大蒜中提取得到的抗腫瘤活性的多肽的製作方法

2023-05-17 02:17:16

本發明屬於生物領域，具體地涉及一種從大蒜中提取得到的能夠治療乳腺癌的抗腫瘤活性的多肽。
背景技術：
：癌症，亦稱惡性腫瘤，為由控制細胞生長增殖機制失常而引起的疾病。癌細胞除了生長失控外，還會局部侵入周遭正常組織甚至經由體內循環系統或淋巴系統轉移到身體其他部分。癌症是一大類惡性腫瘤的統稱。癌細胞的特點是無限制、無止境地增生，使患者體內的營養物質被大量消耗；癌細胞釋放出多種毒素，使人體產生一系列症狀；癌細胞還可轉移到全身各處生長繁殖，導致人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發熱以及嚴重的臟器功能受損等等。與之相對的有良性腫瘤，良性腫瘤則容易清除乾淨，一般不轉移、不復發，對器官、組織只有擠壓和阻塞作用，但癌症（惡性腫瘤）還可破壞組織、器官的結構和功能，引起壞死出血合併感染，患者最終由於器官功能衰竭而死亡。到了科學高速發展的今天，我們有理由相信癌症並非不治之症。致力於自然醫學研究的醫學專家們研究發現：負離子對抑制癌細胞轉移有令人鼓舞的效果，重要的是利用自然因子負離子對癌症患者治療對機體無任何損害，沒有任何毒副作用。在常規的癌症治療中，主要有藥物治療、手術治療、放射治療以及化學治療。目前已使用的抗腫瘤藥物雖對大多數腫瘤有一定療效，但仍存在著治療有效率低、選擇性差、毒副作用明顯、易產生細胞耐藥等問題。因此，尋找高效、低毒、作用靶點明確的抗腫瘤藥物仍是生物、醫學科研領域的研究熱點。大蒜為百合科蔥屬植物蒜，植物學名稱為aliurnsatlrum和alliumcepa。多年生草木，具有強烈的臭辣味，為人工栽培。我國南北備省均有出產。大蒜在我國被用作藥物有著悠久的歷史，現代醫學研究發現，大蒜具有抗菌、抗腫瘤、降血脂、抗血小板聚集等作用。而且已經分離得到了多種具有癌症抑制效果的蛋白質、脂類、多糖等。但是現實現有技術中還沒有一種特別有限的針對癌症具有較好抑制活性的大蒜多肽。技術實現要素：本發明的要解決的技術問題是提供一種抗乳腺癌活性物質的大蒜系列多肽。該多肽是從剛出土的大蒜蒜瓣中通過提取獲得的。本發明還提供了一種提取大蒜中活性多肽的方法，該方法包括，將新鮮出土的大蒜蒜瓣冷藏，成粉末，水提，超濾膜過濾，雙向電泳分離，質譜，分離，乾燥得到。本發明還提供所述具體的肽的胺基酸序列為：nb-ds-5：rcpsigiclttnb-ds-8：lrmksppggsrttnb-ds-9：srllmkgrrsppmttnb-ds-10：gspylrmkgvggsmrtnb-ds-13：myvsrlgssgiglnb-ds-14：cpsrgssamarlnb-ds-16：martspygeqsrp本發明提供的一個技術方案是：一種多肽，其序列為seqidno：1至7任一所示的具有30%以上同源性的多肽。一種多肽，其序列為seqidno：1至7任一所示。一種藥物組合物，包括治療有效量的seqidno：1至7任一所示的多肽和其藥學上可接受的鹽。一種藥物組合物，包括治療有效量的seqidno：1至7任一所示的多肽和藥學上可接受的載體或稀釋劑。本發明的藥物組合物在製備用於治療癌症的藥物中的應用。本發明的藥物組合物在製備用於治療乳腺癌的藥物中的應用。本發明的優點：本發明的一系列從大蒜中提取的活性多肽對各種癌症均有良好的抑制效果，有望進一步製備成治療癌症的藥物。具體實施方式實施例1大蒜多肽的提取取剛出土的新鮮的大蒜（2日齡以內），去皮，成蒜瓣，液氮冷凍1h。研磨成粉末，加入ph7.0的pbs進行溶解，並過濾。上清採用超濾分離，超濾膜採用0.3kda、5kda、50kda的超濾膜進行過濾，獲得分子量0.3-5kda和5-50kda的不同組分，檢測各組分的抗腫瘤活性，結果表明分子量0.3-5kda的組分抗腫瘤活性最佳。