活性、提高NK細胞活性及誘導IL-2活性的增強，對抑制腫瘤生長發揮了積極的作用。2.抑瘤試驗(1)對多種癌細胞系的體外抑制作用用SPPC50、100、200mg.kg"處理小鼠，製備含藥血清；用0.25%胰酶消化、傳代細胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液調整細胞濃度至2X14.mr1，96孔培養板每孔加入100^，37。C，5XC02孵育24h，棄培養液，加入10%過濾除菌的含藥血清，37°C，5XC02共孵育18h，採用MTT法檢測細胞增殖。表8.SPPC對不同癌細胞株細胞生長的影響(i±&/=10)tableseeoriginaldocumentpage21與空白對照組比較，**P<0.01結果，與空白對照組比較，SPPC大、中、小三個劑量組對人A549肺癌細胞、口腔表皮癌KB細胞、KM-12結腸癌細胞、BEL-7402肝癌細胞和MCF-7乳腺癌細胞的生長均有明顯的抑制作用，且存在一定的量效關係(表8)。(2)對S哪肉瘤株的抑制作用取腫瘤細胞(荷瘤小鼠腹腔S180肉瘤細胞2乂106接種於雄性健康BALB/c裸鼠腋下，隨機分組。於接種後第2天開始灌胃給藥，1次/天，劑量分別為5mg.kg"、lOmg.kg"、20mg.kg—1SPPC，對照給予相應體積的生理鹽水，連續灌胃10天，於試驗結束時，摘眼球取血，摘瘤、稱瘤重。結果見表9。與荷瘤對照組比較，SPPC大、中劑量組對S咖瘤體生長均有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為56.6%和49.6%;結果表明，SPPC對小鼠S咖瘤體生長有明顯的抑制作用，且存在一定的量效關係。表9.tableseeoriginaldocumentpage22(3)對艾氏腹水癌小鼠生存期的影響表10結果表明SPPC大、中劑量組均延長艾氏腹水癌小鼠存活期，與荷瘤組比較有顯著性差異；SPPC小劑量組的作用不明顯。三次試驗結果均表明SPPC具有延長荷瘤小鼠生存期的作用。表10SPPC對艾氏腹水癌小鼠生存期的影響tableseeoriginaldocumentpage23與生理鹽水組比較，*P<0.05，**P<0.013.減毒增效試驗(1)減毒試驗檢驗結果見表1113。表ll結果表明，大鼠注射環磷醯胺後，可使骨髓有核細胞數下降48.9%，而SPPC大、中劑量給藥組可明顯改善環磷醯胺引起的大鼠骨髓有核細胞數降低。說明大、中劑量的SPPC對骨髓有核細胞具有保護作用，對化療藥造成的骨髓造血功能抑制具有一定的減毒效果。表llSPPC對環磷醯胺大鼠骨髓有核細胞數的影響^士^/7=10)tableseeoriginaldocumentpage23與正常對照組比較，AP<0.05;與模型對照組比較，*P<0.05表12結果表明，大鼠注射環磷醯胺後使白細胞和血小板數顯著下降；SPPC大、中、小劑量組的血小板數降低幅度均顯著減小，其檢測值明顯高於模型對照組。提示SPPC大、中、小劑量對環磷醯胺造成的血小板減少均有較好的對抗作用，可以在一定程度上減輕化療藥的毒副作用。表12環磷醯胺大鼠試驗後血液學指標檢測值(i"=10)tableseeoriginaldocumentpage24與正常對照組比,AAP<0.01;與模型對照組比，''P<0.01(2)增效試驗結果見表13。單獨用藥組環磷醯胺(25mg/kg)、SPPC(5mg/kg)的抑瘤率分別為37.4%和46.6%，而聯合用藥組(環磷醯胺25mg/kg+SPPC5mg/kg)的抑瘤率則為77.9%,與單獨用藥組比較，抑瘤率均有所提高；從上述試驗結果可以看出SPPC與小劑量的化療藥合用，不僅可減輕化療藥的毒副作用，同時還可提高抑瘤率，顯示了聯合用藥的優勢。表13SPPC與環磷醯胺合用對S咖瘤株生長的影響(3f±&/7=10)組別劑量(mg/kg)瘤體重(g)抑瘤率(％)tableseeoriginaldocumentpage24與生理鹽水組比較，''P<0.01(三)結論上述各項實驗結果表明，從節肢動物蜈蚣全蟲中提取的蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)不僅具有調節機體免疫功能和抑制腫瘤生長的作用，而且與化療藥合用時還可以減輕其毒副作用和增強其抑瘤效果。