治癒傷口的組合物及其應用的製作方法
2023-10-08 20:37:29
專利名稱：治癒傷口的組合物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於加速傷口癒合的方法和組合物。
背景技術：
血管生成與血栓調節蛋白雖然已知現有技術中有幾種分子可用做治療重要血管異常凝血性疾病和紊亂的治療劑，但仍需要提供用於治療這些疾病和血管生成活性異常症狀的疾病和功能紊亂的組成物及方法。這樣的疾病包括例如低血壓、高血壓和動脈硬化等心血管病；中風、心臟病發作及血管成形術後的血栓形成；血管生成性疾病；肺組織纖維化和哮喘等呼吸道病症；腫瘤細胞侵入、血管生成和轉移等腫瘤相關疾病；傷口癒合和凝血障礙以及子宮過早收縮和陽萎等生殖功能障礙。
目前已經鑑定出許多用於誘導或促進組織中血管生成的生物分子。其中最重要的是血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生的生長因子(PDGFs)和轉化生長因子(TGFs)。凝血調節蛋白的缺乏會使小鼠胚胎在功能性心血管系統發育前死亡(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1995；92850-854.；and J P Cooke et al，Circulation 105(2002)2133)。相關領域的研究顯示，目前可將促進血管生成的方法概括為三大類(i)使用於人工合成和自然聚合的支架輸送血管生長因子；(ii)輸送含有編碼血管生成蛋白的DNA的質粒；以及(iii)輸送血管生成因子並結合內皮細胞移植。
在相關領域中，另一篇報導[Shi CS et al.，Evidence of HumanThrombomodulin Domain as a Novel Angiogenic Factor，Circulation.2005Apr.5；111(13)1627-36]提出用重組人血栓調節蛋白分子代替生長因子加載到傳輸系統中。它提出這些加載的人類重組血栓調節蛋白能夠在一些生理條件下釋放，從而促進局部定位的快速血管生成。
血栓調節蛋白是一種作為抗凝血劑的內皮細胞膜糖蛋白。重組血栓調節蛋白，TMD2(含有六個表皮生長因子類結構)和TMD23(含TMD2和一個絲氨酸-蘇氨酸富集區域)呈現有細胞有絲分裂活性。
先前使用體內和體外模型所作的研究(Shi CS et al.，Evidence ofHuman Thrombomodulin Domain as a Novel Angiogenic Factor.Circulation.2005 Apr 5；111(13)1627-36)已經揭示了重組結構域在的血管生成效果。已表明，在培養的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)中，TMD23比TMD2有更高的刺激DNA合成活性。另外，在HUVECs中，TMD23通過細胞外信號調節激酶1/2和p38絲裂原活化的蛋白激酶以及磷脂醯肌醇3-激酶/Akt/細胞內皮型一氧化氮合酶的磷酸化途徑刺激細胞趨化和毛細血管形成。TMD23也促進基質金屬蛋白酶家族以及纖溶酶原活化因子的的內皮細胞表達，其介導血管生成期間導致內皮細胞侵潤和遷移的細胞外的蛋白質水解。此外，大鼠角膜中含TMD23的植入物能誘導新的血管從外圍組織生長。小鼠血管生成試驗顯示，在裸鼠體內，TMD23不僅誘導Matrigel和肝素共注射的新血管生成作用，而且可增強含Matrigel的黑色素瘤A2058細胞的血管生成。總之，重組血栓調節蛋白結構域TMD23能增強體內和體外的血管生成反應。
傷口癒合傷口癒合過程分三個階段，即為發炎期、增生期和成熟期。
發炎期的特徵是止血和發炎。在傷口形成時，膠原蛋白激活凝血級聯反應(內部和外部途徑)，開始發炎期。組織損傷發生後，傷口形成所損傷的細胞膜釋放凝血惡烷A2和前列腺素2-α(強血管收縮因子)。這一初始的反應有助於限制出血。短時期後，毛細血管舒張使得局部的組胺釋放，發性細胞即可遷移至創傷部位。
