一種建立菊花腦高效再生體系的方法

2023-04-28 08:58:11

專利名稱：一種建立菊花腦高效再生體系的方法
技術領域：
本發明屬於菊花生物技術育種領域，涉及一種建立菊花腦高效再生體系的方法。
背景技術：
菊花腦(Chrysanthemum nankingense)又名菊花菜、菊花葉,為菊科菊屬多年生宿根草本植物，為栽培菊花近緣種植物，原產於中國，上海、江蘇、吉林、湖南、廣東等省有野生種，我國南北各地均有少量栽培。菊花腦是一種很有特色的傳統野生蔬菜，其嫩莖和葉不僅營養豐富，還具有消暑清熱、調中健脾、降壓開胃等保健功效，現已成為南京地區的特色菜
之一 O菊花是中國十大名花和世界四大切花之一，由於其起源複雜，染色體組成多樣，對其重要觀賞性狀形成機理進行研究解析是極為困難的。菊花腦為栽培菊花起源中參與起源且遺傳背景比較簡單的菊屬野生植物，本課題組希望利用遺傳背景相對簡單的二倍體菊花腦開展基礎生物學研究，來更好的解析菊花中複雜的生物學現象，並以此展開品種改良研究，推動菊花新品種的選育。目前關於菊花腦的組織培養已有報導，但外植體材料多採用葉盤、葉柄和莖等器官，以菊花腦花蕾為外植體進行組織培養和快速繁殖至今未見報導。而且以葉、莖等器官為外植體進行組織培養時，存在愈傷組織易褐化，不定芽分化困難等問題，因此，系統深入研究其再生能力及獲得再生植株，建立專門針對菊花腦的穩定高效的再生體系，可為菊花的進化研究、基因工程和轉基因育種工作提供理論基礎和試驗依據，將有效推進高等植物生物技術育種進程。

發明內容
技術問題 本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種建立菊花腦高效再生體系的方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現:一種建立菊花腦高效再生體系的方法，包括如下步驟:A.花蕾的選擇及消毒:選擇菊花腦幼嫩花蕾，對花蕾進行消毒；B.再生體系的建立取上述消毒後的菊花腦花蕾，接種於分化培養基進行不定芽的分化，待不定芽長至I 2cm時，轉入1/2MS生根培養基中進行生根培養，獲得完整植株；其中所述的分化培養基為含有細胞分裂素6-BA或激動素KT和類生長素NAA Ca-萘乙酸，下同)的MS培養基，MS培養基中含蔗糖30g.L-1、瓊脂7g.L-1，pH為5.8,6-BA終濃度為1.0或2.0mg.L-1，KT終濃度為1.0或2.0mg.ΙΛ NAA終濃度為ΝΑΑ0.25或0.50mg.Γ1 ;其中培養條件均為:培養室溫度:25±2°C;溼度:50% 70% ;光照周期:16h.cf1 ;光照強度:32 36 μ mo 1.JiT2S'步驟A中選擇的花蕾優選直徑為3mm，不帶花柄的菊花腦幼嫩花蕾。
步驟A中所述的消毒優選於秋末採取菊花腦幼嫩花蕾，經清水衝洗，在無菌條件下先用75%乙醇浸泡,再用0.1%升汞消毒,最後用無菌水衝洗5次，無菌水的衝洗時間依次為 3min, 4min, 5min, 4min, 3min。所述的進行不定芽的分化培養時間至少30天。所述的分化培養基優選MS+細胞分裂素6-BA1.0mg.Γ'+ΝΑΑΟ.5mg.Γ1+蔗糖30g.Γ1+瓊脂7g.ΙΛ即以MS為基礎培養基，添加細胞分裂素6-BA1.0mg.L'NAA0.5mg.L'鹿糖 30g.I71 及瓊脂 7g.L'有益效果(I)本發明首次針對菊花腦花蕾的再生能力進行了系統深入的研究，不僅為菊花腦的基因工程和轉基因育種提供了基本方法，也為菊花腦的規模化生產提供了參考。(2)在再生體系建立中，將花蕾按大小、是否帶花柄進行分類，觀察不同類型花蕾的愈傷生長和再生情況，篩選出最適合培養的花蕾類型(不帶花柄，直徑為3mm的幼嫩花蕾)；將三種激素(細胞分裂素6-BA和KT、類生長素NAA)搭配組合，篩選出最適誘導分化培養基(MS+細胞分裂素6-BA1.0mg.L—1+類生長素NAA0.5mg.L—1)，此處理的出芽率達79.63%，平均芽數達4.72，再生苗為綠色，生長狀態良好；不定芽生根培養基以不加激素的1/2MS生根培養基生根效果最優，且生根率為100%。


