伏馬毒素b1核酸適體及其應用的製作方法
2023-05-21 22:33:11 1
專利名稱：伏馬毒素b1核酸適體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及利用分子生物學技術----SELEX技術設計和製備一種與伏馬毒素Bl高特異性和高親和力結合的伏馬毒素Bl核酸適體及其應用。
背景技術：
伏馬毒素(Fumoni sins，FB)主要是由真菌 F. moniliforme 禾口 F. proliferatum產生的次級代謝產物，為多氫醇和丙三羧酸的雙酯化合物，其存在範圍很廣，從粟到穀物到香蕉等水果均可被汙染，並存在於加工、貯存、運輸等各個環節中，通過糧食加工、飼料生產等過程對畜牧業乃至人類健康產生較嚴重的危害。伏馬毒素主要包括伏馬菌素B1、B2和B3， 其中60%以上為伏馬毒素Bl (FBI)，FBl是毒性最強的伏馬毒素，於1988年由南非和美國的研究人員首次從黴變的玉米中分離得到。馬是對伏馬菌毒素最敏感的動物，伏馬菌毒素中毒症有馬腦白質軟化病、豬肺水腫病、禽高死亡率或有毒飼料綜合症等，此外，伏馬菌素還表現出促癌活性。由於伏馬菌毒素對動物和人類健康均存在嚴重的影響，通常是食品和飼料業主要擔心的真菌毒素。伏馬菌素的檢測方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、薄層層析法 (TLC)、液相一質譜聯用(LC-MQ、毛細管電泳法、酶聯免疫(ELISA)等。前述這些方法雖具有較高的靈敏性和特異性，但需要複雜的淨化提純步驟和較貴重的儀器設備，不易推廣使用；基於單克隆抗體或多克隆抗體的ELISA檢測技術具有簡單快速靈敏的特點，可同時檢測大量樣品，與HPLC法和LC-MS法相比，具有靈敏度高、幹擾少、測定步驟簡便、快速、操作安全、設備投資少、測定結果準確可靠的優點。然而，對於FB這種毒性小分子，其抗體的製備周期長、生產成本高、技術難度大、批間差異大、克隆株(細胞)難以有效保存等難題，大大限制了酶聯免疫吸附法等免疫學檢測技術的快速發展。核酸適體(aptamer)作為一種特異性更好、親和力更高、品質均一、穩定性好的抗體替代品，在檢測分析領域中的應用已經被廣為認可，並具有開發周期短、生產成本低、使用方便的特點，因此，核酸適體在FB這種毒性小分子的快速檢測中具有良好的應用前景。
發明內容
本發明的目的在於提供一種採用新一代SELEX技術篩選得到的能夠與伏馬毒素 Bl高特異性和高親和力結合的結構轉換信號適體，並提供伏馬毒素Bl核酸適體在伏馬毒素Bl檢測分析和樣品分離富集中的應用方法，具有簡便、快速、經濟等特點，與其他組合化學庫如隨機肽庫、抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適體具許多優勢。本發明的技術方案一種伏馬毒素Bl核酸適體，其特徵在於它為核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCATCGCGAGGGGACGGGAACGCGCTGAAGGGAGGCCTAGGATCGTGTGA AGTGCTGTCCC或其互補的核苷酸序列所示的DNA分子。
所述伏馬毒素Bl核酸適體的衍生物具有相同功能用途。所述伏馬毒素Bl核酸適體的衍生物為核苷酸序列進行氨基化或巰基化或同位素化修飾。所述伏馬毒素Bl核酸適體的衍生物為核苷酸序列結合生物素或酶或地高辛或螢光物質或納米發光材料。一種伏馬毒素Bl核酸適體的應用，其特徵在於將伏馬毒素Bl核酸適體用於伏馬毒素Bl的檢測分析，它包括以下步驟(1)競爭板準備50 μ g/ml手臂分子氨基丙基三乙氧基矽烷或多聚賴氨酸 100 μ 1於4°C包被過夜，交聯劑次亞苯基二異硫氰酸鹽或戊二醛活化6h，200-2000pmol/ml NH2-引物100 μ 1偶聯，0. 2mol/L乙醇胺或甘氨酸封閉池，硼氫化鈉還原，BSA封閉，PBS 洗滌後備用；(2)檢測步驟①伏馬毒素Bl核酸適體5-10pmol，94°C 3min、冰上5min變性；②與O-IOOpmol靶標混勻，總體積100 μ 1，加入板中，室溫孵育30min ；③吸取50 μ 1加入螢光板中，加入1 200 OliGreen 100 μ 1，作用5min ；④測定螢光值(Ex:485nm, Em :525nm)。標準曲線通過6次重複試驗，以螢光數值為縱坐標，以標準濃度為橫坐標，做標準曲線。靈敏度計算通過6次重複試驗，檢測的標靶含量為Ong/ml 士 3*STDV。重複性標樣重複測定5次，計算其測定離散度CV值。回收率以玉米甲醇提取物稀釋50倍為樣品，加入低、中、高濃度標準，重複測定3 次，計算其回收率。FBl檢測試劑盒檢測靈敏度0. 02^g/ml，重複性CV < 6%以玉米勻漿甲醇提取物為樣品1 50稀釋，回收率見表
權利要求
1.一種伏馬毒素Bl核酸適體，其特徵在於它為核苷酸序列GCATCACTACAGTCATTACGCAT CGCGAGGGGACGGGAACGCGCTGAAGGGAGGCCTAGGATCGTGTGAAGTGCTGTCCC 或其互補的核苷酸序列所示的DNA分子。
2.根據權利要求1所述一種伏馬毒素Bl核酸適體，其特徵在於與所述伏馬毒素Bl核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列進行氨基化或巰基化或同位素化修飾。
3.根據權利要求1所述一種伏馬毒素Bl核酸適體，其特徵在於與所述伏馬毒素Bl核酸適體具有相同功能用途的衍生物為核苷酸序列結合生物素或酶或地高辛或螢光物質或納米發光材料。
4.一種權利要求1所述伏馬毒素Bl核酸適體的應用，其特徵在於用於伏馬毒素Bl的檢測分析。
5.一種權利要求1所述伏馬毒素Bl核酸適體的應用，其特徵在於用於從樣品中分離、 富集伏馬毒素Bi。
6.一種權利要求2或3所述伏馬毒素Bl核酸適體衍生物的應用，其特徵在於應用於伏馬毒素Bl檢測分析和分離富集中。
全文摘要
本發明涉及一種與伏馬毒素B1高特異性和高親和力結合的核酸適體及其應用，該核酸適體可以用於伏馬毒素B1的檢測分析和分離富集，具有特異性好、親和力高、品質均一、穩定性好、開發周期短、生產成本低、使用方便的特點。本發明還涉及所述核酸適體序列的衍生序列，包括修飾後的序列。
文檔編號G01N21/64GK102517291SQ20111038035
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月25日 優先權日2011年11月25日
發明者吳淑慶, 張良, 楊在明 申請人:國家納米技術與工程研究院