血小板作為第一反應細胞，可釋放包括表皮生長因子(EGF)、纖連蛋白、纖維蛋白原、組胺、血小板衍生的生長因子(PDGF)、血清素和病毒胞吞因子(von Willebrand factor)在內的多種趨化因子。這些因子能夠藉助血液凝塊的形成穩定傷口、控制出血及限制損傷的擴展。血小板脫粒也能激活補體級聯反應(特別是通過嗜中性粒細胞趨化劑C5a)。
發炎期延續，更多的免疫應答細胞遷移到傷口處。遷移到傷口處的第二應答細胞，即嗜中性粒細胞，負責清除細胞碎片、補體介導細菌調理作用以及通過氧化損傷機制(即形成超氧化物和過氧化氫)殺滅細菌。嗜中性粒細胞殺死細菌並清除異物對傷口的汙染。
接下來出現在傷口處的細胞為白細胞和巨噬細胞(單核細胞)。巨噬細胞是傷口癒合所必須的。巨噬細胞分泌多種酶和細胞因子。其中包括清除傷口的膠原酶、刺激纖維母細胞(產生膠原蛋白)並促進血管生成的白介素和腫瘤壞死因子(TNF)，以及刺激角化細胞的轉化生長因子(TGF)。該步驟標誌著傷口癒合進入了組織重建過程，即增生期。
傷口癒合的第二階段是增生期。上皮形成、血管生成、肉芽組織形成和膠原蛋白沉積是傷口癒合合成代謝的主要步驟。上皮形成發生在傷口修復的早期。如果基底膜仍然完整，上皮細胞即以正常方式向上遷移。這相當於一級皮膚燒傷。在皮膚下的上皮祖細胞保持完整的情況下，正常的表皮層將在2-3天後恢復。如果基底膜已經遭到破壞，則類似於二度或三度燒傷，傷口將重新從外周正常細胞和完好的皮膚附屬物(例如發囊和汗腺)形成上皮。
TNF-α激活的血管生成是以內皮細胞遷移和毛細血管形成為特點。新的毛細血管輸送營養物質到傷口處幫助以維持肉芽組織床。遷移到傷口的毛細管對於正確的傷口癒合是重要的。肉芽形成期和組織沉澱需要通過毛細血管供應營養，如果得不到供應，會導致傷口長期不能癒合。修飾血管生成的機制正在研究中並且有很大的潛力來改善癒合過程。
增生期的最後部分是肉芽組織形成。成纖維細胞分化並產生基底物質進而形成膠原蛋白。基底物質沉積到傷口；然後膠原蛋白沉積，傷口即開始最後的修復階段。許多細胞因子參與傷口修復的增生期。精確的控制機制和步驟還沒有被闡明。這些細胞因子包括PDGF、胰島素樣生長因子(IGF)和EGF。所有這些對於膠原蛋白形成都是必須的。
傷口癒合最後的階段是成熟期。傷口收縮，最終產生少量明顯的疤痕組織。整個過程是動態的連續的，各階段交迭在一起並連續重建整個過程。一年後傷口達到最大強度，其抗張強度達到正常皮膚的30％。膠原蛋白沉積可持續較長時期，但淨增長在21天後達到平臺。
目前，細胞因子在臨床實踐中的作用還是有限的。目前僅有的商品是在隨機雙盲實驗中被證實有效的PDGF，即重組人PDGF-BB。多項研究已經證實，重組人PDGF-BB能縮短傷口癒合時間並提高III和IV期潰瘍的傷口完全癒合率。許多目前正在進行體外研究的其它細胞因子包括TGF-β、EGF和IGF-1。
傷口癒合過程應包括多種細胞和細胞因子的複雜協同作用。最近幾年，已經鑑定了參予此過程的多種化學介質。尚未完全弄清連續步驟和特殊過程。當檢查傷口癒合過程時，應鑑別某些主要步驟並知道重要介質。
燒傷和傷口癒合燒傷是由於暴露於熱、電、輻射(例如太陽光照射和雷射外科)或者腐蝕性化學品下所造成的損傷。
一般認為有三種程度的燒傷。在一度燒傷中，稱為表皮的皮膚外層變紅，對觸摸敏感，並常常見有腫脹。一般無需治療，塗抹藥膏即可減輕疼痛。
二度燒傷以不定量的表皮毀損和水泡形成為特徵，並可能有神經末梢暴露。更嚴重的情況應該就醫並小心護理以避免感染。局部的治療包括應用化學藥品例如硝酸銀產生軟痂，以減少感染機會並減輕疼痛。三度燒傷包括全層皮膚和下面結締組織的損毀。在更嚴重的情況下，下面的骨頭也被燒焦。所涉及的表面面積比燒傷的深度更顯著。必須預防或消除休克，可能需要輸血代替流失的體液。必須防止各種細菌的侵入或者用抗生素或其它藥物進行將其消除。可以利用嗎啡減輕疼痛。長期的治療可以包括移植自然或人造皮膚。
糖尿病與傷口癒合糖尿病是一類以高血糖(葡萄糖)為特徵的新陳代謝疾病，是由於胰島素分泌或功能欠缺或者兼而有之引起的。糖尿病通常是指以「甜尿」為特徵的糖尿病。高水平的血液葡萄糖(高血糖症)導致葡萄糖溢入尿液中，因此有糖尿這個術語。通常，血液葡萄糖水平是被胰島素這種胰島產生的激素嚴格控制的。胰島素降低血液葡萄糖水平。當血液葡萄糖升高時(例如飯後)，胰腺分泌胰島素保持葡萄糖水平正常。糖尿病病人由於胰島素缺乏或不足而引起高血糖症。糖尿病是一種慢性病症，意即可能會持續終生。
