一種檢測潮黴素磷酸轉移酶hpt的酶聯免疫檢測試劑盒及檢測方法
2023-04-29 18:00:31 1
專利名稱：一種檢測潮黴素磷酸轉移酶hpt的酶聯免疫檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬於酶聯免疫分析技術領域，特別是涉及一種轉基因產品中潮黴素磷酸轉移酶(Hygromycin phosphotransferase，HPT)的免疫檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
潮黴素磷酸轉移酶(HPT)基因已成為繼新黴素磷酸轉移酶(NPTII)基因後，另一種廣泛使用且更有效的標記基因，它可將磷酸基團共價地加到潮黴素B的第四位上，從而使受體細胞產生潮黴素抗性。因此，在轉基因植物遺傳轉化過程中，將hpt基因作為選擇標記基因與目標基因(如Bt和CpTI基因等)一同導入作物，使轉化成功的植株產生潮黴素抗性，以有利於轉基因作物的篩選。hpt基因是目前最有效的選擇標記基因之一，已被廣泛應用於抗蟲水稻、玉米、高粱、小麥和棉花等多種轉基因作物。據國際農業生物技術應用理事會最新公布，全世界轉基因作物種植面積已由1996年的170萬公頃增至2005年的9000萬公頃。
選擇標記基因hpt的食品和環境安全性，與目標基因和報告基因等基因一樣，也需要全面評價。隨著含有hpt基因的轉基因作物的增多，這類轉基因作物表達的HPT蛋白可能會通過根系分泌、殘枝敗葉等生物廢棄物以及秸稈還田等途徑釋放到環境中去，成為一種新的環境外源汙染物。若HPT蛋白在環境中形成大量積累，則可能導致以下三個問題一是可能通過地表徑流等途徑進入水體，或通過食物鏈進入動物和人體，從而使動物體甚至人類對潮黴素及其相似抗生素產生抗藥性；二是可能影響土壤部分可培養微生物的數量及土壤酶活性，甚至可能改變環境微生物的群落結構和組成；三是有可能使土壤微生物增加對抗生素的抗性產生超級細菌等。
目前HPT蛋白的檢測主要通過Western雜交、試紙條檢測、聚丙烯醯胺凝膠電泳方法等分析手段，HPT-ELISA檢測方法也曾有人報導過，但是由於檢測極限較高而未能有效地檢測到該蛋白的存在。由於含有hpt基因的轉基因產品大規模的上市，其是否會造成的環境影響和人類健康的慢性和長期效應日益受到人們關注和擔憂，對該基因的表達產物的數量、範圍、指標等諸方面都提出了新的要求和更高的標準，傳統方法複雜繁瑣，樣品前處理過程繁雜，工作量大且儀器昂貴以及分析周期較長。因此，快速簡便的檢測方法很有必要。如何才能快速簡便的檢測選擇標記基因表達蛋白已經成為人們關注和迫切需要解決的問題。
發明內容
本發明的目的是提供一種結構簡單、操作方便、一次可測定大量樣品的潮黴素磷酸轉移酶酶聯免疫檢測試劑盒。
本發明的目的是採用這樣的技術解決方案實現的所述試劑盒由盒體構成，在盒體內設置有多孔酶標板和試劑，其特徵在於所述酶標板的每個孔內設有包被抗體，該包被抗體表面由1.0～3.0％牛血清白蛋白封閉，所述試劑包含洗滌液、底物稀釋液、HPT蛋白標準液、辣根過氧化物酶標記的二抗、底物和反應終止液。
本發明的優點是能用於轉基因產品中hpt基因表達蛋白的檢測，樣品的前處理過程簡單、耗時少，能同時檢測批量的樣品，樣品檢測成本較低、保存期長、靈敏度高，它是一種適用於轉基因產品中HPT蛋白的快速檢測用具。
圖1為HPT-ELISA法HPT標準曲線。
圖2為試劑盒的示意3為多孔酶標板示意圖附圖標號說明1-盒體，2-酶標板，3-洗滌液，4-封閉溶液，5-HPT蛋白標準液，6-辣根過氧化物酶標二抗，7-底物稀釋液(醋酸鈉-檸檬酸緩衝液)，8-30％過氧化氫溶液，9-顯色物質TMB，10-反應終止液，11-海綿託架。
具體實施例方式
參照圖1、圖2本發明包括盒體1、在盒體1內設有酶標板2，盒體1內放置有試劑，在多孔酶標板2的每孔內，有包被液包被且能與潮黴素磷酸轉移酶抗原特異性結合反應的包被抗體，用1.0～3.0％牛血清白蛋白進行封閉，所述試劑有PBST濃縮洗滌液3、底物稀釋液7、HPT蛋白標準液5、辣根過氧化物酶標記的二抗6、30％過氧化氫溶液8、顯色物質TMB 9和反應終止液10。所述抗體包被緩衝液，採用0.05 M碳酸鹽緩衝液，其pH8.0～10.0由碳酸鈉1.2～2.0g、碳酸氫鈉2.5～3.5g、重蒸水配製而成；所述洗滌液3為含0.01～0.05％Tween-20的磷酸鹽緩衝液(簡稱為PBST)由磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2.0～4.0g、氯化鈉6.0～8.0g、氯化鉀0.2～0.4g、吐溫-20 0.5～1.0mL、3.0～6.0mL 0.5M EDTA和重蒸水配製而成；所述封閉溶液4為含1.0～3.0％牛血清白蛋白BSA的溶液，亦可用於樣品稀釋和檢測抗體稀釋；底物稀釋液7為pH5.5～6.0檸檬酸/醋酸鈉緩衝液，採用醋酸鈉4.0～5.0g、檸檬酸2.0～4.0g和重蒸水配製；所述終止液10採用硫酸溶液；所述酶標板2採用96孔的酶標板。
