新城疫病毒和鴨圓環病毒融合蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-05-13 05:52:01 1

新城疫病毒和鴨圓環病毒融合蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種新城疫病毒和鴨圓環病毒融合蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的融合蛋白自氨基端至羧基端依次含有鴨源新城疫病毒的F蛋白和鴨圓環病毒的Cap蛋白；所述鴨源新城疫病毒的F蛋白的胺基酸序列為序列表中序列1的第1-553位；所述鴨圓環病毒的Cap蛋白的胺基酸序列為序列表中序列1的第574-829位。本發明首次將鴨圓環病毒Cap基因與鴨源NDV分離株DUNDV的F基因構建融合表達重組真核質粒pcDNA3.1-F-Cap，以此作為DNA疫苗免疫2周齡的SPF雛鴨，結果顯示該DNA疫苗可有效促進SPF雛鴨產生NDV抗體和DuCV抗體。本發明為DuCV和鴨源NDV的基因疫苗的研究提供理論和實踐依據。
【專利說明】新城疫病毒和鴨圓環病毒融合蛋白及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，涉及一種新城疫病毒和鴨圓環病毒融合蛋白及其編碼基因與應用，特別涉及一種由鴨源新城疫病毒F蛋白和鴨圓環病毒Cap蛋白形成的融合蛋白及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002]鴨源新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起鴨的一類急性、高度接觸性和致死性的傳染病。早期國內外有關研究表明禽NDV從不感染水禽，強毒感染也不表現明顯的臨床症狀。但近年來發現引起高致病性和死亡性的鴨源NDV的自然流行，不僅給養鴨業造成較大的損失，同時也對我國養雞業造成威脅。新城疫病毒的F蛋白是病毒致病的分子基礎，參與病毒囊膜與細胞的融合致病過程，還具有良好的免疫原性，是NDV主要的保護性抗原。
[0003]鴨圓環病(Duckcircovirus Disease)是由鴨圓環病毒(Duck circovirus, DuCV)引起的一種主要侵害免疫系統，致免疫功能的下降或免疫抑制的疾病。DuCV基因組中主要編碼三個蛋白:R印、Cap和C3，其中Cap蛋白可能是DuCV的核衣殼的組成部分，與其致性及保護性抗原相關。
[0004]DNA疫苗作為一種新型的基因工程疫苗，具有低成本、免疫期長、生產速度快、熱穩定性好、便於保存和運輸等優點，倍受生物界的廣泛重視，目前已經在諸多領域被進行廣泛而深入的研究，並已取得豐碩的成果。針對愛滋病、流感、T淋巴細胞瘤和H型單純孢疹病毒的DNA疫苗已進入臨床試驗階段，C型肝炎、結核病及狂犬病等的核酸疫苗正處於研發之中並取得一定進展。
[0005]目前在國內外研究於禽類的DNA疫苗主要針對同一病源，如禽流感病毒、雞馬立克氏病病毒、新城疫病毒等。但針對兩種病毒的融合表達的DNA疫苗國內外均未見報導。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種新城疫病毒和鴨圓環病毒融合蛋白及其編碼基因與應用。
[0007]本發明所提供的融合蛋白自氨基端至羧基端依次含有鴨源新城疫病毒的F蛋白和鴨圓環病毒的Cap蛋白。
[0008]進一步，所述鴨源新城疫病毒的F蛋白的胺基酸序列為序列表中序列I的第1-553位；所述鴨圓環病毒的Cap蛋白的胺基酸序列為序列表中序列I的第574-829位。
[0009]更加具體的，所述融合蛋白是如下(a)或(b):
[0010](a)由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白； [0011](b)將序列I的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白。
[0012]其中，序列I由829個胺基酸組成，第1-553位為所述鴨源新城疫病毒的F蛋白，第574-829位為所述鴨圓環病毒的Cap蛋白，第554-573位為Linker接頭。
[0013]上述(a)和(b)中的所述融合蛋白均可人工合成，也均可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個胺基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個鹼基對的錯義突變。
[0014]編碼所述融合蛋白的基因也屬於本發明的保護範圍。
[0015]進一步，所述基因為如下I) -3)中任一:
