一種厭氧微生物分離培養方法

2023-04-29 05:01:31 1

專利名稱：一種厭氧微生物分離培養方法
一種厭氧微生物分離培養方法發明領域本發明涉及一種厭氧微生物的分離方法，尤其是一種極端微生物生理生態研 究、自然生態研究，遺傳工程研究，生命科學研究，病理學研究，海洋地質研究 和環境汙染治理中不可缺少的新方法。
背景技術：
在自然生態系統中，微生物扮演著非常重要的角色。在汙染治理中，微生物 可以分解很多其他方法不能去除的有機或無機汙染物，且成本低廉；在地質學研 究中，不同區域的特定種類的極端微生物的親緣關係，可能標誌著這些區域以往 的位置關係。但微生物往往是以菌群為單位，多種微生物生存在一起，因此，分 離獲得微生物的純培養是微生物生理生化研究中必須首先解決的問題。一個新的 微生物菌種的發現，往往會導致微生物學的重大進展，也可能會引起-個新的學 科交叉點比如硝酸鹽還原菌與硝酸鹽廢水的治理，幽門螺旋菌與胃癌的治療等。 其中，極端環境下的微生物往往是環境、能源、地質研究中比較重要的角色，可 以給科研工作者提供很多新的思路和方法。但山於其培養的環境條件難以在常規 條件下得到模擬，極端環境下的微生物往往是難以純化培養，尤其是要求兒種極 端條件同時具備的情況，如要求極端厭氧環境和高溫環境同時具備。微生物的分離和純化的方法及專利有很多，如一次性微生物分離診斷鑑定培養基(專利號200520003682.8)， 一種微生物分離培養方法(專利號 94103474.7)等，但這些分離方法中，多數為針對分離好氧菌或兼性厭氧菌。厭氧菌分為非嚴格厭氧菌和嚴格厭氧菌暴露於氧氣中會造成生長抑制的細 闍為非嚴格厭氧菌，暴露於氧氣中造成菌體死亡的稱為嚴格厭氧菌。不同厭氧菌 對氧氣的耐受能力不同， 一般以耐氧時間作為指標。在耐氧時間內，不會造成菌 體死亡，菌體的耐氧時間差異很大，從幾秒鐘到數十小時不等。對於耐氧時間極 短的細菌，由於在分離操作的過程中很容易因接觸氧氣而造成菌體死亡，人們往 往很難分離到，只能用探針的方法去檢測其核酸片斷，無法得到純培養細菌。而 耐氧時間短的細菌多數生活在極端環境中，如在深海中由於巨大的水壓，細菌不會和氧氣接觸。極端環境微生物往往是一個新的物種，對科學研究的意義重大； 而且由於極端條件下的樣品很難獲得，所以，從極端條件下分離到的微生物十分 珍貴。但是，這種對厭氧條件的嚴格要求造成了分離厭氧菌的極大的障礙。如果 沒有得到細菌的純培養，人們就難以在自然的條件下去研究該厭氧菌的代謝機 理，對厭氧菌進一歩研究受到制約。在對厭氧細菌的檢索中，有很多細菌均被稱 為"未培養細菌"。這說明對於厭氧細菌來說，現有的分離技術還有很大的局限性。目前已報導分離厭氧細菌的方法主要有1) 利用厭氧工作站對細菌進行分離培養，可以保證分離的全過程中，目的 細菌與氧氣隔絕，但是，目前的厭氧工作站中一般設定的培養溫度上限為5(TC，難以給嗜熱厭氧菌提供足夠的培養溫度。而且即使欲分離培養5crc以下生長環境的細菌， 一個厭氧工作站只也能設定一個培養溫度，分離培養不同溫度的微生 物就需要多個厭氧工作站，極大的提高了實驗成本。同時，厭氧工作站中難以提 供嚴格的無菌環境，培養時，培養皿之間容易互相染菌。2) 利用厭氧罐、厭氧袋及滾管操作分離厭氧微生物，可以提供細菌5(TC以 上的培養溫度，但整個操作過程暴露於空氣中，目的厭氧菌會與氧氣接觸，造成 目的菌體死亡。3) 文獻《一種分離培養硫酸鹽還原菌的改進方法》(萬海清，應用與環境生 物學報，2003， 9 (5): 561-562)中介紹了疊皿夾層法分離厭氧微生物，但該方 法在塗布操作過程中，菌體會短時間內暴露於空氣中。如果預分離的細菌的耐氧 時間較少，將會造成目的菌體的死亡。4) 文獻《對一種新的厭氧菌培養皿一OxyplateTM的評估》(趙虎等，上海 醫學檢驗雜誌，2002， 06)中介紹了利用OxyplateTM培養皿分離厭氧菌的方法， 該方法同樣存在於塗布操作過程中，菌體短時間暴露於空氣中，造成菌體死亡。5) 專利 種適合厭氧培養使用的培養皿，(專利號200420074957.2)，該專利針對醫療基層機構中厭氧致病菌的發現和培養，致病菌往往生存在非嚴格厭 氧的環境中，利用這種培養皿分離耐氧時間短的細菌，可能會造成菌體死亡。