糖尿病可能會引起幾種併發症，包括心血管疾病、失明、腎衰竭和足部潰瘍。
糖尿病人由於神經損傷(糖尿病神經痛)和腿和腳部血流速度低所引起的麻木而存在足部受損傷的危險。更嚴重的損傷是足部潰瘍。糖尿病足部潰瘍很容易被感染，以致有時不能被治癒。糖尿病人不能被治癒的足部潰瘍常常要截肢。
FDA已經批准了一種用來治療糖尿病足部潰瘍的凝膠產品(Becaplermin或Regranex Gel)。該產品含有遺傳工程得到的血小板衍生的生長因子——一種生物體產生的促進新組織生長的蛋白質。該產品的臨床研究表明，當使用Becaplermin治療達20周後，潰瘍可能完全閉合。
另一種有利於糖尿病人慢性潰瘍傷口癒合的產品是商品名為DERMAGRAFT的皮膚替代物。該產品從成纖維細胞中製得，並被置於可溶解的網狀材料上。當將這種材料置於潰瘍上時，被逐漸地吸收，人細胞生長並取代潰瘍上受損的組織。
發明內容
發明概要本發明涉及一種包含有血栓調節蛋白的EGF樣區域之胺基酸序列的多肽或其保守性變異體用於治癒傷口的用途。本發明還涉及用於加速傷口癒合的組合物，該組合物中包含有血栓調節蛋白的EGF樣區域之胺基酸序列的多肽或其中保守性變異體。
發明詳述血栓調節蛋白是一種抗凝血的內皮細胞膜糖蛋白。含有六個表皮生長因子樣結構和絲氨酸-蘇氨酸富集區域的重組血栓調節蛋白結構域呈現又有促進有絲分裂活性。
以前的報導(申請號US11/149,378)證明，TMD23能夠誘導內皮細胞(HUVEC)遷移和增殖。
本發明揭示，TMD23能有效的增強角化細胞(HaCaT)遷移，而主要表皮細胞和抗TMD23抗體則能特異性地抑制角化細胞遷移。因此，本發明第一次證明，TMD23能夠通過刺激角化細胞遷移促進傷口癒合過程。
此外，動物實驗表明，TMD23能增強表皮遷移並擴展到傷口區域，因而加速了傷口閉合。另一方面，傷口開口的水分蒸發速率也會有效的減少。
總之，TM能有效的提高傷口癒合的速率。
本發明涉及一種包含有血栓調節蛋白的EGF樣區域之胺基酸序列的多肽或其保守性變異體用於治癒傷口的用途。在優選實施例中，上述多肽還包括可連接的含有血栓調節蛋白之絲氨酸-蘇氨酸富集區的胺基酸序列或保守變異體的多肽。
本發明的用途能用於加速傷口治癒，其中所說的傷口選自切割傷、裂傷、擦傷、刺傷、水泡、皮膚撕裂、供體和移植物部位、痤瘡、挫傷、血腫、壓傷以及表皮平整或雷射修復引起的損傷。
本發明的用途可用於糖尿病病人。在一優選實施方案中，病人患有糖尿病潰瘍。
本發明的用途也可用於由火、熱、輻射、電或皮膚手術造成的創傷。
本用途也能用於重建外科。
在一優選實施方案中，所說的多肽或其保守性變異體應用於一組選自凝膠、膏狀物、洗液、噴霧劑、懸浮液、溶液、分散膏、水凝膠和軟膏的皮膚附著產品。在一更優選實施方案中，通過塗敷、注射或電穿孔將這些皮膚附著產品施於需要治療的病人。
本發明還涉及一種攜帶多肽編碼DNA的質粒用於治癒傷口的用途，所說的多肽含有血栓調節蛋白EGF樣區域的胺基酸序列或其保守可變體。在一優選實施方案中，其系透過給予需要治療的病人有效量的攜帶多肽編碼DNA的質粒，或藉助質粒疫苗給藥。在一更優選的實施方案中，通過靜脈內、皮下、腹腔內或肌肉內途徑給藥。
本發明還涉及一種用於加速傷口治癒的組合物，包括含有血栓調節蛋白EGF樣區域的胺基酸序列或其保守可變體的多肽。在優選實施方案中，上述多肽還包括可連接的含有血栓調節蛋白之絲氨酸-蘇氨酸富集區域的胺基酸序列的多肽或其保守變異體。
本發明的組合物可應用於加速傷口治合，其中所說的傷口選自切割傷、裂傷、擦傷、刺傷、水泡、皮膚撕裂、供體和移植物部位、痤瘡、挫傷、血腫、壓傷以及表皮平整或雷射修復引起的損傷。
本發明的組合物能用於糖尿病病人。在一優選實施方案中，病人患有糖尿病潰瘍。
本發明的組合物也能用於由火、熱、輻射、電或皮膚外科手術導致的傷口。
在一優選實施方案中，該組合物能用於重建外科。
在一優選實施方案中，本方法可應用於一組選自凝膠、膏狀物、洗液、噴霧劑、懸浮液、溶液、分散膏、水凝膠和軟膏的皮膚附著產品。在一更優選實施方案中，通過塗敷、注射或電穿孔將這些皮膚附著產品施於需要治療的病人。
