一種利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法
2023-05-19 22:01:51
一種利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，在柳枝稷第4個節完全露出時，取柳枝稷幼穗作為誘導外植體；將外植體消毒後，在兩端各切下0.5cm，並縱向將外植體切為兩半，切面向下接種到誘導培養基上；30～40天後獲得穗芽，對獲得的穗芽進行繼代培養，進一步擴大穗芽的數量；將繼代後的穗芽從芽塊分離成單個個體種植到培養基質中，約7天後即可生根，發育成為新的植株，此時可將幼苗連同培養基質栽植於溫室或大田。本發明中的無性繁殖方法，以柳枝稷幼穗為外植體，通過誘導及繼代培養，能夠獲得大量基因型完全一致的後代。
【專利說明】一種利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於柳枝稷組織培養【技術領域】，涉及一種柳枝稷無性繁殖的方法。
【背景技術】
[0002]柳枝稷(英文名Switchgrass,拉丁名Panicum virgatum Linn)為禾本科黍屬多年生草本植物，原生於北美地區，具有栽培簡單、抗逆性強、生物學產量高等特點。20世紀80年代，柳枝稷被確定為模式生物能源植物，並於20世紀90年代被我國科研工作者引入國內。在化石燃料日益緊缺的今天，人們對柳枝稷的研究愈加重視，近幾年來，國際上公開發表的關於柳枝稷的科研論文每年都超過300篇。
[0003]柳枝稷為異花授粉植物，具有很強的自花不親和性，因此，有性繁殖獲得的後代個體基因型多數存在差異。與有性繁殖方式相比，無性繁殖是由植物營養器官直接發育成新個體的過程，整個過程不涉及染色體的分離和重組，所產生的後代與親本具有完全一致的基因型，在柳枝稷優良基因型保持及生物技術研究過程中具有重要的意義。
【發明內容】
[0004]本發明解決的問題在於提供一種直接將柳枝稷幼穗誘導成穗芽的方法，該方法涉及植物器官逆向發育過程，為柳枝稷無性繁殖提供一條新的途徑。
[0005]本發明是通過以下技術方案來實現:
[0006]一種利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，包括以下操作:
[0007]1)待柳枝稷生長發育至第4個節完全露出、幼穗已形成時，從靠近地面處將柳枝稷分櫱剪下，從下向上剝去柳枝稷分櫱上的葉片至節間長度小於Icm時停止，距該節間上端莖節上下各1.2~1.5cm切下，獲得包含幼穗的外植體；
[0008]2)將外植體消毒並用無菌水漂洗；
[0009]3)無菌環境下，將外植體兩端各切去0.2~0.5cm,將外植體縱向切為兩半，切口向下接種到誘導培養基上；接種後置於恆溫光照培養箱中，培養30~40天至穗芽形成；
[0010]所述的誘導培養基是以MS為基礎培養基，並添加6-BA、瓊脂粉和蔗糖；
[0011]4)將形成的穗芽沿基部2~3mm處切除，並再次接種到誘導培養基上，待新生芽生長至1.2~1.5cm，重複繼代培養3~4次，獲得擴繁後的穗芽；
[0012]5)在不損害生長點的情況下，將穗芽從基部自芽塊上拆分下來，將穗芽單獨直接扦插到培養基質中，培養7天後，待單獨的穗芽生根並發育成獨立的幼苗，將幼苗連同培養基質栽植於溫室或大田。
[0013]所述的外植體中包含有2cm左右長度的幼穗，具有正常花原基組織。
[0014]所述的外植體的消毒處理為:先用體積分數為70%的酒精消毒I~2min，然後用體積分數5~8%的次氯酸鈉溶液消毒2~3min ；
[0015]消毒完成後並用滅菌水漂洗3次。
[0016]所述的誘導培養基的成分為:MS基礎培養基4.43g/L，3mmol/L的6_BA、7.5g/L的瓊脂粉和30g/L的蔗糖。
[0017]所述在恆溫光照培養箱進行培養時，其培養溫度為20~25°C、每天光照20h、黑夜4h0
[0018]所述，在進行繼代培養時，採用上次培養的新生芽進行接種，接種時新生芽的長度為 1.0cm。
[0019]以體積比計，所述的培養基質的組份為栽培土:腐葉土:河沙=I:3:1，栽植前一天在基質中加水，直到吸水飽和。
[0020]所述的幼苗為相同基因型的幼苗。
[0021]本發明提出的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，是一種以柳枝稷幼穗為外植體進行無性繁殖的方法，其基於高的可操作性和重複性的植物組織培養技術為基礎，再通過涉及植物器官發育調控的柳枝稷幼穗誘導穗芽培養，可以將正常條件下發育成花的花原基組織最終誘導成穗芽，以體外培養的方式最終誘導成穗芽(即由幼穗誘導形成的再生芽)，從而獲得基因型完全一致的後代。本發明所提出的柳枝稷幼穗誘導穗芽的過程，將正常條件下發育成花的花原基組織最終誘導成穗芽，通過該方法這種植物器官逆向發育現象可能為植物器官發育研究提供一條新的思路。
