生物檢測用微球狀標記物的製作方法
2023-10-09 04:16:09
專利名稱：生物檢測用微球狀標記物的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及生物檢測技術領域。
背景技術：
在生物分析檢測過程中，為了獲得檢測信號或提高檢測的靈敏度，經常需要將一種信號成分或通過反應後易產生檢測信號的成分如螢光素、酶、生物素、同位素等，和另一成分如蛋白質、多肽、核酸等通過化學偶聯劑進行偶聯，其偶聯產物就是傳統的標記物。如用辣根過氧化物酶(HRP)標記免疫球蛋白IgG，一般需經過以下五個步驟一、用氟二硝基苯(FDNB)處理HRP，封閉其α-和ε-氨基，以阻止HRP發生自我交聯；二、用過碘酸鈉氧化HRP的碳水化合物基團，使HRP成為有多個醛基的蛋白質「聚合劑」HRP-CHO；三、讓「激活」的HRP的醛基和IgG的自由氨基反應，形成Schiff礆後使兩個蛋白質分子發生交聯；四、用硼氫化鈉還原成穩定的酶結合物；五、將未發生交聯的HRP、IgG與已發生交聯的HRP、IgG偶聯物進行分離。又如傳統的螢光標記、生物素標記和同位素標記等都需要經過偶聯、透洗和分離純化等步驟。其中的透洗過程需要十幾個小時，分離鈍化步驟多需要進行層析純化，過程十分複雜。由此可見，傳統方法製備標記物有四個明顯的缺點一、製備過程繁瑣，耗費時間過長；二、標記物與被標記物通過偶聯劑直接偶聯，這樣的標記產物在實際應用中的檢測信號相對較弱；三、由於偶聯過程中反應條件的變化，和標記後形成的空間位阻，往往對被標記成分原有的性質產生一定影響，如被標記抗原或抗體的親和力、反應性降低或消失等；四、不能進行多重標記。
發明內容
本實用新型的目的是通過微球體作為載體，並在微球體表面吸附或連接標記成分和被標記成分，它能夠克服傳統技術製備標記物的缺點，它不僅使製備過程簡便省時，且標記產物檢測信號較傳統標記產物信號成倍提高，還可使多種標記成分和被標記成分連結在同一微球體上進行多重標記。
本實用新型的目的是通過以下技術方案實現的生物檢測用微球狀標記物，它有微球體，在微球體表面上附有標記成分和被標記成分的混合層。
為進一步實現本實用新型的目的，還可通過以下技術方案來完成所述的生物檢測用微球狀標記物，在微球體表面上附有搭撟層，在搭橋層表面上附有標記成分和被標記成分的混合層。
本實用新型能夠產生的有益效果以微球體作為載體，通過以下方式將至少一種標記成分和至少一種被標記成分吸附、偶聯或結合到該微球體表面上形成混合層，即得本實用新型；一、直接吸附法，依靠該微球體在一定條件下對蛋白、多肽、核酸等成分的吸附作用，將其吸附在微球體的表面。在製備微球體時，由於微球體的表面積較大，它可同時吸附多分子的標記成分和被標記成分，因此吸附效率較高。而傳統標記方法中主要依靠單分子被標記物中游離氨基的多寡與標記成分結合，故結合效率較低。二、通過偶聯劑將蛋白、多肽、核酸等成分分別結合到微球體表面，製成呈微球狀標記物，而傳統的標記方法是標記成分和被標記成分通過偶聯劑直接偶聯。三、通過免疫球蛋白、蛋白A、親和素、螯合金屬離子等作為連接橋將蛋白、多肽、核酸等成分分別結合到微球體表面，製成呈微球狀標記物，避免了傳統標記方法對被標記物本身性質或作用的影響。如傳統的標記方法用HRP對重組的C型肝炎病毒核心區抗原進行標記時，由於該區抗原富含賴氨酸和精氨酸，HRP與游離氨基結合後形成空間位阻，妨礙了重組的該區抗原與其相應抗體的結合，使標記產物無法應用。本實用新型技術利用帶有螯合金屬離子如Cu++、Ni++的微球體，與分別帶有六聚組氨酸的重組C型肝炎病毒核心區抗原和HRP進行結合(也可用抗六聚組氨酸抗體將兩者直接結合)，其結合產物不僅不影響重組的C型肝炎病毒核心區抗原與其相應抗體的結合，且該結合產物在雙抗原夾心ELISA法檢測中應用後，其靈敏度較傳統方法標記物的靈敏度成倍提高。四、將傳統方法製備好的標記物通過直接或間接的方法結合到微球體的表面，能夠大大提高標記物的使用效率及檢測信號的強度。
採用直接吸附法進行標記，可將至少一種標記成分和至少一種被標記成分按一定比例混合後(也可以是傳統方法標記好的標記物)，在一定PH條件下，與微球體混合，在一定的溫度下低溫震蕩或顛倒(使用顆粒不發生沉澱)吸附一定時間，然後離心棄上清，除去未被吸附的標記和被標記成分，用封閉液封閉後，離心沉澱，最終將沉澱物重新懸浮於含有穩定劑和防腐劑的緩衝液中低溫保存備用。也可將沉澱物冷凍乾燥後低溫保存備用。
間接標記法，可根據標記成分和被標記成分的不同，選用不同的方法。如用表面帶羧基的聚苯乙烯微球體作載體，標記成分為辣根過氧化物酶，被標記成分為免疫球蛋白IgG，可首先用碳二亞氨作為偶聯劑，將親和素或鏈黴親和素與微球體連接，再分別用生物素標記辣根過氧化物酶和IgG，然後利用親和素與生物素特異性結合的原理，將辣根過氧化物酶和IgG結合到微球體上去。也可利用抗原抗體特異性結合的原理，或金屬螯合原理進行間接連接。