1.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)可明顯提高荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能和胸腺指數，恢復荷瘤小鼠低下的DTH反應，通過影響T細胞數量、增強NK細胞毒性和IL-2的活性，起到調節機體免疫功能的作用。2.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)可劑量依賴性的抑制S咖肉瘤株，三個劑量組的抑瘤率分別為56.6%、49.6%、3'5.7%，對艾氏腹水癌小鼠的生存期有延長作用；同時與低於治療劑量的環磷醯胺合用時，可產生抑瘤的協同作用，提高抑瘤率。3.蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)對環磷醯胺造成的大鼠血小板減少和骨髓有核細胞數量減少具有保護作用，提示其與化療藥聯合應用，具有減毒作用。綜上所述，通過藥效學試驗研究結果表明蜈蚣多糖蛋白複合物(SPPC)不僅具有調節機體免疫功能和抑制腫瘤生長的作用，而且與化療藥合用時還可以減輕其毒副作用和增強其抑瘤效果。權利要求1、一種蜈蚣多糖蛋白複合物的製備方法，它包括下列步驟A.以少棘蜈蚣作為原料母體，清洗3～5次，烘乾2～4小時，烘乾溫度控制在60～80℃；B.研磨第A步驟中乾燥後的原料母體並過50～200目篩得蜈蚣粉；C.將第B步驟中的蜈蚣粉用5倍體積蒸餾水抽提1～3小時，溫度控制在80～90℃，紗布過濾得一份提取液，取殘渣再用4倍體積蒸餾水重複提取三次得三份提取液，合併四份提取液，2500r/min離心20～30分鐘，獲取上清；D.將第C步驟中的上清減壓濃縮，溫度控制在50～70℃，加入5倍體積95％乙醇，於4℃靜置過夜，傾去上清，取沉澱，2500r/min離心10分鐘，收集沉澱；E.將第D步驟中的沉澱用500ml蒸餾水溶解，計量40％飽和度所需要的固體硫酸銨量，於4℃加入，攪拌4h、10000r/min離心20分鐘後，收集上清並計量體積，重複此步驟的操作，收集60％飽和度的沉澱物；F.將第E步驟中的沉澱物用30ml蒸餾水溶解後，上DEAE-50離子交換層析柱純化，以蒸餾水平衡，用0.05～0.25mol/LNaCl溶液洗脫，收集洗脫液，用透析袋在雙蒸水中透析48小時脫鹽，再用聚乙二醇20000濃縮；G.將第F步驟中的濃縮液上SephadexG-200層析柱純化，用0.02mol/LpH為7.2的Tris-HCl溶液洗脫後，經真空冷凍乾燥，預凍溫度控制在-45～-15℃，加熱溫度控制在20～40℃，乾燥8～12小時後得蜈蚣多糖蛋白複合物。2、一種蜈蚣多糖蛋白複合物在製備治療或預防腫瘤的藥物中的應用。3、一種蜈蚣多糖蛋白複合物在製備治療或預防肝癌的藥物中的應用。4、一種蜈蚣多糖蛋白複合物在製備治療或預防肺癌的藥物中的應用。5、一種蜈蚣多糖蛋白複合物在製備治療或預防口腔表皮癌的藥物中的應用。6、一種蜈蚣多糖蛋白複合物在製備治療或預防結腸癌的藥物中的應用。7、一種蜈蚣多糖蛋白複合物在製備治療或預防乳腺癌的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種具有抗腫瘤活性的蜈蚣多糖蛋白複合物的製備方法及用途。步驟是①以少棘蜈蚣為原料母體，清洗，乾燥；②研磨乾燥後的原料母體得蜈蚣細粉；③將蜈蚣細粉經水提、過濾得殘渣再重複水提，離心後取上清；④減壓濃縮上清，經醇提後得沉澱；⑤將沉澱經硫酸銨分段鹽析後收集60％飽和度的沉澱物；⑥將沉澱物經DEAE-50纖維素離子交換層析柱、洗脫、脫鹽後濃縮；⑦將所得濃縮液經SephadexG-200柱純化，得蜈蚣多糖蛋白複合物純品。製備方法易行，操作簡便，原料來源廣泛，且應用在製備抗腫瘤藥物中能有效殺傷腫瘤細胞和提高機體免疫力，療效顯著。該多糖蛋白複合物在製備治療或預防腫瘤的藥物中的應用。文檔編號A61K35/56GK101167755SQ20071005358公開日2008年4月30日申請日期2007年10月18日優先權日2007年10月18日發明者江樂,洋劉,倩周,英敖,朱玲新,穎李,靜楊,剛陳申請人:武漢大學