術語解釋下列定義是出於說明的而不是限制目的，是為了幫助理解繼後的討論。
依照本發明，所屬技術領域的技術人員可以實施常規的分子生物學、微生物學和DNA重組技術。這些技術在文獻中已有了充分的闡述。
「傷口」可以是開放傷口和閉合傷口。開放傷口可以分為許多類型，包括割傷(由乾淨的鋒利的物體如刀或剃刀引起)、裂口(由壓力或撕扯引起的粗糙不規則的傷口)、擦傷(通常是由於滑過粗糙表面所引起的很表面的傷，其最上層的皮膚被擦掉)和刺傷(被一個物體例如釘或針刺破皮膚引起)。閉合傷口的分類少得多，但是同開放傷口一樣危險。它們是挫傷或打傷(由硬力引起的皮膚下組織的傷害)、血腫(由血管受損使得血液在皮膚下聚集引起)以及壓傷(由於長期施加的很大或極大的外力引起)。
「傷口癒合」過程分三個階段。即為發炎期、增生期和成熟期。
發炎期的特徵是止血和發炎。在傷口形成時，暴露的膠原蛋白激活血液凝結級聯(內部和外部途徑)，開始發炎期。組織損傷發生後，形成傷口所損傷的細胞膜釋放出有效的血管收縮劑凝血惡烷A2和前列腺素2-α。此初始反應有助於限制出血。經過一個較短的時期後，毛細血管舒張繼而導致局部組織胺釋放，使炎性細胞能夠遷移到傷口部位。炎性期延續，更多的免疫應答細胞遷移到傷口處。遷移到傷口處的第二應答細胞，即嗜中性粒細胞，負責清除細胞碎片、引發細菌的補償介導的調理作用並通過氧化機制(即形成超氧化物和過氧化氫)破壞細菌。嗜中性粒細胞殺死細菌並清除異物對傷口的汙染。
傷口癒合的第二階段是增生期。上皮形成、血管生成、肉芽組織形成和膠原蛋白沉積是傷口癒合合成代謝的主要步驟。上皮形成在傷口修復中先發生。如果基底膜仍然完整，上皮細胞以常規模式中向上遷移。這相當於一度皮膚燒傷。傷口下的上皮祖細胞仍然完整，正常的表皮層將在2-3天後恢復。如果基底膜已經遭到破壞，則類似於二或三度燒傷，那麼傷口便由外周正常細胞及完好的皮膚附屬物(例如發囊和汗腺)重新形成表皮。增生期的最後部分是肉芽組織生成。成纖維細胞分化並產生基底物質和膠原蛋白。基底物質沉積到傷口；隨之，傷口經受最後的修復時期——膠原蛋白沉積。許多細胞因子參與傷口修復的增生期。精確的控制機制和步驟還沒有被闡明。這些細胞因子包括PDGF、胰島素樣生長因子(IGF)和EGF。所有這些生長因子對膠原蛋白形成都是必須的。
傷口癒合最後的階段是成熟期。傷口收縮，最終產生較小量顯在的疤痕組織。整個過程是動態的連續的，各階段交迭在一起並連續重建整個過程。一年後，傷口達到最大強度，抗張強度可達正常皮膚的30％。膠原蛋白沉積可持續一個延長階段，但膠原蛋白沉積的增加在21天後達到平臺。
一般認為，「血管生成」在很大程度上受到生長因子和其它配體的調節。血管生成以及協同的組織發育和再生依靠內皮細胞增殖、遷移、分化和存活等被嚴格控制的過程。在這些過程中，刺激因子和抑制因子配體似乎直接或間接地與細胞受體相互作用。隨著基底膜被內皮細胞和自細胞釋放的酶所破壞，血管生成開始。然後，血管內腔呈線形排列的內皮細胞突出於基底膜。血管生成刺激因子誘導內皮細胞遷移通過受損的基底膜遷移。然後，這些遷移細胞萌生出親代血管，其中內皮細胞經歷有絲分裂和增殖。內皮細胞芽互相融合在一起形成毛細血管環，從而產生新的血管。
本文中提到的「燒傷」是指由於暴露於熱、電、輻射(比如太陽光輻射和雷射外科)或者腐蝕性化學品所造成的損傷。
糖尿病是一類以高血糖(葡萄糖)為特徵的新陳代謝疾病，是由於胰島素分泌或功能欠缺或者兼而有之引起的。糖尿病通常是指以「甜尿」為特徵的糖尿病。高水平的血液葡萄糖(高血糖症)導致葡萄糖溢入尿液中，因此有糖尿這個術語。通常，血液葡萄糖水平是被胰島素這種胰島產生的激素嚴格控制的。胰島素降低血液葡萄糖水平。當血液葡萄糖升高時(例如飯後)，胰腺分泌胰島素保持葡萄糖水平正常。糖尿病病人由於胰島素缺乏或不足而引起高血糖症。糖尿病是一種慢性病症，意即可能會持續終生。
糖尿病有時會引起末梢神經病變，尤其是當伴隨血管受損時，可導致足部潰瘍，並可能發展為壞死、感染和壞疽，有時需要截肢。
