一種微球螢光強度標準物質的定值方法
2023-05-22 22:07:06
一種微球螢光強度標準物質的定值方法
【專利摘要】本發明公開了一種微球螢光強度標準物質的定值方法，其包括如下步驟：(1)製備微球螢光強度標準物質；(2)測定螢光素粉末純度，以備計算配製螢光素標準母液；(3)校準螢光分光光度計，建立儀器螢光響應值與螢光素濃度的校準曲線；(4)測定微球螢光強度標準物質的顆粒數量濃度；(5)測量樣品螢光響應值，計算樣品中的螢光素濃度和每個微球螢光強度標準物質顆粒所攜帶的螢光分子數MESF。本發明定值方法具有良好的準確性、可靠性和量值溯源性。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種標準物質的定值方法，特別是涉及一種微球螢光強度標準物質的 定值方法。 一種微球螢光強度標準物質的定值方法
【背景技術】
[0002] 流式細胞分析（Flow cytometry，FCM)是以高能量雷射照射高速流動狀態下被突 光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發射螢光的強度，從而對細胞（或微 粒）的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態等進行定性或定量檢測的 一種現代細胞分析技術，可對單個細胞準確的定量分析和分類。
[0003] 流式細胞分析在醫學基礎、臨床及科學研究中有著廣泛的應用前景。在流式細胞 儀的絕對定量分析中，採用了定量螢光素分子微球法，在該方法中需要特製的包含有螢光 素分子的微球標準物質，再將包被不同分子數的微球混合，形成含不同數量螢光素分子的 混合微球；在流式細胞儀儀器設置相同的條件下測定此微球標準物質及待測細胞的螢光響 應值，根據微球上的螢光素分子數和與之對應的對數螢光響應值計算回歸方程，得到待測 細胞的生理參數。可以看到，具有特定螢光響應值的微球標準物質是實現此項測量的關鍵 技術標準。目前流式細胞儀被廣泛應用於國內外的臨床醫學檢驗、生物科學研究等重要領 域中，其主要計量性能包括儀器螢光解析度、靈敏度、光路及液流準直行、光電倍增管穩定 性等。上述計量性能的好壞直接影響儀器測量結果的準確與否，在一些臨床實驗室需要對 上述性能參數進行必要的質量控制和評價。目前國內沒有相關的計量標準和檢定規程，無 法保證儀器量值的準確性和可靠性。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種微球螢光強度標準物質的定值方法。
[0005] -種微球螢光強度標準物質的定值方法，包括如下步驟：
[0006] (1)製備微球螢光強度標準物質；
[0007] (2)測定螢光素粉末純度，以備計算配製螢光素標準母液；
[0008] (3)校準突光分光光度計，配製突光素標準母液，建立儀器突光響應值與突光素濃 度的校準曲線；
[0009] (4)測定微球螢光強度標準物質的顆粒數量濃度：用PBS溶液將微球螢光強度標 準物質稀釋得到懸濁液，用移液器吸取所述懸濁液置於網格濾膜上，並進行抽濾，將所述懸 濁液中的顆粒物全部截留於所述網格濾膜上，然後對所述網格濾膜上的顆粒物進行計數， 利用公式I計算得到標準物質的顆粒數量濃度?:
[0010]
【權利要求】
1. 一種微球螢光強度標準物質的定值方法，其特徵在於，包括如下步驟： (1) 製備微球螢光強度標準物質； (2) 測定螢光素粉末純度，以備計算配製螢光素標準母液； (3) 校準螢光分光光度計,配製螢光素標準母液，建立儀器螢光響應值與螢光素濃度的 校準曲線； (4) 測定微球螢光強度標準物質的顆粒數量濃度：用PBS溶液將微球螢光強度標準物 質稀釋得到懸濁液，用移液器吸取所述懸濁液置於網格濾膜上，並進行抽濾，將所述懸濁液 中的顆粒物全部截留於所述網格濾膜上，然後對所述網格濾膜上的顆粒物進行計數，利用 公式I計算得到標準物質的顆粒數量濃度(；： cn =^τκ/ 公式 I CN :微球螢光強度標準物質的顆粒數量濃度，πιΓ1 ; N :顆粒數量計數值； V :移液器吸取懸池液的體積，ml ; f :稀釋倍數； (5) 測量樣品螢光響應值，根據螢光響應值與螢光素濃度的校準曲線得到樣品中的熒 光素濃度，再根據標準物質的顆粒數量濃度CN計算得到每個微球螢光強度標準物質顆粒所 攜帶的螢光分子數MESF。