[0022]本發明提供的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，以柳枝稷幼穗為材料，通過組織培養技術，最終可獲得較大規模的穗芽，並取得良好的繁殖效果；與已有的柳枝稷無性繁殖方法相比，本發明拓寬了柳枝稷無性繁殖材料範圍，為快速獲得大量基因型一致後代提供了新的方法。
[0023]本發明提供的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法誘導再生效率高，每個單獨的幼穗一次培養可以誘導出穗芽30個左右，經繼代培養可誘導100個以上。對於分櫱數目本身較多的柳枝稷來講，單株增殖效率可以達到幾千倍。
[0024]本方法提供的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法所使用的外植體材料為柳枝稷幼穗，這在之前是未報導過的，拓寬了柳枝稷無性繁殖外植體材料的選擇範圍。
[0025]本方法提供的柳枝稷幼穗誘導穗芽方法與已有的柳枝稷組織培養途徑獲得再生芽方法相比，首次誘導所得基數更大，可以有效減少繼代次數，從而使再生芽誘導成本進一步降低。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026]圖1為柳枝稷幼穗誘導前的形態；
[0027]圖2為由柳枝稷幼穗誘導的穗芽；
[0028]圖3為栽植前的柳枝稷穗芽。
【具體實施方式】
[0029]下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0030]本發明提供的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，通過對柳枝稷幼穗進行體外誘導進行無性繁殖，繁殖效果良好，具有材料新穎，增殖效率高，成本低等特點。下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0031]參見圖1~圖3，一種利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，包括以下操作:
[0032]I)選擇適宜生長期的誘導外植體材料
[0033]a.柳枝稷生長發育至第4個節完全露出時取材為宜，此時幼穗已有2cm左右。
[0034]b.從靠近地面處將柳枝稷分櫱剪下，保證所需材料部位無損害。
[0035]c.從下向上剝去柳枝稷分櫱上的葉片，在靠近頂端幼穗時，節間越來越短，當發現節間長度小於Icm時停止，距該節間上端莖節上下各1.2~1.5cm切下，即為誘導外植體(內已含2cm左右長度的幼穗，具有正常花原基組織)。
[0036]2)外植體消毒
[0037]a.將外植體置於滅菌空培養皿中，加入體積分數為70%的酒精消毒Imin.
[0038]b.用體積分數為8%的次氯酸鈉溶液(有效氯0.5% )消毒3min，期間輕輕搖動.
[0039]c.用滅菌水漂洗3次。
[0040]3)接種及誘導
[0041]a.用無菌鑷子和手術刀將兩端各切去0.5cm左右,然後將外植體縱向切為兩半，切口向下接種到誘導培養基上。
[0042]b.誘導培養基成分為MS基礎培養基(Murashige and Skoog Basal Medium,美國Sigma公司生產)4.43g/L添加3mmol/L的6-BA (6-苄基腺嘌呤)、7.5g/L的瓊脂粉、30g/L的蔗糖。
[0043]c.接種後將培養皿置於恆溫光照培養箱中，培養條件為溫度25°C、每天光照20h、黑夜4h。30~40天後，穗芽逐漸形成。
[0044]4)繼代擴大培養
[0045]a.將誘導出已生長至0.5~1.5cm的穗芽沿基部2~3mm切除。
[0046]b.將處理後的穗芽再次接種到誘導培養基上。
[0047]c.待新生芽生長至1.2~1.5cm，重複切除培養3~4次，獲得大量的穗芽。
[0048]5)栽植
[0049]a.準備培養基質，以體積比計，具體成分為栽培土 2份，腐葉土 6份，河沙2份。
[0050]b.將穗芽塊分離成單獨的穗芽，直接扦插到預先準備好的培養基質中。7天左右每一個單獨的穗芽均已生根，並將生長發育成一棵獨立的幼苗。將幼苗連同培養基質栽植於溫室或大田。
[0051]藉此，可以大規模培養獲得具有相同基因型的柳枝稷幼苗。
[0052]實施例:
[0053]柳枝稷栽培品種Alamo利用幼穗無性繁殖的方法，包括以下操作:
[0054]I)選擇適宜生長期的誘導外植體材料
[0055]a.在溫室裡選擇第4個節完全露出的Alamo分櫱，從靠近地面處剪下。
[0056]b.從下向上剝去柳枝稷分櫱上的葉片，在靠近頂端幼穗時，節間越來越短，當發現節間長度小於Icm時停止，距該節間上端莖節上下各1.5cm切下，即為外植體(內已含2cm左右長度的幼穗，具有正常花原基組織)。
[0057]2)外植體消毒
[0058]a.將外植體置於滅菌空培養皿中，加入體積分數為70%的酒精消毒Imin.