發明內容本發明的目的是提供一種簡單且準確的高溫厭氧菌分離方法，該方法能夠在操作全程中避免目的厭氧菌菌體與空氣接觸，並且可以分離5crc以上培養溫 度的高溫厭氧菌。本發明的具體解決方案為1) 將含指示劑的瓊脂培養基及帶密封蓋的玻璃管滅菌；2) 將未凝固的瓊脂培養基、含目的厭氧菌的自然物質、帶密封蓋的玻璃管 放入厭氧工作站的樣品室中，向樣品室中進行反覆三次的抽空氣，衝入氮 氣(或氫氮混合氣)的常規操作；3) 將含目的微生物的自然物質與未凝固的瓊脂培養基混合均勻後，分裝於 玻璃管中，旋緊密封蓋；4) 從厭氧工作站中將玻璃管取出，置於培養箱中，設定培養溫度，培養一 定時間；5) 待玻璃管中有陽性反應(與所加指示劑的陽性反應一致)時，在厭氧操 作站中，將目的菌體取出。本發明的優點如下1. 分離速度快，富集液到分離到菌體的時間在一周之內，且純度非常高；2. 達到同樣分離效果的操作成本比其它高溫厭氧菌的分離方法低；3. 簡便易行；4. 可分離到普通方法難以得到的高溫厭氧菌。


圖l培養出高溫厭氧菌的厭氧管及挖瓊脂時用的銅絲1. 挖瓊脂塊時所用到的銅絲2. 培養出高溫厭氧菌的厭氧管 圖2厭氧工作站示意圖1. 氣路系統2. 氣密室(用於送樣品)3. 樣品4. 連通氣密室與操作室的通道5. 操作室具體實施方式
取含有目的厭氧微生物的自然物質(熱液口底泥、底表水、厭氧汙泥)，利 用合適的液體培養基富集後，在厭氧工作站內將富集液與未凝固的固體培養基混 合，分裝於厭氧管，從厭氧工作站中取出，置於不同溫度條件下培養，即可分離 到目的菌種。 實施例11. 用加有七水合硫酸亞鐵(0.0001g/L)指示劑的液體培養基對含目的菌 體的太平洋深海熱液口底泥2.5g進行富集。2. 在有氧條件下，以乙醇(濃度為0.2mL/L)為碳源，七水合硫酸亞鐵(0.006g/L)為指示劑，瓊脂濃度為1.8g/L，配製培養基50mL，置於 帶棉塞的三角燒瓶中，高溫高壓滅菌(12rC， 15分鐘)。3. 在培養基凝固以前，將三角燒瓶和富集液置於厭氧工作站的樣品室中， 抽氮氣充氮氣反覆三次，抽走培養基內的空氣。4. 在厭氧工作站的操作箱中，在未凝固的培養基中接入3mL的富集上清 液，搖勻後分裝於厭氧管(或有密閉性良好的螺口塞的透明玻璃管) 中。5. 將厭氧管取出，放入普通培養箱中，調節溫度為90。C， 60小時後，可 觀察到培養基內部有小黑點(與指示劑反應的顯色現象)出現，繼續 培養2天，會有不同大小，出現先後時間不同的小黑點，用記號筆在 管壁上標記。6. 將銅絲的一端砸平，將這段平的部分彎成鉤狀，用錫紙包好這樣的一小捆銅絲後，滅菌。7. 將滅菌的銅絲和厭氧管置於厭氧工作站中，用銅絲的彎的一端將小黑 點挖出，接種於新的培養基即可。為了保證分到的細菌的純度，操作 時，要從管口處向管內依次挖出小黑點，每挖出一個小黑點前，更換 一根新的滅菌銅絲；每挖出一個小黑點後，要將從這個小黑點到管口 之間所有的瓊脂挖出來。8. 對分離得到的目的厭氧菌進行DNA的提取，在利用PCR做16s rDNA 測序時不會出現雙峰，測序結果準確，在NCBI資料庫比對結果表明該 菌與一株格蘭氏陽性嗜溫菌最為相近，相似度99%。實施例21. 用加有七水合硫酸亞鐵(0.0005g/L)指示劑的液體培養基對含目的菌 體的大西洋深海熱液口底泥3g進行富集。2. 在有氧條件下，以乙醇(濃度為10mL/L)為碳源，七水合硫酸亞鐵(0.0005g/L)為指示劑，瓊脂濃度在0.03g/L，配製培養基15mL，置 於帶棉塞的三角燒瓶中，高溫高壓滅菌(12rC, 15分鐘)。3. 在培養基凝固以前，將三角燒瓶和富集液置於厭氧工作站的樣品室中， 抽氮氣充氮氣反覆三次，抽走培養基內的空氣。4. 在厭氧工作站的操作箱中，在未凝固的培養基中接入3mL的富集上清 液，搖勻後分裝於厭氧管中。5. 將厭氧管取出，放入普通培養箱中，調節溫度為6CTC， 35小時後，可 觀察到培養基內部有小黑點(與指示劑反應的顯色現象)出現，繼續 培養4天，會有不同大小，出現先後時間不同的小黑點，用記號筆在 管壁上標記。