一種快速的胡蘿蔔組培體系的製作方法

2023-10-09 03:45:09 1

本發明涉及胡蘿蔔快速組培體系的建立。該體系用於快速獲得胡蘿蔔愈傷及組培苗。

背景技術：

胡蘿蔔(Daucus carrot L.)，傘形科胡蘿蔔屬二年生草本植物，以肉質根作蔬菜食用，生產成本低且利於管理，是世界重要蔬菜作物之一。胡蘿蔔肉質根營養豐富，含有豐富的可溶性蛋白、水、糖，還含有大量的鉀、鈣、磷、鐵等鹽類。另外，胡蘿蔔富含維生素A前體類胡蘿蔔素和植物纖維，因而也是一種重要的營養保健品。

胡蘿蔔具有良好的組織培養和遺傳轉化基礎，是組織培養和遺傳轉化研究中的經典材料。近年來，利用遺傳工程進行胡蘿蔔改良育種工作已經取得了一定的進展，但對胡蘿蔔營養物質合成所涉及的基因功能沒有得到更好的驗證研究。組培是快速繁殖材料及轉基因驗證的基礎，如何快速、簡單、高效的建立胡蘿蔔組培體系，是胡蘿蔔基因研究的基礎。為此，我們通過對胡蘿蔔進行組培體系的優化，建立一種快速胡蘿蔔組培體系。

技術實現要素：

1、對胡蘿蔔組織培養過程所涉及的步驟進行了完善和優化。

2、在優化胡蘿蔔組培步驟的基礎上，建立了胡蘿蔔一種快速組培體系，該體系包括：胡蘿蔔種子催芽與無菌苗的獲得、愈傷誘導、愈傷分化、生根以及煉苗。

附圖說明

圖1.胡蘿蔔種子催芽及無菌苗的獲得

圖2.胡蘿蔔無菌苗下胚軸形成的愈傷組織及分化芽

圖3.胡蘿蔔芽苗的生根和煉苗

具體實施方式

1.胡蘿蔔種子預處理。胡蘿蔔種子因有絨刺，較難滅菌，而且不同的存儲時間對種子的影響也不同，需要對胡蘿蔔種子進行預處理。處理方法為：種子60～80粒放置於2mL管內，先用自來水清洗5遍種子，室溫下浸泡3h，期間偶爾攪動並除去漂浮物及發育不良的種子。移除水分。

2.胡蘿蔔種子消毒及催芽方法。預處理後的種子首先經70％酒精消毒2遍，然後用20％NaClO先衝洗1遍，再用20％NaClO消毒45min(每次均加滿2mL管消毒試劑)，期間偶爾攪動使種子充分消毒。消毒後的種子用無菌水清洗3遍，最後用移液槍或者滅菌的濾紙吸去多餘液體，平鋪在不添加任何激素的1/2MS基本培養基上面催芽，種子30～40粒每皿，培養皿直徑90mm。培養皿放置在光照培養箱中，光暗比為12h/12h，弱光下光密度為50μmol*(m2·s)-1，25℃培養7～10d(圖1)。

3.胡蘿蔔愈傷誘導。胡蘿蔔種子下胚軸剪成相同大小一致的小塊(3mm～7mm，20～25個每培養皿)，平鋪在愈傷誘導培養基上，25℃下暗培養，誘導時間為30d(圖2)。形成的愈傷組織較為鬆散，生長力旺盛，愈傷誘導率為百分之百，並在下一步愈傷分化過程中分化率最高。愈傷誘導培養基為B5基本培養基，添加激素配比分別為2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L 2，4-D和2.5mg/L 6-BA+2.5mg/L 2，4-D 2個濃度，pH為5.8，高溫滅菌後使用。

4.胡蘿蔔分化誘導。挑選愈傷鬆散、色澤淡黃、生長旺盛的組織，接種於分化培養基上(15～20個每皿)，分化時間為30d。培養在光暗比為16h/8h，光密度約為300μmol*(m2·s)-1，溫度25℃條件 下的光照培養箱中。分化培養基為不添加任何激素的B5培養基。

5.胡蘿蔔生根誘導。將愈傷組織上分化出的不定芽或者胚狀體用滅菌的鑷子夾下，平鋪在生根培養基中，使已分化的不定芽和胚狀體生根再生(圖3)。培養條件與分化誘導環境條件相同。生根培養基為不添加任何激素的B5培養基。

6.煉苗：植株長出6～7片葉並形成根系時，進行煉苗(圖3)。煉苗條件與分化誘導環境條件相同。將植株轉入已裝有生根培養基的玻璃試管中，使芽苗粗壯。2周左右觀察植株生長狀況，生長良好的植株開啟瓶蓋，自來水輕輕衝洗除去根系上的培養基，栽種在裝有1∶1蛭石和泥炭土的盆缽中，用塑料薄膜覆蓋住盆口。一周後慢慢掀開塑料薄膜適當通風煉苗，待再生苗適應外部環境條件後，既可在培養室中進行常規栽培管理。

結果1：胡蘿蔔採用20％NaClO消毒45min可以徹底滅菌，同時出芽率較高，幼苗生長整齊、旺盛。

結果2：愈傷誘導與分化過程中，B5培養基添加2.0mg/L 2，4-D和2.0mg/L 6-BA激素下愈傷組織分化率為82％。

結果3：將愈傷組織的分化芽切下直接轉移到B5培養基上，全部分化芽均能生根並繼續正常生長。再生苗煉苗過程中，在玻璃試管中的煉苗2周左右較為合適。