在動物中促進生長的活體細菌的應用的製作方法
2023-07-18 10:37:31
專利名稱：在動物中促進生長的活體細菌的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物生長促進領域。尤其是，本發明涉及了表達F4(或K88)附著因子的非致病大腸桿菌菌株的應用，用以促進動物生長或在一群動物實現均一化生長。
背景技術：
對於農業和飼養業專家來說生長促進是至關重要的課題，在屠宰前或為了研究目的他們主要是尋找健康動物的優化生產。在產肉動物的情況下，這種關注引導他們使用對動物以及對人體都是有益的生長促進產品。在農業和飼養環境中的主要應該注意的是體重丟失、伴生疾病反覆發作的低生長速率、藥物成本和死亡率，其引起了動物產量的降低和最終導致可觀的經濟損失。這種情形中，斷奶後或孵化後動物特別容易受到阻止生長試劑的攻擊。例如，由非衛生條件或者動物間過度親近而導致的傳染是導致上述結果的最普遍因素。用於解決這種問題的常規方法是在飼料中使用抗生素生長促進劑。但是，抗生素生長促進劑的使用也有很大的爭議，因為眾所周知，即使使用亞治療劑量，抗生素的持續使用也可以導致在接受處理的動物中對抗生素抗性菌菌株的篩選(Arnold S等人;WegenerHC等人和Schwarz S等人)。事實上，最近十年，已經出現了致病性更強的和抗生素-抗性更強的大腸桿菌菌株，和/或管理的改變(較早斷奶)，和/或一些新的歐洲規章，其禁止將抗菌劑作為生長促進劑或者進行預防處理(疾病的預防)以及禁止使用高水平的重金屬，如飼料中的氧化鋅的使用。在動物生產中斷奶時期與高抗生素的使用特別相關。因此，由於抗生素抗性的復發和對抗生素殘餘的過敏反應，以及對耕地土壤的汙染，目前越來越限制抗生素生長促進劑和重金屬的使用。另一個農業和飼養專家必須面對的問題是一群動物中生長的不均一性。尤其是，在以優化肉產品為目的時，例如，農民希望生產出一致的動物群，其在屠宰前顯示最大的均一化生長速率可能性，以避免增加成本。但是，動物一般表現出不同的生長速率並且尤其對感染劑表現出不同的易受攻擊性。因此，就不斷需要創新藥劑，其促進動物生長並且進一步有利於對動物生長的均一化和優化作出貢獻。
發明內容
本發明的一個目的是有效量的F4+非致病大腸桿菌菌株促進動物生長的應用。本發明的另一個目的是有效量的F4+非致病大腸桿菌菌株在一群動物實現均一化生長的應用。
本發明進一步的目的是提供一種促進動物生長的方法，所述方法包括向所述動物餵養有效量的F4+非致病大腸桿菌菌株的步驟。本發明的另外一個目的是提供在一群動物中實現均一化生長的方法，所述方法包括向所述動物餵養有效量的F4+非致病大腸桿菌菌株的步驟。由於F4+非致病大腸桿菌菌株的使用，本發明發現一個對特別需要動物的快速生長促進和生長均一化的有利之處。例如，F4+非致病大腸桿菌菌株在產肉動物飼養中的使用，與沒有進行處理的對照相比，其可使這些動物在較短的時間內達到市場體重或屠宰體重。本發明進一步發現一種促進實驗室動物(例如，大鼠和小鼠)生長和均一化生長的有利之處。如可以理解的，使這些實驗動物更快地和更均一地達到了給定體重，優選提供了更為均一化和更容易獲得的動物樣品本發明的另一個有利之處是沒有藉助抗生素用於促進動物生長。所以，對於特別影響斷奶後動物的諸如抗生素抗性細菌菌株或者抗生素過敏所引發的問題就被緩解了。另外，既然重金屬如氧化鋅沒有被添加到動物的飼料中，土壤的汙染也避免了。換言之，本發明還提供了環保的應用和方法。通過本發明方法獲得的改進的飼料轉化效率，使處理的動物可以在消耗更少食物的情況下達到任意所需的體重(與沒有處理的動物達到相同的體重相比)。另外，當實行本發明中方法的時候，在經處理的動物中既沒有發現毒副作用也沒有發現細菌引起的一般健康狀況的降低。本發明和它的有利之處可以參照附圖，通過閱讀下述優選實施方案的非限定性說明來更好的理解。