2. 根據權利要求1所述微球螢光強度標準物質的定值方法，其特徵在於，所述步驟（1) 具體步驟如下： 將異丙醇和蒸餾水按照重量比為〇. 2?2. 0的比例配製成異丙醇水溶液，然後向100g 所述異丙醇水溶液中加入5g?15g醋酸乙烯酯單體，0. 5g?2. 0g聚苯乙烯基批咯燒酮 和0. lg?0. 3g過硫酸鉀，在40°C?80°C條件下反應10h後，在80°C下烘乾得到微球；稱 取4?1(^的所述微球，將其懸浮於30(^質量分數為5%?20%的似0!1甲醇溶液中，在 20°C?80°C條件下水解5h，然後用蒸餾水洗滌，再在80°C下烘乾得到標稱值為7 μ m的表面 攜帶輕基的微球；量取0. lg?5g的所述表面攜帶輕基的微球加入到50ml?1000ml的異 硫氰酸螢光素 FITC緩衝液中，在20°C?50°C下培養3h後用濃度為20mmol/L的PBS溶液 離心洗滌，得到螢光微球，所述離心轉速為5000r/min?15000r/min ;最後將所述螢光微球 分散於l〇〇ml?500ml濃度為20mmol/L的PBS緩衝液中，得到微球螢光強度標準物質，並 用顯微鏡檢驗微球螢光強度標準物質上羥基攜帶情況。
3. 根據權利要求1所述微球螢光強度標準物質的定值方法，其特徵在於，所述步驟（2) 具體步驟如下： 採用定量核磁共振法測定螢光素粉末純度，所述定量核磁共振法的內標為尼泊金乙 酯國家標準物質，測定參數為：激發脈衝角度30°，時間域數據點為32k，掃描寬度為 9615. 385Hz，弛豫延遲32s，累計採樣16次，探頭溫度為298K，濾波寬帶為125kHz，頻率 域數據點為16k。
4. 根據權利要求2或3所述微球螢光強度標準物質的定值方法，其特徵在於，所述步驟 (3)具體步驟如下：校準螢光分光光度計；在25°C條件下配製pH為9. 54,濃度為0. lmol/ L的硼酸緩衝液，準確稱取5. 796mg螢光素粉末溶解於271. 34g所述的硼酸緩衝液中，得到 濃度為58?61 μ mol/kg的螢光素標準母液，再用濃度為20mmol/L的PBS緩衝液將所述 螢光素標準母液稀釋得到6種不同濃度的螢光素標準液，所述6種不同濃度的螢光標準液 濃度分別為：2 X lCT8mol/kg、1 X lCT8mol/kg、5 X lCT9mol/kg、2 X lCT9mol/kg、1 X lCT9mol/kg、 5 X lO^mol/kg，用螢光分光光度計分別測量所述6種不同濃度的螢光標準液的儀器螢光響 應值，以螢光標準液濃度值和儀器螢光響應值分別為X軸和Y軸，建立儀器螢光響應值與熒 光素濃度的校準曲線。
5. 根據權利要求1所述微球螢光強度標準物質的定值方法，其特徵在於，所述步驟（4) 具體步驟如下：用濃度為20mmol/L的PBS溶液將微球螢光強度標準物質稀釋10?1000 倍，得到懸濁液，用移液器吸取體積為〇. 2ml?5ml的所述懸濁液置於0. 1 μ m的網格濾膜 上，並進行抽濾，所述抽濾抽氣流速為lL/min?10L/min，將所述懸濁液中的顆粒物全部截 留於所述網格濾膜上，然後將帶有顆粒物的網格濾膜置於光學顯微鏡載物臺上，逐格進行 成像，並對顆粒數量進行計數，利用公式I計算得到標準物質的顆粒數量濃度?。
6. 根據權利要求5所述微球螢光強度標準物質的定值方法，其特徵在於，所述步驟（5) 具體步驟如下：用20mmol/L的PBS緩衝液將所述微球螢光強度標準物質稀釋至2 X 105個/ ml?2X 106個/ml，用校準後的螢光分光光度計測量所述稀釋後微球螢光強度標準物質的 螢光響應值，再根據儀器螢光響應值與螢光素濃度的校準曲線，得到所述微球螢光強度標 準物質的螢光素濃度C E ;最後根據公式II計算出所述微球螢光強度標準物質中每個顆粒攜 帶的螢光分子數MESF :
CE :根據校準曲線，得到的微球螢光強度標準物質的螢光素濃度，mol/kg ; CN :微球螢光強度標準物質的顆粒數量濃度，ml'
【文檔編號】G01N15/06GK104101586SQ201410352524
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月23日 優先權日:2014年7月23日
【發明者】劉俊傑, 修宏宇, 張偉 申請人:中國計量科學研究院