[0016]I)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0017]2)與I)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且編碼所述融合蛋的DNA分子；
[0018]3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交，且編碼所述融合蛋的DNA分子。
[0019]上述嚴格條件可為用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65oC下雜交，然後用2XSSC，
0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0020]其中，序列2由2496個核苷酸組成，編碼序列表中序列I所示融合蛋白。
[0021]含有所述基因的重組載體、表達盒、重組細胞或重組菌也屬於本發明的保護範圍。
[0022]所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。
[0023]在本發明的一個實施例中，在所述重組表達載體中，啟動所述基因轉錄的啟動子為CMV啟動子。更為具體的，所述重組表達載體為在pcDNA3.1 (+)載體的多克隆位點處插入所述基因後得到的重組質粒(pcDNA3.Ι-F-Cap)。所述多克隆位點具體為HindIII和EcoR1。
[0024]所述表達盒由能夠啟動所述基因表達的啟動子，所述基因，以及轉錄終止序列組成。
[0025]所述融合蛋白，或所述基因，或所述重組載體、表達盒、重組細胞或重組菌在如下任一中的應用也屬於本發明的保護範圍:
[0026](I)製備預防或/和治療鴨源新城疫病毒或/和鴨圓環病毒的疫苗；
[0027](2)製備促進機體產生抗鴨源新城疫病毒的抗體或/和抗鴨圓環病毒的抗體的產品O
[0028]在本發明中，(2)中的所述機體具體為鴨，更加具體為2周齡SPF雛鴨。
[0029]本發明的再一個目的是提供一種預防或/和治療鴨源新城疫病毒或/和鴨圓環病
毒的疫苗。
[0030]本發明所提供的預防或/和治療鴨源新城疫病毒或/和鴨圓環病毒的疫苗，其活性成分為所述融合蛋白、所述基因、所述重組載體、所述表達盒、所述重組細胞或所述重組菌。
[0031]本發明利用柔性肽(linker)首次將鴨圓環病毒Cap基因與鴨源NDV分離株DUNDV的F基因串聯起來，構建了融合表達重組真核質粒pcDNA3.1-F-Capt5Linker具有摺疊性好、親水性低、無抗原性、無新表位出現等優點，能保證原有蛋白的物理性質和空間構象。實驗證明，以pcDNA3.1-F-Cap作為DNA疫苗對2周齡的SPF雛鴨以胸部肌肉多點注射的方式進行免疫，ELISA檢測抗體水平，試驗結果顯示:DNA疫苗免疫組的NDV抗體和DuCV抗體水平明顯高於載體空白對照組，差異顯著(P〈0.05) ;二免後DNA疫苗免疫組的抗體水平隨之增加。本發明為DuCV和鴨源NDV的基因疫苗的研究提供理論和實踐依據。【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為鴨源NDV F基因以及DuCV Cap基因的PCR產物。其中，泳道M為DNA分子量標準D2000Maker ;泳道I為DuCV Cap基因的PCR產物；泳道2為鴨源NDVF基因的PCR產物。
[0033]圖2為重組質粒pcDNA3.1-F-Cap的酶切鑑定結果。其中，泳道M為DNA分子量標準 Maker III Ladder ;泳道 I 為 pcDNA3.1-F-Cap 的 Hind II1、BamH I 和 EcoR I 的三酶切結果；泳道 2 為 pcDNA3.1-F-Cap 的 Hind III和 BamH I 雙酶切結果；泳道 3 為 pcDNA3.1-F-Cap的BamH I和EcoR I雙酶切結果。
[0034]圖3為重組質粒pcDNA3.1-F-Cap轉染Vero細胞後的瞬時表達檢測結果(間接免疫螢光)。其中，A為pcDNA3.1 (+)空載體對照；B為pcDNA3.1-F-Cap。
具體實施 方式
[0035]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0036]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0037]鴨源新城疫病毒(DuNDV):記載在「鴨源新城疫病毒、鴨瘟病毒和鴨圓環病毒三重PCR檢測方法的建立.動物醫學進展，2013，04:23-26 」一文，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。