將超濾獲得的具有最佳抗腫瘤活性組分，過deaeff陰離子交換層析預裝柱，上樣緩衝液為4mmol/lph8.5tris-hcl緩衝液，每次上樣量為10ml，洗脫液為含1mol/lnacl的4mmol/lph8.5tris-hcl，洗脫液先依次以3%(v/v)、6%(v/v)、9%(v/v)、12%(v/v)、24%(v/v)、100%(v/v)的濃度進行梯度洗脫，流速為5ml/min，檢測波長為280nm，層析圖譜，收集各峰，檢測各峰組分的抗腫瘤活性，結果表明峰5、8、9、10、13、14、16組分具有最佳抗腫瘤活性，把相應的峰組分脫鹽後真空冷凍乾燥保存。即為本申請所要求保護的抗腫瘤活性多肽。實施例2所述多肽的抗乳腺癌活性檢測所述的各峰組分抗腫瘤活性分析為以mda-mb-231細胞，採用mtt法追蹤抗腫瘤活性組分。採用pbs緩衝液作為對照。mtt法：取對數生長期的mda-mb-231細胞，用胰酶消化後，以4×104個/孔的密度接種於96孔板中，每孔180μl，在37℃，培養24h。然後加樣，樣品溶液應先經過微孔濾膜過濾除菌，用培養液將樣品稀釋成5個濃度梯度，每孔加入20μl，4個平行孔，置於細胞培養箱中繼續培養48h。然後，加入mtt（5mg/ml）20μl，置co2培養箱37℃培養4h。棄除孔中培養液，然後每孔加入dmso150μl，37℃恆溫振蕩30min以充分溶解甲瓚結晶。酶標儀檢測各孔在570nm波長處吸光度(a)值，實驗至少重複3次。細胞抑制率=［(a對照-a樣品)/a對照］×100%。採用excel分析軟體計算半數抑制濃度ic50。結果如表1所示：多肽ic50（μmol/l）nb-ds-53.27nb-ds-83.56nb-ds-93.94nb-ds-104.02nb-ds-133.88nb-ds-144.02nb-ds-163.99pbs對照無抑制效果實施例6所述多肽對不同腫瘤細胞和正常細胞的細胞毒。分別以人肝癌細胞bel-7402、人膠質瘤細胞u251、人非小細胞肺癌細胞a549等腫瘤細胞為靶細胞，以正常的人肺成纖維細胞hfl1作為對照。採用mtt法，檢測本申請的多肽對各種腫瘤細胞具有增殖抑制作用，其中，對bel-7402的ic50值為5.96μmol/l，對hfl1的細胞毒性幾乎沒有。因此，本發明的多肽可以在治療人肝癌、膠質瘤、肺癌、乳腺癌的藥物中進行應用。結果如表2所示：多肽ic50（μmol/l）bel-7402ic50（μmol/l）u251ic50（μmol/l）a549ic50（μmol/l）正常表皮細胞nb-ds-532.5129.8731.85無明顯抑制效果nb-ds-837.4828.5632.27無明顯抑制效果nb-ds-932.5627.6633.76無明顯抑制效果nb-ds-1033.5729.3137.46無明顯抑制效果nb-ds-1335.9632.5340.05無明顯抑制效果nb-ds-1436.4531.4829.17無明顯抑制效果nb-ds-1634.9934.2833.48無明顯抑制效果pbs對照無明顯抑制效果無明顯抑制效果無明顯抑制效果無明顯抑制效果序列表〈110〉馬恆標〈120〉大蒜中提取得到的抗腫瘤活性的多肽〈160〉7〈210〉1〈211〉11〈212〉prt〈213〉人工合成〈400〉1rcpsigicltt〈210〉2〈211〉13〈212〉prt〈213〉人工合成〈400〉2lrmksppggsrtt〈210〉3〈211〉15〈212〉prt〈213〉人工合成〈400〉3srllmkgrrsppmtt〈210〉4〈211〉16〈212〉prt〈213〉人工合成〈400〉4gspylrmkgvggsmrt〈210〉5〈211〉13〈212〉prt〈213〉人工合成〈400〉5myvsrlgssgigl〈210〉6〈211〉12〈212〉prt〈213〉人工合成〈400〉6cpsrgssamarl〈210〉7〈211〉13〈212〉prt〈213〉人工合成〈400〉7martspygeqsrp當前第1頁12