「核酸」或「核苷酸序列」是指呈單鏈或雙鏈螺旋狀的磷酸酯聚合形式的核糖核苷(腺嘌呤核苷、鳥嘌呤核苷、尿嘧啶核苷或胞嘧啶核苷，「RNA分子」)或脫氧核糖核苷(脫氧腺嘌呤核苷、脫氧鳥嘌呤核苷、脫氧尿嘧啶核苷或脫氧胞嘧啶核苷，「DNA分子」)。雙鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋都是可能的。術語核酸，尤其DNA或RNA分子，僅指分子的一級和二級結構，而不限制於任何特殊的三級或四級結構。因此，該術語包含發現的雙鏈DNA，尤其是，線性或環形DNA分子(例如限制性片段)、質粒以及染色體。在特殊的雙鏈DNA分子的結構討論中，其序列可以依照常規習慣僅給出非轉錄鏈DNA的5′到3′方向的序列(即該鏈具有與mRNA同源的序列)。「重組DNA」是經過生物學處理的DNA分子。
當針對DNA片段時，術語「可連接的」表示該片段被操作以行使相應的功能，例如通過結合到啟動子片段的RNA聚合酶發生轉錄步驟，轉錄沿編碼片段繼續進行直到聚合酶遇到轉錄終止子片段而停止。
本文使用的術語「核酸片段」是指cDNA核酸分子、基因組DNA、合成的DNA或初始RNA。術語「片段」是指可基於編碼有用多肽的天然核苷酸序列的，完整或部分的單鏈或雙鏈核苷酸片段。該片段可以隨意的包含其它核苷酸小片段。
編碼本發明多肽的核苷酸片段可以是基因組或cDNA來源的，例如可以按標準技術製備基因組或cDNA文庫，並利用合成的寡核苷酸探針進行雜交以篩選編碼整個或部分的多肽的DNA序列。
可以使用本領域已知的方法檢測多肽。這些檢測方法可包括使用特異性抗體，或根據酶產物的生成，或者根據酶底物的消失。例如，可使用酶學方法檢測多肽的活性。
本發明的多肽可以通過所屬技術領域的多種公知方法進行純化，包括但不限定為層析法(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻層析)，電泳法(例如預備性等電聚焦(IEF))，差異溶解(硫酸銨沉澱)或者萃取法。
本文使用的術語「質粒疫苗」被定義為含有用於產生疫苗抗原的基因，以及含有能摻入構建物中允許在適當的寄主系統內生產的基因的純化的質粒DNA製劑。
圖1顯示TMD23對HaCaT表皮細胞遷移的作用。
圖2顯示用DMAp或CGS-21680(溶液態)局部治療的CD-1小鼠傷口癒合的時間過程。每天一次局部應用實驗物質和載體，連用10天。同時局部使用CGS-21680(10μg/小鼠)作為陰性對照。於第3、5、7、9和11天，檢測傷口癒合率(％)和傷口半癒合時間(CT50)並按照Dunnett’s測驗的一元方差分析法比較處理組和其相應載體組的檢測結果。
圖3顯示用DMAc或Regranex(凝膠)局部治療的CD-1小鼠傷口癒合的時間過程。每天一次局部應用實驗物質，連用10天。於第3、5、7、9和11天，檢測傷口癒合率(％)和傷口半癒合時間(CT50)並按照Dunnett’s測驗的一元方差分析法比較處理組和其相應載體組的檢測結果。
圖4顯示用DMAp或CGS-21680(溶液態)局部治療的糖尿病小鼠(Lepr db)的傷口癒合的時間過程。每天一次局部應用實驗物質和載體，連用14天。同時局部使用CGS-21680(10μg/小鼠)作為陰性對照。於第3、5、7、9和11天，檢測傷口癒合率(％)和傷口半癒合時間(CT50)並按照Dunnett’s測驗的一元方差分析法比較處理組和其相應載體組的檢測結果。
圖5顯示用DMAc或Regranex(凝膠形式)局部治療的糖尿病小鼠(Lepr db)的傷口癒合的時間過程。每天一次局部應用實驗物質和載體，連用14天。於第3、5、7、9和11天，檢測傷口癒合率(％)和傷口半癒合時間(CT50)並按照Dunnett’s測驗的一元方差分析法比較處理組和其相應載體組的檢測結果。
圖6顯示TMD23縮減傷口開口處的水分蒸發速率。
具體實施例方式
下面的例子不是進行限制，僅是本發明的各個方面和特徵的代表。
實施例1TMD23對HaCaT表皮細胞遷移的影響利用具有6.5毫米直徑聚碳酸酯濾膜(8-μm孔徑)的Boyden小室檢測TMD23對HaCaT細胞遷移的影響。低層濾膜表面上塗覆IV型膠原蛋白。在下孔內的DMEM中加入TMD23(100ng/ml)或TMD23(100ng/ml)和抗TM抗體(1μg/ml)。各上孔中加入含有1×104個細胞的細胞懸浮液(50μL)。八小時後，用甲醇固定並用10％GIEMSA染色，在顯微鏡下計數通過膜遷移的細胞數目。如圖1所示，TMD23顯著的誘導了HaCaT細胞的趨化遷移。