[0059]b.用8%的次氯酸鈉消毒3min，期間輕輕搖動.
[0060]c.用滅菌水漂洗3次。
[0061]3)接種及誘導
[0062]a.用無菌鑷子和手術刀將兩端各切去0.5cm左右，然後在中心位置將外植體縱向切為兩半，切口向下接種到誘導培養基上。
[0063]b.誘導培養基成分為MS基礎培養基(Murashige and Skoog Basal Medium,美國Sigma公司生產)4.43g/L添加3mmol/L的6_BA、7.5g/L的瓊脂粉、30g/L的鹿糖。
[0064]c.接種後將培養皿置於恆溫光照培養箱中，培養條件為溫度25°C，每天光照20h、黑夜4h。30~40天後，穗芽逐漸形成。
[0065]4)繼代擴大培養
[0066]a.將誘導出已生長至0.5~1.5cm的穗芽沿基部2~3mm切除。
[0067]b.將處理後的穗芽再次接種到誘導培養基上。
[0068]c.重複切除培養3~4次，獲得大量的穗芽。
[0069]5)栽植
[0070]a.準備培養基質，具體成分為栽培土 2份，腐葉土 6份，河沙2份。
[0071]b.將穗芽塊分離成單獨的穗芽，直接扦插到預先準備好的培養基質中。7天左右每一個單獨的穗芽均已生根，並將生長發育成一棵棵獨立的幼苗。將每棵幼苗連同培養基質栽植於溫室或大田。
【權利要求】
1.一種利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，其特徵在於，包括以下操作: 1)待柳枝稷生長發育至第4個節完全露出、幼穗已形成時，從靠近地面處將柳枝稷分櫱剪下，從下向上剝去柳枝稷分櫱上的葉片至節間長度小於Icm時停止，距該節間上端莖節上下各1.2~1.5cm切下，獲得包含幼穗的外植體； 2)將外植體消毒並用無菌水漂洗； 3)無菌環境下，將外植體兩端各切去0.2~0.5cm,將外植體縱向切為兩半,切口向下接種到誘導培養基上；接種後置於恆溫光照培養箱中，培養30~40天至穗芽形成； 所述的誘導培養基是以MS為基礎培養基，並添加6-BA、瓊脂粉和蔗糖； 4)將形成的穗芽沿基部2~3_處切除，並再次接種到誘導培養基上，待新生芽生長至1.2~1.5cm，重複繼代培養3~4次，獲得擴繁後的穗芽； 5)在不損害生長點的情況下，將穗芽從基部自芽塊上拆分下來，將穗芽單獨直接扦插到培養基質中，培養7天後，待單獨的穗芽生根並發育成獨立的幼苗，將幼苗連同培養基質栽植於溫室或大田。
2.如權利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，其特徵在於，所述的外植體中包含有2cm左右長度的幼穗，具有正常花原基組織。
3.如權利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，其特徵在於，所述的外植體的消毒處理為:先 用體積分數為70%的酒精消毒I~2min，然後用體積分數5~8%的次氯酸鈉溶液消毒2~3min ； 消毒完成後並用滅菌水漂洗3次。
4.如權利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，其特徵在於，所述的誘導培養基的成分為:MS基礎培養基4.43g/L，3mmol/L的6_BA、7.5g/L的瓊脂粉和30g/L的蔗糖。
5.如權利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，其特徵在於，所述在恆溫光照培養箱進行培養時，其培養溫度為20~25°C、每天光照20h、黑夜4h。
6.如權利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，其特徵在於，在進行繼代培養時，採用上次培養的新生芽進行接種，接種時新生芽的長度為1.0cm0
7.如權利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，其特徵在於，以體積比計，所述的培養基質的組份為栽培土:腐葉土:河沙=I:3:1，栽植如一天在基質中加水，直到吸水飽和。
8.如權利要求1所述的利用柳枝稷幼穗進行無性繁殖的方法，其特徵在於，所述的幼苗為相同基因型的幼苗。
【文檔編號】A01H4/00GK104067934SQ201410249960
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】奚亞軍, 王勇鋒, 李毛 申請人:西北農林科技大學