在盒體1內放置96孔酶標板2和試劑後，應放在2～6℃貯存，忌0℃以下凍存，有效期可達為12個月；其中96孔酶標板2可由塑料支架和可拆分的塑料條組成，酶標板2放置在真空袋內，所述試劑放置在海綿託架11的凹孔內，海綿託架11和包裝好的酶標板2均放在盒體1內。
本發明是一種適用於HPT檢測的酶聯免疫測定試劑盒，它基於免疫反應和酶促反應，能夠檢測轉基因產品中的HPT蛋白表達量，其測定原理是採用雙抗體夾心法來檢測潮黴素磷酸轉移酶HPT，首先將HPT抗體作為包被抗體吸附於固相載體上，經洗滌後，加入待測提取樣品和標樣蛋白，如待檢樣品中有相應抗原存在，即可與包被於固相載體上的特異性抗體結合，經保溫孵育洗滌後，即可加入酶標記特異性抗體，再經孵育洗滌後，加底物顯色進行測定，底物降解的量即為欲測抗原的量。
實施例試劑盒檢測潮黴素磷酸轉移酶HPT的酶聯免疫檢測方法如下一、特異性抗體(HPT多抗)的製備1、抗原製備，GST-HPT融合蛋白表達質粒的構建和蛋白誘導表達(1)將HPT基因構建到pGEX-KG質粒，轉化到BL21表達菌株中，IPTG37℃誘導表達過夜，收集表達菌體；(2)用緩衝液1×PBS，2mM DTT，2mM EDTA，4℃，超聲破胞3分鐘，12,000g離心，取上清液，過柱純化；(3)脫鹽後，收集濾液，加入終濃度為5.0～8.0μg/ml的thrombin酶(sigma公司產品)酶切過夜；(4)接下來將樣品通過GSTrap FF除去GST片斷，收集流出組份；(5)將流出組份通過HiTrap Q HP柱，通過鹽梯度洗脫，收集目標蛋白峰，得到純度為90％以上的純蛋白。
2、免疫動物將2mg HPT純蛋白分四次注射兩隻紐西蘭雄性成年大白兔。第二次加強免疫兩周後耳部靜脈採血用間接ELISA方法進行效價檢測，效價達到要求，進行最後一次加強免疫，兩周後取全皿，待血液凝固、血塊收縮後，於3000rpm離心15min，取上層血清，純化並分裝得到多克隆抗體，保存於-70℃。
3、抗體保存在-70℃凍存，使用時37℃水浴快速解凍，並4℃離心30分鐘後分裝，4℃保存使用兩個星期左右。
二、酶標抗體的製備(用改良過碘酸鈉法將標記蛋白HRP耦聯到純化的兔抗)1、稱取5～8mg HRP溶解於1mL蒸餾水中；2、於上液中加入0.2～0.5mL新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌15～25分鐘；3、將上述溶液裝入透析袋中，用1mM pH4.0～5.0的醋酸鈉緩衝液透析，4℃過夜；4、加20μL 0.2M pH9.5碳酸鹽緩衝液，使以上醛化的HRP的pH升高到9.0～9.5，然後立即加入5～15mg抗體在1ml 0.01M碳酸鹽緩衝液中，室溫避光輕輕攪拌1～3小時；5、加0.1～0.3ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃2小時；6、將上述液裝入透析袋中，對0.15M pH7.0～8.0 PBS透析，4℃過夜；7、經ELISA法測定，標記好的檢測抗體效價為1∶100,000。
三、包被酶標板的製備1、包被抗體用pH8.0～10.0抗體包被緩衝液0.05 M碳酸鹽緩衝液稀釋至3～6μg/mL；2、在酶標板2的每孔加50μL，將酶標板2封好防止蒸發，在37℃孵育過夜；3、甩幹每一板孔並加PBST洗滌液3洗滌，重複3次。每孔加400μL徹底洗滌。要求每步完全移出孔中的液體，將酶標板2中液體移出並將酶標板2在乾淨的紙巾上拍幹；4、然後在酶標板2的每孔中加入300μL 1.0～3.0％BSA溶液封板，37℃至少孵育2小時，可4℃放置2～4天，隨時使用。