圖1顯示的是根據本發明所用的優選F4+非致病大腸桿菌菌株的基因組DNA的Xbal-消化的脈衝-電場凝膠電泳圖的照片。優選的菌株是coliPROtec菌株。圖2顯示的是在用F4+大腸桿菌菌株處理後每個階段豬的體重增加的百分比的圖。圖3顯示的是在用F4+大腸桿菌菌株處理後每個階段小鼠的體重增加的百分比的圖。
具體實施例方式本發明源自F4+非致病大腸桿菌菌株的新的應用。更特別地並且根據第一方面，本發明涉及有效量的F4+非致病大腸桿菌菌株以促進動物生長的應用。根據第二方面，本發明涉及有效量的F4+非致病大腸桿菌菌株在一群動物中實現均一化生長的應用。根據相關方面，本發明涉及促進動物生長的方法和在一群動物中實現均一化生長的方法。兩種方法包括使用有效量的F4+非致病大腸桿菌菌株來餵養動物的步驟。本發明所用菌株的特徵在於它表達附著因子F4，它是非致病的。根據本發明優選的方面，F4+非致病大腸桿菌菌株選自coliPROtec (保藏號IDAC210105-01)，JG1329，M226，P03-7586(175)或pMK005。更優選，本發明構思了使用coliPROtec菌株和/或它的突變體或變異體(詳細情況參見實施例1)。這裡所用的術語coliPROtec菌株的「突變體」和「變異體」被用作菌株，其具有coliPROtec菌株的所有識別特徵，如實施例1所提供的。突變體或者變異菌株可因具有其基因組或者它的一部分被鑑別，其在高嚴謹條件下可以與coliPROtec菌株的基因組雜交。根據本發明上面所提及的方案，上面所說明的菌株以「有效量」來使用。這種「有效量」的描述，它應該被理解為F4+非致病大腸桿菌菌株的如下量，例如，其能夠引起研究者或獸醫所涉及的組織、系統或動物的生物學反應。換言之，這種F4+非致病大腸桿菌菌株的有效量，其足以促進動物生長以及在一群動物中實現均一化生長。應該理解，本發明構思的菌株的優選有效量是每個動物中至少大約5e7菌落形成單位(CFU)，並且更優選範圍是從大約5e7至大約5e9CFU的目標菌株。「大約」的意思是所述菌株CFU值可以在一個特定的範圍內變化，其依賴於評價這種菌株CFU數值所用的方法的誤差範圍。所用的有效量可以根據許多因素的而變化，例如，動物的類型，動物初始體重，動物的生長階段，環境如動物設施，類型和生產管理，設施的衛生條件，斷奶或孵化後的應激，所用的飼料和添加劑，動物的健康和伴生疾病或處理，是應當考慮的因素。如上面所提到的，生長促進和生長均一化的目標被在動物中實現了。如這裡所用的，術語「動物」是指任意適用於本發明的年輕的或成年的動物。更優選，術語「動物」是指斷奶後或孵化後的動物。既然在斷奶後動物或孵化後動物中，母體餵養和關照不再存在，所以生長促進劑是極其重要的。例如，在為了肉而對動物進行餵養的情況下，這種關注是特別重要的。在本發明的上下文中，所用的優選的動物可以是下面的任何一種農場動物如豬以及優選是斷奶後的豬；家禽如雞，鴨，鵝，母雞或火雞，優選是小雞，以及更優選是肉雞；牛如母牛，閹牛，公牛或小牛；比賽動物如鴕鳥或野牛；馴化動物，如貓或狗；以及實驗室動物，如小鼠或大鼠。當然這些動物的特徵都在於生長促進和生長均一化是期望的特徵，尤其當以肉生產為目標的時候。按照上面的觀點，可以理解動物實際上可在整個生長過程中接受本發明的菌株，或者只在生長階段的一部分時間中，例如早期階段和/或準備屠宰的階段中接受。根據本發明優選的方面，斷奶後動物優選是豬，優選在實驗開始的時候是從大約10天至大約28日齡。目標豬更優選是17日齡。