圖1菊花腦不同類型花蕾再生圖a:無花柄,直徑3mm; b:有花柄,直徑3mm; c:無花柄,直徑5mm; d:有花柄,直徑5mm圖2菊花腦不同激素濃度配比條件下花蕾再生圖A:6-BA/NAA=1.0/0.25;B:6-BA/NAA=1.0/0.50;C:6-BA/NAA=2.0/0.25;D:6-BA/NAA=2.0/0.50;E:KT/NAA=1.0/0.25;F:KT/NAA=1.0/0.50;G:KT/NAA=2.0/0.25 ;H:KT/NAA=2.0/0.50;圖3菊花腦單個花蕾再生過程(標尺為3_)圖4菊花腦不定芽在添加激素和不加激素條件下生根情況A1-A2:在添加激素條件下(類生長素NAA=0.1mg.Γ1)不定芽的生根B1-B2:不加激素條件下不定芽的生根
具體實施例方式實施例1(1)花蕾的選擇及消毒將花蕾按是否帶花柄、直徑大小分為a (直徑為3mm，不帶花柄)、b (直徑為3mm，帶花柄)、c (直徑為5mm，不帶花柄)、d (直徑為5mm，帶花柄)四種類型，以上述4中幼嫩花蕾為供試材料，經清水衝洗10 20min，濾紙吸乾水分，在超淨工作檯上先用體積百分比為75%的乙醇浸泡30s，再用質量百分比為0.1%的升汞溶液消毒8min，最後用無菌水衝洗5次，無菌水的衝洗時間依次為3min, 4min, 5min, 4min, 3min ；接種於含細胞分裂素6-BA為2.0mg.Γ1和NAA為0.5mg.Γ1的MS培養基(含蔗糖SOg.L-1、瓊脂7g.Γ1, pH為5.8)中，每個處理I盤，每盤接種10個花蕾，在相同的培養條件下重複3次，觀察並記錄不同類型花蕾分化不定芽的情況，30d後統計再生率和平均芽數；培養基中含蔗糖3%、瓊脂0.7%，pH為5.8 ;觀察可見:花蕾接種培養7d後開始膨大，表面的花萼增厚突起，15d後將花蕾繼代到相同培養基中，花蕾繼續膨大，a、c類花蕾在其底部形成少量黃白色愈傷組織，b、d類花蕾的花柄增大增厚，在花蕾底部和花柄處形成較多黃白色愈傷組織。繼代後3 5天，陸續觀察到綠色芽點突起，經I 2次繼代培養，綠色芽點形成不定芽。花蕾是否帶花柄和其直徑大小對不定芽再生率影響很大，當花蕾直徑大小一定時，a、c類花蕾的不定芽再生率(分別為47.22%、18.28%)要遠高於b、d類花蕾的不定芽再生率(分別為24.19%、9.14%)，說明不帶花柄的花蕾有利於不定芽的發生和增殖；當花蕾均帶花柄或均不帶花柄時，a、b類花蕾的不定芽再生率(分別為47.22%,24.19%)要遠高於c、d類花蕾的不定芽再生率(分別為18.28%,9.14%)，說明直徑較小的花蕾有利於不定芽的發生和增殖。最終確定直徑為3_，不帶花柄的a類花蕾誘導分化效果最好，再生率達47.22%，平均芽數達 3.37 (表1、圖1)。不定芽再生率(％)=再生不定芽的外植體總數/接種外植體總數X 100%平均芽數=外植體再生不定芽總數/再生不定芽的外植體總數(2)最佳誘導分化培養基的篩選將a類花蕾分別接種於含有細胞分裂素6-BA (1.0或2.0mg.Γ1)和NAA (0.25或0.50mg.L-1)的MS培養基(含蔗糖30g.L-1、瓊脂7g.L—1，pH為5.8)或含有KT (1.0或