實施例2材料DMAp是溶於20μl 0.5％CMC/PBS溶液中的100μg重組TMD23純化蛋白(SEQ ID NO.1)。使用0.5％CMC(羧甲纖維素)/PBS(磷酸鹽緩衝液)(pH7.4)作為DMAp和CGS-21680溶液的載體。鹽酸CGS-21680(2-對-[2-羧甲基]苯氨基-5′-N-ethylcarboxamidoadenosine)是一種G蛋白激活劑，購自Sigma-Aldrich。
DMAc凝膠是溶於20mg基本凝膠中的100μg重組TMD23純化蛋白(SEQ ID NO.1)。上述基本凝膠作為DMAc凝膠和Regranex凝膠的陰性對照物。上述基本凝膠由羧甲纖維素鈉、氯化鈉、三水醋酸鈉、冰醋酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、間甲酚1-賴氨酸鹽酸、苯甲醇、甲基氯異噻唑啉(methylchloroisothiazoline)、甲基異噻唑啉(methylisothiazolinine)、丙烯醯二甲基牛磺酸銨/VP共聚物(ammoniumacryloyldimethyltaurate/VP copolymer)和注射用水組成。Regranex凝膠購自JohnsonJohnson。
實施例中所用到的化學藥品有10％中性甲醛緩衝溶液(Shiyak Kogyo，日本)、羧甲纖維素(Sigma-Aldrich，美國)、鹽酸GCS-21680(Tocris，美國)、環己烯巴比妥(Sigma-Aldrich，美國)、磷酸鹽緩衝液(PBS pH7.4，Sigma-Aldrich，美國)和氯化鈉(Wako，日本)。
實施例中使用的設備有動物籠(Allentown，美國)、Image-ProPlus圖像分析儀(Media Cybernetics，Version 4.5.29)、移液器(Gilson，德國)和12毫米內徑的利刃打孔器(Sinter，臺灣)。
實施例3動物體重24±2g的CD-1(Crl.)雄性小鼠由臺灣BioLasco提供(經CharlesRiver實驗室技術許可)。為10隻小鼠分割為29×18×13cm的空間。所有小鼠是飼養在MDS醫藥服務公司(臺灣實驗室優先使用)至少一周，保持12小時光暗周期並控制溫(22℃-24℃)溼(50％-60％)環境。可以自由使用標準實驗室鼠食[MF-18(Oriental Yeast有限公司，日本)]和RO水。工作包括營建住處、實驗以及動物處理均依照《照料和使用實驗室動物指南》(國家科學院出版社，華盛頓D.C.，1996)進行。
使用動物繁殖研究所(IAR，日本)提供的體重50±5g(9周齡)非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)雄性小鼠(C57BLKS/J-m+/+Lepr db)。這些小鼠均表現有高胰島素血症、高血糖症和胰島萎縮。這些小鼠被關單個的通風籠架內(IVC架，36個小隔間)，整個實驗都在無特異病原體條件下進行。各APEC籠(26.7cm(長)×20.7cm(寬)×14.0cm(高))經高壓滅菌，容納7隻小鼠，這些動物處在保持12小時光暗周期並控制溫(22℃-24℃)溼(50％-60％)的衛生環境中。這些動物可以自由獲取滅菌的實驗室食物和滅菌水。營建住所、實驗以及處理動物等工作，均依《照料和使用實驗室動物指南》(國家科學院出版社，華盛頓D.C.，1996)常規進行。