根據本發明的另一個優選的方案，斷奶後動物優選是小鼠，優選在實驗開始的時候是從大約18天至大約28日齡。目標小鼠更優選是21日齡。根據本發明的另一個優選的方面，孵化後動物優選是小雞，優選在實驗開始的時候是從大約I天至大約7日齡。目標小雞更優選是I日齡。可以理解表述「大約I日齡」意思是出生或孵化後24小時或更少。根據本發明優選的方面，可以提供給豬的有效量範圍優選是從5e7至5e9CFU/豬，以及更優選大約1E9CFU/豬。根據本發明另一個優選的方面，可以提供給小雞的有效量範圍從大約5々至5e9CFU/小雞，以及更優選大約5e8CFU/小雞。根據本發明又一個優選的方面，可以提供給小鼠的有效量範圍從大約5々至5e9CFU/小鼠，以及更優選大約5e8CFU/小鼠。在本發明方法的具體上下文中，菌株的有效量可以以單劑量形式餵養動物，或者根據攝生法提供，只要其是有效的。術語「餵養」，應該被理解為將本發明的F4+非致病大腸桿菌提供給處理中的動物，從而菌株可以最終到達腸胃道，以及更優選是腸道。例如，按照本發明優選的方面，餵養可以通過向目標動物口服餵養菌株來實現。根據本發明的優選方面，菌株優選以凍幹形式餵養動物。根據另一個優選方案，本發明的菌株用稀釋劑或載體稀釋或懸浮。根據本發明，F4+非致病大腸桿菌菌株用作在動物中「促進生長」或者「在一群動物中實現均一化生長」。這些表述是指使用大腸桿菌菌株以增加動物生長速率。換言之，目標菌株一經處理，與未處理的對照相比，動物體重增加地更快並且更均一化。更特別地是，表述「均一化生長」，在本發明的上下文中是指對一群動物生長速率的相對控制。這種控制在動物飼養和產肉領域中負有特定的目的，其中給定組中的所有動物通過傳統量的飼料以及無毒性生長促進劑必須理想地，在整群動物中以及相對相等的時間內更快達到它們的生長峰值。當這些條件都達到時,飼養成本、屠宰成本和運輸成本全部可以被優化。為了評價生長促進和生長的均一化，可測定本領域內已知的大量參數。更特別的是，這些參數，單獨評價或者聯合評價，其可以包括i_平均體重(MBW):—組動物中體重的平均值；i1-平均日增重(DWG):在特定的時期內，每組動物每天體重增加的平均值；iii_飼料攝入(FI):在特定的時期內每個動物或每組動物的飼料消耗量；和iv_飼料轉化率(FCR):特定時期內每種動物或每組動物的飼料攝入/相同時期內相同動物或相同組動物的體重增加。有利地，本發明的菌株可以單獨使用或與飼料可接受載體結合使用。如這裡所使用的，表述「飼料可接受載體」是指任意的載體、稀釋劑或賦形劑，其與本發明菌株是相容的並且提供給動物時沒有負作用。在本領域中已知的合適飼料可接受載體包括，但是不限於，水、鹽、葡萄糖、右旋糖或緩衝溶液。這種載體有利地對菌株是無毒的並且對動物是無害的。它也可以是生物可降解的。本領域的技術人員知道如何選擇合適的載體，例如對於環境是無害的載體。也優選，這種載體是適當的固體或液體的飼料可接受載體。合適的固體飼料可接受載體是無毒的可吸收載體。例如，這種固體飼料可接受載體可以是一種普通的固體飼料，例如典型動物飲食中的組分，包括穀物產品，例如大麥粉、玉米粉或小麥飼料，堅果和種子產品，例如剝皮破碎堅果餅或棉籽餅，或提取的棉籽餅，與少量的例如羽粉、海藻粉、骨粉，骨質麵粉(bone flour)，化石粉，鹽、尿素和維生素一起；或者它也可以是惰性的沒有營養價值的固體稀釋劑或載體，例如高嶺土、雲母、碳酸鈣、漂白土、活性白土、碾碎的牡蠣貝殼或碾碎的石灰石；或者它也可以是澱粉或乳糖。適合的飼料可接受載體是，例如，水以及優選為飲用水；牛奶例如全乳或脫脂乳；或者胰酶大豆肉湯(TSB)。下面的實施例說明了本發明的廣闊的潛在應用，並且不試圖限制其範圍。這裡在不背離本發明的精神和範圍的情況下可以進行修飾和改變。雖然那些與這裡所描述的相似或相等的任意方法和原料也可以應用到測試本發明的實際中，但是這裡描述了優選的方法和原料裝置實施例