6. 將銅絲的一端砸平，將這段平的部分彎成鉤狀，用錫紙包好這樣的一 小捆銅絲後，滅菌。7. 將滅菌的銅絲和厭氧管置於厭氧工作站中，用銅絲的彎的一端將小黑 點挖出，接種於新的培養基即可。8. 對分離得到的目的厭氧菌進行DNA的提取，在利用PCR做16s rDNA 測序時不會出現雙峰，測序結果準確，在NCBI資料庫結果表明該菌與 一株厭氧嗜溫菌最為相近，相似度100%。實施例31. 用加有七水合硫酸亞鐵(0.02g/L)指示劑的液體培養基對含目的菌體 的太平洋近海底表水3-10mL進行富集。2. 在有氧條件下，以乙酸鈉(濃度為8g/L)為碳源，七水合硫酸亞鐵(0.02g/L)為指示劑，瓊脂濃度為0.03g/L，配製培養基100mL，置於 帶棉塞的三角燒瓶中，高溫高壓滅菌(121°C， 15分鐘)。3. 在培養基凝固以前，將三角燒瓶和富集液置於厭氧工作站的樣品室中， 抽氮氣充氮氣反覆三次，抽走培養基內的空氣。4. 在厭氧工作站的操作箱中，在未凝固的培養基中接入3mL的富集上清 液，搖勻後分裝於厭氧管中。5. 將厭氧管取出，放入普通培養箱中，調節溫度為15'C， 24小時後，可 觀察到培養基內部有小黑點出現，繼續培養2天，會有不同大小，出 現先後時間不同的小黑點，用記號筆在管壁上標記。6. 將銅絲的一端砸平，將這段平的部分彎成鉤狀，用錫紙包好這樣的一 小捆銅絲後，滅菌。7. 將滅菌的銅絲和厭氧管置於厭氧工作站中，用銅絲的彎的一端將小黑 點挖出，接種於新的培養基即可。8. 對分離得到的目的厭氧菌進行DNA的提取，在利用PCR做16s rDNA 測序時不會出現雙峰，測序結果準確，在NCBI資料庫結果表明該菌與 Thioclava pacifica最為相近，相似度100%。
權利要求
1. 一種厭氧微生物的分離培養方法，其分離步驟為1)將含目的微生物的自然物質，利用含一定濃度指示劑的培養基富集，得到細菌富集液；2)將富集液、滅菌後未凝固的含一定濃度瓊脂及一定濃度碳源的培養基、滅菌後的可密封容器利用厭氧工作站的樣品室，抽出空氣，衝入氮氣或氫氣氮氣混合氣體，將培養基中的氧氣去除。3)在厭氧條件下，在常溫條件下，利用未凝固瓊脂的培養基與細菌富集液混合，密封於滅菌容器內；4)此後無需提供厭氧環境，將容器置於普通烘箱或培養箱中，提供其適宜溫度，即可分離出目的微生物的菌落。
2. 根據權利要求l中l)，所述指示劑為七水合硫酸亞鐵，其濃度範圍為 0.0001-0.02g/L。
3. 根據權利要求1中2)，所述的培養基及可密閉容器均經過高溫高壓滅菌，滅 菌溫度為12rC，時間為15分鐘；所述的未凝固瓊脂培養基的瓊脂濃度範圍為0.03-1.8g/L;所述的培養基中，碳源為乙醇、乙酸鈉、乳酸鈉、葡萄糖、澱粉或肉湯等有機化合物，濃度範圍分別為乙醇0.2mL/L-10 mL/L，乙酸 鈉0.3g/L-15 g/L，乳酸鈉0.3g/L-15 g/L，葡萄糖0.3g/L-20 g/L，澱粉0.5g/L-20 g/L，肉湯0.3mL/L-50 mL/L。
4. 根據權利要求1中3)，所述的厭氧條件指接種時需要提供厭氧手套箱或厭 氧操作臺；所述的常溫條件下是指操作溫度為室溫，即15 — 30。C。
5. 根據權利要求1中4)，所述的無需提供厭氧環境指樣品可以置於普通培養箱 或烘箱中；適宜溫度指培養溫度為15-9(TC。
全文摘要
本發明涉及一種厭氧微生物分離培養方法，該方法在整個操作過程中避免了目的微生物與氧氣的接觸，操作成本相對低廉，尤其適於生長溫度高於50℃且對厭氧環境要求嚴格的難分離高溫厭氧菌、嚴格厭氧菌。該方法只需在厭氧菌分離的部分操作時使用厭氧工作站，培養時可以使用普通培養箱，無需繼續提供厭氧環境，避免了分離培養時一臺厭氧工作站只能用於一種生長溫度的細菌的情況；對於培養溫度高於厭氧工作站溫度上限的細菌，該方法同樣適用。
文檔編號C12N1/00GK101270334SQ20071006471
公開日2008年9月24日 申請日期2007年3月23日 優先權日2007年3月23日
發明者懿 張, 曹宏斌, 李玉平, 潘嘉川 申請人:中國科學院過程工程研究所