四、檢測樣品的前處理1、水樣過濾後即可取樣進行ELISA分析2、植物葉片和根系組織地上部和根系剪成小段，分別放入微型植物試樣粉碎機中，用液氮冷凍後磨粉，裝入封口袋中放入-70℃超低溫冰箱中備用；分別稱取100.0mg已磨好的地上部和根系粉於5mL離心管中，按0.1g∶1mL比例加入1.0mLHPT蛋白提取液(50～100mM Tris-HCl+10％甘油+5～10mMDTT+0.1～0.5％PMSF+0.05～0.2％ Triton X-100)，室溫振蕩1h，15,000g離心，5～10min後取上清，取上清液，重複提取3次，合併上清液，進行ELISA分析。
3、轉基因產品取樣品1.0g磨成粉末後，按上述比例加入1.0mL蛋白提取液，室溫振蕩1h，15,000g離心5min後取上清，重複提取3次，合併上清液，冷凍濃縮後，進行ELISA分析。
五、試劑盒檢測操作過程1、使用樣品稀釋液稀釋標準品HPT(20ng/mL～0.3ng/mL)，樣品和標準液採用同樣的緩衝液製備和稀釋；2、每孔加50μL適當稀釋的標準品/樣品/空白對照，輕輕敲打板子1分鐘，貼上封板膜，37℃孵育2～3小時；3、重複步驟2。每孔加50μL經過適當稀釋的檢測抗體，貼上新的封板膜，37℃孵育2～3小時；4、重複步驟2兩次。每孔加100μL底物反應液，避光，37℃孵育15～30分鐘進行顯色反應；5、每孔加50μL終止液，在15～30分鐘內在酶標儀上測OD450；6、數據分析和計算比較酶標抗體組成的反應系統的檢測效，每次操作時均以不同濃度的HPT蛋白為陽性對照，以BSA蛋白為陰性對照。
權利要求
1.一種檢測潮黴素磷酸轉移酶HPT的酶聯免疫檢測試劑盒，所述試劑盒由盒體構成，在盒體內設置有多孔酶標板和試劑，其特徵在於所述酶標板的每個孔內設有包被抗體，該包被表面由1.0～3.0％牛血清白蛋白封閉，所述試劑有洗滌液、底物稀釋液、HPT蛋白標準液、辣根過氧化物酶標記的二抗、底物、顯色物質和反應終止液。
2.如權利要求1所述的一種檢測潮黴素磷酸轉移酶HPT的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於所說的包被抗體為潮黴素磷酸轉移酶HPT抗體。
3.如權利要求1所述的一種檢測潮黴素磷酸轉移酶HPT的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於所說的抗體緩衝液為碳酸鹽緩衝溶液，由碳酸鈉1.2～2.0g、碳酸氫鈉2.5～3.5g、重蒸水配製而成。
4.如權利要求1所述的一種適用於潮黴素磷酸轉移酶HPT分析的免疫檢測試劑盒，其特徵在於所述的酶標抗體為辣根過氧化物酶兔抗抗體。
5.如權利要求1所述的一種檢測潮黴素磷酸轉移酶HPT的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於所述洗滌液為磷酸鹽緩衝液(簡稱為PBST)由磷酸二氫鉀0.1～0.3g、磷酸氫二鈉2.0～4.0g、氯化鈉6.0～8.0g、氯化鉀0.2～0.4g、Tween-200.5～1.0mL、3.0～6.0mL 0.5M EDTA和重蒸水配製而成。
6.如權利要求1所述的一種檢測潮黴素磷酸轉移酶HPT的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於所述封閉溶液為含1.0～3.0％BSA的溶液。
7.如權利要求1所述的一種檢測潮黴素磷酸轉移酶HPT的酶聯免疫檢測試劑盒，其特徵在於所述底物稀釋液為pH5.5～6.0檸檬酸/醋酸鈉緩衝液，採用醋酸鈉4.0～5.0g、檸檬酸2.0～4.0g和重蒸水配製；所述終止液採用硫酸溶液。
全文摘要
本發明屬於酶聯免疫分析技術領域，特別是涉及一種轉基因產品中潮黴素磷酸轉移酶(Hygromycin phosphotransferase，HPT)的免疫檢測試劑盒及檢測方法。所述試劑盒由盒體構成，在盒體內設置有多孔酶標板和試劑，其特徵在於所述酶標板的每個孔內設有包被，該包被表面由1.0～3.0％牛血清白蛋白封閉，所述試劑有洗滌液、底物稀釋液、HPT蛋白標準液、辣根過氧化物酶標記的二抗、底物和反應終止液；其結構簡單、操作方便、能用於轉基因產品中HPT蛋白的檢測，樣品的前處理過程簡單、耗時少，能同時檢測批量的樣品，樣品檢測成本較低、保存期長、靈敏度高，一次可測定大量樣品的潮黴素磷酸轉移酶酶聯免疫檢測試劑盒，它是一種適用於轉基因產品中HPT蛋白的快速檢測用具。
文檔編號C12Q1/48GK1987467SQ20061015525
公開日2007年6月27日 申請日期2006年12月15日 優先權日2006年12月15日
發明者葉慶富, 汪海燕 申請人:浙江大學