實施例實施例1 :大腸桿菌菌株(coliPROtec)及其克隆的說明根據本發明的優選特徵，使用F4+非致病大腸桿菌菌株(下文中稱coliPROtec或JFF4菌株)。ColiPROtec菌株於2005年I月21日保藏在加拿大國際保藏單位(International Depositary Authorityof Canada)(IDAC),給予的保藏號是 IDAC210105-01。1.來源該菌株是從健康豬的糞便中，由加拿大魁北克省Saint-Hyacinthe,蒙特婁大學，獸醫系的大腸杆·菌實驗室分離出來的。動物是從位於加拿大魁北克省Monteregie的當地農場購買的。2.菌株的穩定性coliPROtec菌株的F4菌毛(免疫原蛋白)的表達利用體外途徑進行穩定。進行三(3)個連續IOL的發酵。每次發酵完成以後，培養液被接種在瓊脂上，並且使用玻片凝集測試針對F4菌毛表達進行10個菌落的檢測。合併來自F4+菌落的細菌並且用於連續發酵。囷株然後被凍結在加入了 20%甘油的膜酶大 肉湯(TSB)中。融化後，囷株的F4表達不總是穩定，並且需要幾個連續發酵(大約10次)以得到穩定的菌株。在從豬中提取後經歷大約15次傳代之後穩定菌株被凍幹。凍幹的培養物被用於產生coliPROtec的主要種子。3.生化分析菌株的鑑定使用API系統進行。獲得的鑑定編碼5544572被認為是大腸桿菌菌株。4.致病分型coliPROtec菌株的致病分型通過菌落雜交和/或聚合酶鏈式反應(PCR)進行。致病分型結果顯示coliPROtec菌株對F4是陽性的，而對下列毒素是陰性的LT, STa, STb, STaH, Stxl，Stx2, VT2Vpl, VT2Vh, Aero, Tsh, CDT3, CDT4, CNF1，CNF2，HlyA, HlyC, Ehx, Eastl0另外，coliPROtec菌株對下列粘著素或推定粘著素是陰性的F5, F6, F18, F41，F17，P 菌毛，AIDA, AFA, SFA, CS31a, daaE, Paa, aggR, ARF/1, Eae,CFAI，CFAII (CSlcoo)，CFAII (CS3cst)。5. DNA指紋圖譜coliPROtec菌株通過脈衝_電場凝膠電泳來表徵(圖1)。通過反覆體外傳代，選擇F4菌毛表達在發酵後穩定之特殊的菌株克隆。6.表格和數據表的概述下面試驗所用到的菌株在下面的表I和數據表詳細說明。表IF4+非致病性野生型大腸桿菌菌株
權利要求
1.有效量的F4+非致病大腸桿菌菌株在動物中促進生長的應用。
2.根據權利要求1的應用，其中所述F4+非致病大腸桿菌菌株與飼料可接受載體結合。
3.根據權利要求2的應用，其中所述飼料可接受載體是普通的固體飼料。
4.根據權利要求2的應用，其中所述飼料可接受載體是水。
5.根據權利要求2的應用，其中所述飼料可接受載體是牛奶。
6.根據權利要求1至5中的任一項應用，其中所述有效量是每隻動物至少5X107CFU的F4+非致病大腸桿菌菌株。
7.根據權利要求6的應用，其中有效量範圍是在每隻動物中從5X107至5X109CFU的F4+非致病大腸桿菌菌株。
8.根據權利要求1至7中的任一項應用，其中F4+非致病大腸桿菌菌株由2005年I月21日保藏在加拿大國際保藏單位(IDAC)的大腸桿菌菌株，保藏號IDAC 210105-01組成。
9.根據權利要求1至8中的任一項應用，其中所述動物或多個動物選自斷奶後動物和孵化後動物。
