利用口蹄疫病毒2a序列構建植物三價融合表達載體的方法
2023-05-15 07:20:46 3
專利名稱：利用口蹄疫病毒2a序列構建植物三價融合表達載體的方法
技術領域：
本發明屬於生物工程育種領域，涉及利用口蹄疫病毒2A序列構建植物三價融合 基因表達載體的方法，具體涉及利用口蹄疫病毒2A序列構建湖北海棠三價融合基因表達 載體的方法。
背景技術：
隨著分子生物學和生物技術的發展，通過遺傳轉化技術有效地將優良的基因導入 栽培品種，培育優良新品種，對於提升植物育種水平和培育新品種具有重大意義。目前主要 是通過單基因轉化法獲得轉基因植物，但是一個優良的性狀往往是由多個基因共同參與才 能完成，所以通過遺傳轉化的方法培育新品種就需要通過多基因轉化法。目前多基因轉化 法主要有雜交方法；重複轉化方法；多質粒共轉化的方法等，這些方法不僅耗時，而且得 不到很好的效果。目前主要通過重複轉化法實現多基因的轉化，但是絕大多數物種的遺傳轉化體系 還不完善，轉化效率極低。在一個基因轉化成功的基礎上，再繼續轉化第二個、第三個基因 的效率就更低。通過構建三價和多價植物融合表達載體，可以一次性的將多個目的基因導 入受體系統中。但是植物表達載體由於含有篩選標記基因和抗性基因，其載體本身很大，把 三個目的基因依次連接在植物表達載體上，難度很大。研究三價融合表達載體的構建，為從 事多價基因的轉導培育新種質提供強有力的技術支持。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種利用口蹄疫病毒2A序列構 建植物三價融合基因表達載體的方法，利用該方法可以有效、穩定的構建植物三價融合表 達載體。一種利用口蹄疫病毒2A序列構建植物三價融合基因表達載體的方法，包含如下 步驟(1)序列分析引物合成根據湖北海棠MhTGA2、MhNPRl、MhChitl基因的序列，利用 Bioxm2. 6進行酶切位點分析，並設計含有酶切位點的引物序列，見表1 ；表1引物序列
權利要求
1. 一種利用口蹄疫病毒2A序列構建植物三價融合基因表達載體的方法，其特徵在於 包含如下步驟(1)序列分析引物合成根據湖北海棠MhTGA2、MhNPRU MhChitl基因的序列，利用 Bioxm2. 6進行酶切位點分析，並設計含有酶切位點的引物序列，見表1 ； 表1引物序列
2.根據權利要求1所述的利用口蹄疫病毒2A序列構建植物三價融合基因表達載體 的方法，其特徵在於步驟(2)所述的MhTGA2、MhNPRU MhChitl基因的擴增及其酶切是以 湖北海棠全長cDNA文庫為模板，利用步驟(1)設計的引物，分別進行MhTGA2、MhNPRl、 MhChitl三個目的基因的PCR擴增，將擴增結果進行回收、分別連接pMD18 simple T載體、 轉化DH5 α感受態細胞、測序，將測序正確的菌株提質粒，分別得到重組質粒pTGA2、pNPRl、 pChitlο
3.根據權利要求1所述的利用口蹄疫病毒2A序列構建植物三價融合基因表達載體的 方法，其特徵在於步驟(4)所述的植物雙元表達載體的改造是利用內切酶)(ba I和Mc I 對植物表達載體PCAMBIA-S1300+和步驟(3)合成的序列b分別進行雙酶切，分別回收長度 為的序列b目的片段和植物表達載體pCAMBIA-S1300+線性大片段，利用T4DNA連接 酶進行連接，得到改造後的植物雙元表達載體PCAMBIA-S1300+1 ；
4.根據權利要求1所述的利用口蹄疫病毒2A序列構建植物三價融合基因表達載體的 方法，其特徵在於步驟(5)所述的中間載體的構建具體方法為a.將合成的序列b、序列c和pMD19-T分別進行)(baI和Mc I雙酶切，回收目的片段， 將經雙酶切後的長度為128bp的序列b目的片段和長度為128bp的序列c目的片段分別與 經雙酶切後的PMD19-T線性大片段進行連接，轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，隨機篩選白 色菌落，進行搖菌，提質粒，酶切鑑定，命名為P2Ab和P2Ac ；b.將質粒P2Ab和質粒pTGA2分別進行SpeI和BamH III雙酶切，回收pTGA2酶切產 物中長度為1012bp的MhTGA2基因目的片段和P2Ab線性大片段，連接兩片段得重組質粒， 重組質粒轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，進行菌液PCR鑑定和酶切鑑定，將鑑定正確的質 粒命名為TP2Ab ；c.將質粒TP2Ab和pNPRl分別進行MluI和ApaI雙酶切，回收pNPRl酶切產物中長度 為1770bp的MhNPRl基因目的片段和TP2Ab線性大片段，連接兩片段得重組質粒，重組質粒 產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，進行菌液PCR鑑定和酶切鑑定，將酶切鑑定結果正確 的質粒進行測序，命名為ΤΡ2ΑΝ ；d.將質粒P2Ac和pchitl分別進行BssHII和KpnI雙酶切，回收目的片段，回收pchitl 酶切產物中長度為963bp的Mhchitl基因目的片段和P2Ac線性大片段，連接兩片段得重組 質粒，重組質粒轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，進行菌液PCR鑑定和酶切鑑定，將酶切鑑 定正確的質粒命名為P2AcC ；e.將質粒P2AcC和TP2AN分別進行ApaI和KpnI雙酶切，回收質粒P2AcC酶切產物中 長度為1023bp的目的片段和質粒TP2AN酶切產物中的線性大片段，連接兩片段得重組質 粒，重組質粒轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，利用第一個基因MhTGA2的上遊引物MhTGFl 和最後一個基因Mhchitl基因的下遊引物MhCHRl進行菌液PCR鑑定和測序，酶切和測序正 確的質粒即為構建成功的中間載體TP2AN2AC。
全文摘要
本發明屬於生物工程育種領域，公開了利用口蹄疫病毒2A序列構建植物三價融合基因表達載體的方法。該方法包含如下步驟(1)序列分析引物合成，(2)MhTGA2、MhNPR1、MhChit1基因的擴增及其酶切，(3)合成含有口蹄疫病毒2A序列的兩條序列，(4)植物雙元表達載體的改造，(5)中間載體的構建，(6)植物三價雙元表達載體的構建。通過本發明構建方法進行三價或者多價融合表達載體構建，大大提高了載體構建成功的概率，可以很大程度上縮小工作量，節約構建載體的時間，對今後通過多基因遺傳轉化改良品種具有重要意義。
文檔編號C12N15/82GK102121031SQ201010598338
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月21日 優先權日2010年12月21日
發明者喬玉山, 張計育, 徐長寶, 渠慎春, 王三紅, 章鎮, 蔡斌華, 陶建敏, 高志紅 申請人:南京農業大學