2.0mg.L-1)和 NAA (0.25 或 0.50mg.L-1)的 MS 培養基(含蔗糖 30g.L-1、瓊脂 7g.L-1，pH為5.8)中，花蕾接種培養7d後開始膨大，表面的花萼增厚突起，15d後將花蕾繼代到相同培養基中，花蕾繼續膨大，有的綻開露出內部管狀花，在花蕾底部可觀察到少量黃色愈傷組織。繼代後3 5天，陸續觀察到綠色芽點突起，經I 2次繼代培養，綠色芽點形成不定芽，不定芽大多從花蕾側面或花託處長出，說明花蕾遠離培養基的部分難以分化。細胞分裂素6-BA、KT和NAA不同濃度配比對花蕾不定芽再生影響很大，當6-BA或KT濃度一定時，再生率隨NAA濃度的增加而升高，說明在一定範圍內，高濃度的NAA有利於不定芽的發生與增殖；當NAA濃度一定時，再生率隨6-BA濃度的增加而降低，隨KT濃度的增加而升高，說明在一定範圍內，低濃度的6-BA和高濃度的KT有利於不定芽的發生與增殖。細胞分裂素6-BA和KT對不定芽的生長狀態影響很大，用6-BA誘導分化出的不定芽一般為綠色或淡綠色，節間短，叢生芽多；用KT誘導分化出的不定芽一般為黃綠色或玻璃化苗，節間長，叢生芽少。最終確定MS+細胞分裂素6-BA1.0mg.I71+生長素ΝΑΑ0.5mg.L-1的誘導效果最好,再生率達79.63%，平均芽數達4.72，再生苗為綠色(表2、圖2、圖3)。(3)不定芽生根情況待不定芽長至I 2cm時，轉入1/2MS生根培養基中進行生根培養，獲得完整植株。觀察生根情況，比較發現，在添加激素和不加激素的條件下，不定芽生根率均為100%，但在添加NAA (濃度為0.1mg噸―1)的條件下，植株根較粗短，根毛濃密，但根數較少，植株低矮；在不加激素的條件下，植株根較細長，根毛不濃密，但根數較多，植株生長健壯(圖4)。生根率(％)=不定芽生根數/接種不定芽總數X 100%表I花蕾類型對菊花腦花蕾再生的影響
權利要求
1.一種建立菊花腦高效再生體系的方法，其特徵在於包括如下步驟: A.花蕾的選擇及消毒:選擇菊花腦幼嫩花蕾，對花蕾進行消毒； B.再生體系的建立 取上述消毒後的菊花腦花蕾，接種於分化培養基進行不定芽的分化，待不定芽長至I 2cm時，轉入1/2MS生根培養基中進行生根培養，獲得完整植株；其中所述的分化培養基為含有細胞分裂素6-BA或KT和NAA的MS培養基，MS培養基中含蔗糖30g.I/1，瓊脂7g.ΙΛ pH 為 5.8，6-BA 終濃度為 1.0 或 2.0mg. Λ KT 終濃度為 1.0 或 2.0mg.L' NAA 終濃度為0.25或0.50mg.Γ1 ;其中培養條件均為:培養室溫度:25±2°C ;溼度:50% 70% ；光照周期:16h.(Γ1 ;光照強度:32 36 μ mo I.nT2s'
2.根據權利要求1所述的一種建立菊花腦高效再生體系的方法，其特徵在於步驟A中選擇的花蕾為直徑為3mm，不帶花柄的菊花腦幼嫩花蕾。
3.根據權利要求1所述的一種建立菊花腦高效再生體系的方法，其特徵在於步驟A中所述的消毒是於秋末採取菊花腦幼嫩花蕾，經清水衝洗，在無菌條件下先用75%乙醇浸泡，再用0.1%升汞消毒，最後用無菌水衝洗5次，無菌水的衝洗時間依次為3min，4min，5min，4min，3min。
4.根據權利要求1所述的一種建立菊花腦高效再生體系的方法，其特徵在於所述的進行不定芽的分化培養時間至少30天。
5.根據權利要求1所述的一種建立菊花腦高效再生體系的方法，其特徵在於所述的分化培養基為MS+細 胞分裂素6-BA1.0mg.Γ'+ΝΑΑΟ.5mg.Γ1+蔗糖30g.Γ1+瓊脂7g.L'
全文摘要
本發明涉及一種建立菊花腦高效再生體系的方法，屬於生物技術育種領域。以菊花腦幼嫩無菌花蕾為外植體，根據三種激素的組合設計出八種培養基，進行最適分化培養基的篩選。經過1～2次的繼代培養，花蕾直接分化出再生苗，而後轉入生根培養基中進行生根培養，獲得完整植株。本發明首次以菊花腦花蕾建立了其高頻再生體系，為菊花腦生物技術育種工作提供了理論基礎和實驗依據，將有效推動其近緣種菊花的生物技術育種進程。
文檔編號A01H4/00GK103141393SQ20131009144
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月21日 優先權日2013年3月21日
發明者蔣甲福, 程越, 陳發棣, 房偉民, 陳素梅, 管志勇, 滕年軍, 趙爽, 廖園 申請人:南京農業大學