10.根據權利要求9的應用，其中所述斷奶後動物是10日至28日齡。
11.根據權利要求9的應用，其中所述孵化後動物是I日至7日齡。
12.根據權利要求9或10的應用，其中所述斷奶後動物是豬。
13.根據權利要求9或10的應用，其中所述斷奶後動物是小鼠。
14.根據權利要求9或10的應用，其中所述孵化後動物是家禽。
15.根據權利要求14的應用，其中所述家禽是小雞。
16.在動物中促進生長的方法，所述方法包括用有效量的F4+非致病大腸桿菌菌株餵養所述動物的步驟。
17.根據權利要求16的方法，其中所述動物被口服餵養。
18.根據權利要求16或17的方法，其中所述F4+非致病大腸桿菌菌株結合飼料可接受載體。
19.根據權利要求18的方法，其中所述飼料可接收載體是普通的固體飼料。
20.根據權利要求18的方法，其中所述飼料可接收載體是水。
21.根據權利要求18的方法，其中所述飼料可接收載體是牛奶。
22.根據權利要求16至21中的任一項的方法，其中所述有效量是每隻動物至少5X107CFU的F4+非致病大腸桿菌菌株。
23.根據權利要求21的方法，其中有效量的範圍是每隻動物從5X107至5X109CFU的F4+非致病大腸桿菌菌株。
24.根據權利要求16至23中的任一項的方法，其中F4+非致病大腸桿菌菌株由2005年I月21日保藏在加拿大國際保藏單位(IDAC)的大腸桿菌菌株，保藏號IDAC 210105-01組成。
25.根據權利要求16至24中的任一項的方法，其中所述動物選自斷奶後動物和孵化後動物。
26.根據權利要求25的方法，其中所述斷奶後動物是10日至28日齡。
27.根據權利要求25的方法，其中所述孵化後動物是I日至7日齡。
28.根據權利要求25或26的方法，其中所述斷奶後動物是豬。
29.根據權利要求25或26的方法，其中所述斷奶後動物是小鼠。
30.根據權利要求25或27的方法，其中所述孵化後動物是家禽。
31.根據權利要求30的方法，其中所述家禽是小雞。
32.在動物中促進生長的F4+非致病大腸桿菌菌株，其於2005年I月21日保藏在加拿大國際保藏單位(IDAC)，保藏號為IDAC 210105-01。
33.根據權利要求32的F4+非致病大腸桿菌菌株，其與飼料可接受載體結合。
34.根據權利要求16-24中的任一項的方法，其中所述F4+非致病大腸桿菌菌株促進日增重。
35.根據權利要求16-24中的任一項的方法，其中所述F4+非致病大腸桿菌菌株促進體重增加同時降低飼料攝入。
36.根據權利要求16-24中的任一項的方法，其中所述F4+非致病大腸桿菌菌株在動物生長階段期間餵養給動物並且降低動物獲得所需體重所需要的延遲。
37.根據權利要求1-8中的任一項的應用，其中所述F4+非致病大腸桿菌菌株促進日增重。
38.根據權利要求1-8中的任一項的應用，其中所述F4+非致病大腸桿菌菌株促進體重增加同時降低飼料攝入。
39.根據權利要求1-8中的任一項的應用，其中所述F4+非致病大腸桿菌菌株在動物生長階段期間餵養給動物並且降低動物獲得所需體重所需要的延遲。
全文摘要
本發明涉及F4+非致病大腸桿菌菌株在動物中促進生長的應用。本發明還涉及了這些菌株在一群動物中實現均一化生長的應用。尤其是，本發明的目的動物是那些以生長促進或生長均一化為所需目標的動物，如為了產肉而進行的動物飼養。本發明進一步涉及了促進動物生長的方法以及在一群動物中實現均一化生長的方法。
文檔編號A23K1/18GK103039712SQ201210237479
公開日2013年4月17日 申請日期2005年2月3日 優先權日2004年2月3日
發明者E·納多, J·M·費爾布拉澤 申請人:增值研究合夥有限公司