實施例4TMD23加速小鼠傷口癒合使用5隻為一組的多組體重為24±2g的CD-1(Crl.)雄性小鼠。實驗期間，每個動物單獨的放入獨立的籠中。在環己烯巴比妥(90mg/kg，IP)麻醉下，在每個小鼠的肩部和背部區域剃毛。用利刃打孔器除去包括肌膜(panniculus carnosus)和粘附組織的皮膚。皮膚損傷後，立即局部(TOP)使用DMAc、Regranex和基本凝膠20mg/小鼠，DMAp100μg/小鼠，以及載體(0.5％CMC/PBS pH7.4，20μl/小鼠)和CGS-21680 10μg/小鼠作為陽性對照，每天一次連續10天。於第1、3、5、7、9和11天，在乾淨的塑料紙片上示蹤傷口面積，使用Image-ProPlus圖像分析儀(Media Cybernetics，Version 4.5.29)進行傷口面積測量。計算傷口癒合百分率，利用Graph-Prism(Graph軟體，美國)以線性回歸法分析傷口半癒合時間(CT50)。按照Dunnett’s試驗的一元方差分析法比較各個時間點上治療組與其相應對照組的差異性。當P＜0.05時認為統計學上差別性顯著。與相應的載體對照值相比，作為陽性標準品的CGS-21680(10μg/小鼠×10)顯示提高傷口癒合(第3，5，7，9和11天)率(P＜0.05)，並使CT50下降。結果總結於圖2(溶液階段)、圖3(凝膠階段)和下面表1中。
表1試驗物質對CD-1小鼠的傷口癒合和半癒合時間的影響
測定傷口癒合百分率和傷口半癒合時間(CT50)，按照Dunnett’s測驗的一元方差分析法比較處理的每個時點上的處理組與其相應載體組的差異。*P＜0.05，對載體對照組。
結論整個研究中可見DMAp(100μg/小鼠)對傷口癒合具有最持久的作用，同時使CT50顯著減少；DMAc和Regranex趨向於促進傷口癒合，但是對CT50沒有顯著影響；基本凝膠則對小鼠的皮膚傷口模型沒有任何作用。
實施例5TMD23加速糖尿病小鼠的傷口癒合使用多組5隻為一組的體重為50±5g的C57BLKS/J-m+/+Lepr db雄性小鼠。實驗期間，每個動物單獨的放入獨立的籠中(IVC架，36個小隔間)。在環己烯巴比妥(90mg/kg，IP)麻醉下，在每隻小鼠的肩部和背部區域剃毛。使用利刃打孔器(內徑12mm)除去包括肌膜(panniculus carnosus)和粘附組織的皮膚。於第1、3、5、7、9和11天，在乾淨的塑料紙片上示蹤傷口面積，使用Image-ProPlus圖像分析儀(Media Cybernetics，Version4.5.29)進行傷口面積測量。創傷後第1天開始立即局部使用溶液形式或凝膠形式的實驗物質、陽性對照物CGS-21680或Regranex，每天一次連續14天。實驗物質DMAp(100μg/小鼠)，介質(0.5％CMC/PBS pH7.4)和CGS-21680(10μg/小鼠)以溶液形式和20μl/小鼠的劑量使用。DMAc、Regranex和基本凝膠(為介質對照組)以凝膠形式以20mg/小鼠的量使用。利用Graph-Prism(Graph軟體，美國)，以線性回歸法分析傷口半癒合時間(CT50)。遵循Dunnett’s測驗的一元方差分析法比較每個處理時間點上處理組與相應對照組的差異性。當P＜0.05時，即認為統計學上差異性顯著。與相應的載體對照值相比，作為陽性對照的物質CGS-21680(10μg/小鼠×14)和Regranex(20μg/小鼠×14)可使傷口癒合百分率(第3、5、7、9、11、13和15天)顯著升高(P＜0.05)，並使CT50顯著減少。結果總結於圖4(溶液階段)、圖5(凝膠階段)和下面表2中。
表2試驗物質對Lepr db小鼠的傷口癒合和半癒合時間的影響
測定傷口癒合百分率和傷口半癒合時間(CT50)，按照Dunnett’s測驗的一元方差分析法比較處理的每個時點上的處理組與其相應載體組的差異。*P＜0.05，對載體對照組。
結論在整個研究中，可見DMAp(100μg/小鼠)、DMAC和Regranex(各20mg/小鼠)以及CGS-21680(10μg/小鼠)對傷口癒合有持久的促進作用並使CT50顯著減少；在早期階段，與0.5％CMC/PBS(pH7.4)載體相比，基本凝膠載體似乎可使傷口癒合稍有延遲。
實施例6TMD23縮減傷口開口處的水分蒸發速率為了檢測上皮形成速率，使用TM210 Tewameter(COURAGE+KHAZAKA電子公司，德國科隆)測定傷口區域的水分蒸發速率。較低的水分蒸發速率代表較高的上皮生成或角質化水平。結果(圖6)表明，TMD23可有效地增加傷口的上皮形成速率。