圖1為本實用新型結構示意圖；圖2為本實用新型在微球體1與混合層3之間附有搭橋層2的結構示意圖。
具體實施方式
本實用新型的生物檢測用微球狀標記物，它有微球體1，在微球體1表面上附有標記成分和被標記成分的混合層3。所述的生物檢測用微球狀標記物，在微球體1表面上附有搭撟層2，在搭橋層2表面上附有標記成分和被標記成分的混合層3。
根據標記產物的用途不同，可從市場上購買所需的在顯微鏡或電子顯微鏡下觀察直徑大小不同的微球體1(直徑從5nm至50μm均可使用)，也可按常規方法自行製備，然後根據微球體1的材料和標記產物的用途選擇直接法或間接法進行標記。由於微球體1有一定的表面積，且不同材料或不同處理方法處理後的微球體1表面可帶有不同的化學基團。因此它可直接或間接結合許多蛋白、多肽、核酸等分子，也可結合標記成分與被標記成分已偶聯好的標記物，使標記產物的使用效率及最終的檢測信號大大增強，也可同時結合多種標記或被標記成分，實行多重標記。
實施例1 直接法1.取0.01％氯金酸水溶液10-100ml，加入0.1-1％的枸櫞酸三鈉1-5ml，加熱煮沸5-50分鐘，直至顏色變成酒紅色，即得金微球體1溶液。
2、取上述金微球體1溶液10ml，用0.1mol/LK2CO30.1mol/LHCL調pH至6-11。
3、取一定量的HIV抗原和鹼性磷酸酶溶液，逐滴加入調好pH的溶液中，攪拌10-30分鐘後，加入BSA至終濃度為0.1-1％，以在微球體1上形成混合層3。
4.20000rpm低溫離心1小時，棄上清。
5、沉澱重懸於含有防腐劑和穩定劑的緩衝液中，低溫保存備用。
實施例2 間接法1.在裝有攪拌器、冷凝管、加料器和氮氣導氣裝置的四口瓶中，加入去離子水50-100ml、丙酮30-90ml、苯乙烯10-30g，在一定溫度下水浴20-50min，加入過硫酸鉀0.2-0.5g，反應8-12h，所得乳液經25000rpm高速分離，沉澱用緩衝液洗滌後稀釋，即得膠乳微球體1。
2、在10ml上述膠乳微球體1中，加入5-10ml 0.05-0.1mol/L正氨基已酸和10-20ml 0.05-0.2mol/L PH7.2緩衝液。
3、取上述溶液2ml，加入鏈黴親和素(5000mg/L)0.5-2ml及碳化二亞氨5-15mg，混勻，37℃2小時，加入PH8-10的緩衝液0.1-0.5ml，30分鐘後，形成搭橋層2，10000g離心1小時，棄上清，沉澱用PH7.2的緩衝液洗兩次。最後將沉澱重懸於PH7.2的緩衝液中。
4、將辣根過氧化物酶和HIV抗原分別用生物素進行常規標記。
5、分別取生物素標記的辣根過氧化物酶和HIV抗原各0.5ml混合後，加入到結合了鏈黴親和素的聚苯乙烯膠乳微球體1中，輕輕混勻，37℃1小時，則在搭橋層2表面上形成混合層3。
6、加PH7.2的緩衝液10ml，充分混勻後，10000g-20000g離心1小時。
7、沉澱重懸，常規封閉後，離心，再將沉澱重懸於含有防腐劑和穩定劑的緩衝液中冷藏備用。
實施例3 本實用新型在HIV抗體檢測中的應用1、取預包被有HIV抗原的酶標板一塊，每孔加待檢血清50ul；陽性對照孔和陰性對照孔分別加陽性對照血清和陰性對照血清各50ul，置37℃ 1h。
2、用含有表面活性劑的磷酸鹽緩衝液洗板5次後，每孔加按一定比例稀釋的，按實施例1或實施例2製備的本實用新型標記物50ul，置37℃ 1h。
3、用含有表面活性劑的磷酸鹽緩衝液洗板3次後，每孔加顯色劑100ul，置37℃ 15min。
4、每孔加終止液50ul後，置於酶標儀上測定各孔的吸光度值，根據各孔吸光度值的大小判定結果。
權利要求1.生物檢測用微球狀標記物，其特徵在於它有微球體(1)，在微球體(1)表面上附有標記成分和被標記成分的混合層(3)。
2.根據權利要求1所述的生物檢測用微球狀標記物，其特徵在於在微球體(1)與混合層(3)之間附有搭撟層(2)。
專利摘要本實用新型提供一種生物檢測用微球狀標記物，它有微球體，在微球體表面上附有標記成分和被標記成分的混合層。通過微球體作為載體，並在微球體表面吸附或連接標記成分和被標記成分，它能夠克服傳統技術製備標記物的缺點，它不僅使製備過程簡便省時，且標記產物檢測信號較傳統標記產物信號成倍提高，還可使多種標記成分和被標記成分連結在同一微球體上進行多重標記。
文檔編號G01N33/48GK2814412SQ200520081728
公開日2006年9月6日 申請日期2005年3月31日 優先權日2005年3月31日
發明者朱有名 申請人:朱有名