[0038]鴨圓環病毒(DuCV):記載在「廣西部分地區鴨圓環病毒感染情況調查.中國畜牧獸醫，2010，37 (11): 156-158」 一文，公眾可從廣西壯族自治區獸醫研究所獲得。
[0039]真核表達載體pcDNA3.1 (+)購自Invitrogen公司；Vero細胞購自中國典型培養物保藏中心；SPF鴨胚購自哈爾濱獸醫研究所，自行孵化，負壓隔離器內飼養至所需日齡。
[0040]RNA PCR Kit (AMV)、T4連接酶、LA Taq DNA聚合酶、pMD18_T載體試劑盒和限制性內切酶Hind II1、BamH 1、EcoR I購自大連寶生物公司；TIANamp血液/細胞/組織基因DNA提取試劑盒、無內毒素質粒大量提取試劑盒購自TIANGEN公司；玻璃奶回收試劑盒購自OMEGA 公司；TRIzol LS Reagent、Lipofectamin2000、鴨新城疫病毒抗體(NDV-Ab)ELISA 試劑盒和鴨圓環病毒抗體(DuCV-Ab)ELISA試劑盒購自Invitrogen公司；FITC標記的羊抗雞IgG抗體，DMEM培養基購自GIBCO公司、胎牛血清購自Hyclone公司。
[0041]實施例1、重組真核表達載體pcDNA3.1-F-Cap的構建及表達鑑定
[0042]一、鴨源新城疫病毒的F基因和鴨圓環病毒的Cap基因的獲得
[0043]1、引物的設計與合成
[0044]根據鴨源新城疫病毒(DuNDV)的F基因序列和鴨圓環病毒(DuCV)的Cap基因序列，設計併合成引物(表1)。其中，引物Fl、F2用於擴增鴨源NDV的F基因的0RF，引物Cl、C2用於擴增DuCV的Cap基因的ORF，四條引物分別攜帶Hind IILBamH I ,BamH I ,EcoR I酶切位點(斜體部分)。下劃線處為linker,波浪線為kozak序列。引物由上海Invitrogen公司合成。
[0045]表1F基因和Cap基因的引物序列
[0046]
【權利要求】
1.一種融合蛋白，其特徵在於:所述融合蛋白自氨基端至羧基端依次含有鴨源新城疫病毒的F蛋白和鴨圓環病毒的Cap蛋白。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於:所述鴨源新城疫病毒的F蛋白的胺基酸序列為序列表中序列I的第1-553位。
3.根據權利要求1或2所述的融合蛋白，其特徵在於:所述鴨圓環病毒的Cap蛋白的胺基酸序列為序列表中序列I的第574-829位。
4.根據權利要求1或2所述的融合蛋白，其特徵在於:所述融合蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的胺基酸序列組成的蛋白；(b)將序列I的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列I衍生的蛋白。
5.編碼權利要求1-4中任一所述融合蛋白的基因。
6.根據權利要求5所述的基因，其特徵在於:所述基因為如下I)-3)中任一:1)序列表中序列2所不的DNA分子；2)與I)限定的DNA分子具有90%以上同源性，且編碼權利要求1-4中任一所述融合蛋的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA分子雜交，且編碼權利要求1-4中任一所述融合蛋的DNA分子。
7.含有權利要求5或6所述基因的重組載體、表達盒、重組細胞或重組菌。
8.根據權利要求7所述的重組載體，其特徵在於:所述重組載體為重組表達載體或重組克隆載體；或在所述重組表達載體中，啟動所述基因轉錄的啟動子為CMV啟動子。
9.權利要求1-4中任一所述的融合蛋白，或權利要求5或6所述的基因，或權利要求7或8所述的重組載體、表達盒、重組細胞或重組菌在如下任一中的應用:(1)製備預防或/和治療鴨源新城疫病毒或/和鴨圓環病毒的疫苗；(2)製備促進機體產生抗鴨源新城疫病毒的抗體或/和抗鴨圓環病毒的抗體的產品。
10.預防或/和治療鴨源新城疫病毒或/和鴨圓環病毒的疫苗，其特徵在於:所述疫苗的活性成分為權利要求1-4中任一所述的融合蛋白，或權利要求5或6所述的基因，或權利要求7或8所述的重組載體、表達盒、重組細胞或重組菌。
【文檔編號】A61K39/295GK103524624SQ201310420930
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月16日 優先權日:2013年9月16日
【發明者】謝芝勳, 許宗麗, 謝麗基, 劉加波, 鄧顯文, 謝志勤, 龐耀珊, 範晴, 羅思思 申請人:廣西壯族自治區獸醫研究所