所屬技術領域技術人員可以容易的認識到，本發明很適於完成所提到的目的，並獲得相應的結果和益處。細胞系、動物以及其生產方法只是代表最佳實施例，是可以仿效的，並不是對本發明範圍的限制。其改進和其它用途是所屬領域技術人員能夠想到的。這些改進包含於本發明的精神內，受到權利要求範圍的限定。
顯而易見，所屬領域技術人員在不脫離本發明的精神和範圍的前提下，可以對本文公開的內容進行更動和改進。
本說明書中提及的所有專利和出版物對所屬領域普通技術人員是指示性的。如同個別出版物被特殊和單獨地引用作為參考文獻一樣，所有的專利和出版物均在本文中被引用作為參考文獻。
可在缺少一種或多種成分、沒有一種或多種限制的情況下實踐本文舉例描述的發明，這裡不作特定地公開。所用到的術語和符號是說明性的而不是限定性的，而且在使用這些術語和符號時並不拒絕接受與所述特徵等同或部分等同的用語。但是應該認識到，在本發明的權利要求的範圍內作各種改進都是可能的。因此，應該理解的是，儘管本發明已經通過優選實施例和可選特徵進行特定的公開，但是所屬領域技術人員可以對其中披露的概念進行改進和更動，並且這樣的改進和更動將落入權利要求所限定的本發明範圍之內。
其它實施方案在權利要求中給出。
權利要求
1.一種包含有血栓調節蛋白的EGF樣區域之胺基酸序列的多肽或其保守性變異體用於治癒傷口的用途。
2.根據權利要求1所述的用途，其中多肽還包括可連接的含有血栓調節蛋白之絲氨酸-蘇氨酸富集區域的胺基酸序列的多肽或其保守性變異體。
3.根據權利要求1所述的用途，其中傷口選自切割傷、裂傷、擦傷、刺傷、水泡、皮膚撕裂、供體和移植物部位、痤瘡、挫傷、血腫、壓傷以及表皮平整或雷射修復引起的損傷。
4.根據權利要求1所述的用途，其用於糖尿病病人。
5.根據權利要求4所述的用途，其中病人患有糖尿病潰瘍。
6.根據權利要求1所述的用途，其中傷口是由火、熱、輻射、電或皮膚外科手術導致的燒傷。
7.根據權利要求1所述的用途，其適用於重建外科。
8.根據權利要求1所述的用途，其中多肽或其保守性變異體應用於一組選自凝膠、膏狀物、洗液、噴霧劑、懸浮液、溶液、分散膏、水凝膠和軟膏的皮膚附著產品。
9.根據權利要求8所述的用途，其中皮膚附著產品是通過塗敷、注射或電穿孔施用於需要治療的病人的。
10.一種攜帶多肽編碼DNA的質粒用於治癒傷口的用途，所說的多肽含有血栓調節蛋白EGF樣區域的胺基酸序列或其保守可變體。
11.根據權利要求10所述的用途，其為通過給予需要治療的病人有效量的攜帶多肽編碼DNA的質粒。
12.根據權利要求11所述的用途，其中給藥是藉助質粒疫苗。
13.根據權利要求11所述的用途，其中給藥是通過靜脈內、皮下、腹腔內或肌肉內途徑。
14.一種治癒傷口的組合物，其包括含有血栓調節蛋白的EGF樣區域之胺基酸序列的多肽或其保守性變異體。
15.根據權利要求14所述的組合物，其中多肽還包括可連接的含有血栓調節蛋白之絲氨酸-蘇氨酸富集區域的胺基酸序列的多肽或其保守性變異體。
16.根據權利要求14所述的組合物，其中傷口選自切割傷、裂傷、擦傷、刺傷、水泡、皮膚撕裂、供體和移植物部位、痤瘡、挫傷、血腫、壓傷以及表皮平整或雷射修復引起的損傷。
17.根據權利要求14所述的組合物，其用於糖尿病病人。
18.根據權利要求17所述的組合物，其中病人患有糖尿病潰瘍。
19.根據權利要求14所述的組合物，其中傷口是由火、熱、輻射、電或皮膚外科手術導致的燒傷。
20.根據權利要求14所述的組合物，其應用於外科重建。
21.根據權利要求14所述的組合物，其應用於一組選自凝膠、膏狀物、洗液、噴霧劑、懸浮液、溶液、分散膏、水凝膠和軟膏的皮膚附著產品。
22.根據權利要求21所述的組合物，其中皮膚附著產品是通過塗敷、注射或電穿孔施用於需要治療的病人的。
全文摘要
本發明涉及一種包含有血栓調節蛋白的EGF樣區域之胺基酸序列的多肽或其保守性變異體用於治癒傷口的用途。本發明還涉及用於加速傷口癒合的組合物，該組合物中包含有血栓調節蛋白的EGF樣區域之胺基酸序列的多肽或其中保守性變異體。
文檔編號A61K48/00GK101024072SQ200610112159
公開日2007年8月29日 申請日期2006年8月15日 優先權日2005年6月9日
發明者江傳箕, 蘇輝斌, 吳華林, 施桂月 申請人:江傳箕, 蘇輝斌, 吳華林, 施桂月